CC BY
79
А. В. Тютюгина, О. В. Андреева, Ф. Р. Гариева
ИССЛЕДОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ИЗОСТЕВИОЛА С ГИДРАЗИДОМ ИЗОНИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ. СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И АНТИТУБЕРКУЛЕЗНАЯ АКТИВНОСТЬ
Ключевые слова: дитерпеноид, изостевиол, изониазид.
Синтезированы гибридные соединения природного дитерпеноида изостевиола с противотуберкулезным препаратом изониазидом (гидразид изоникотиновой кислоты). Изучена их структура в растворе. Установлено, что они ингибируют рост Micobacterium tuberculosis (штамм H37RV in vitro) при минимальной ингибирующей концентрации 20 мкг/мл.
Keywords: diterpenoid, isosteviol, isoniazid.
Hybrid compounds derived from natural diterpenoid isosteviol and antitubercular drug isoniazid (isonicotinic acid hydrazide) were synthesized, and their structure in solution was studied. The newly synthesized compounds were found to inhibit Micobacterium tuberculosis (H37RVstrain) in vitro, the minimal inhibitory concentration being 20mg/ml.
Введение
Сегодня, наряду со СПИДом, самой распространенной инфекцией- убийцей является туберкулез. Известно большое количество антитуберкулезных препаратов. Изониазид, представляющий собой гидразид изоникотиновой кислоты, признан лучшим по многим показателям и входит в состав практически всех схем профилактики и лечения туберкулеза. Однако изониазид токсичен (ЛД50 = 178 мг/кг). Поэтому с целью снижения общей токсичности мы предлагаем присоединить изониазид к энтбейерановому каркасу изостевиола и его эфиру. Дитерпеноид изостевиол (I) - основной продукт кислотного гидролиза гликозидов растения Stevia rebaudiana Bertoni. Он проявляет антигипертензивный и гипотензивный эффекты [1],ингибирует окислительное
фосфорилирование, снижает АТФ-активность некоторых фосфатаз, оксидаз и дегидрогеназ [2]. Недавно было установлено, что изостевиол (I) ингибирует рост Micobacterium tuberculosis (штамм H37Rv in vitro) при минимальной ингибирующей концентрации 50 мкг/мл [3].
Экспериментальная часть
Реакции изостевиола (I) и его метилового эфира (III) с гидразидом изоникатиновой кислоты проводили в безводном метаноле в присутствии пара-толуолсульфокислоты (p-TsOH). Гибридные соединения (IV, V) были получены с выходами 75-85%. Гибридное соединение (VI) изостевиола с двумя молекулами изониазида было синтезировано в две стадии. Сначала реакцией хлорангидрида изостевиола (II) с избытком изониазида в пиридине при нагревании был получен продукт замещения по хлорангидридной группе. На второй стадии он был вовлечен в реакцию с избытком изониазида в кипящем метаноле в присутствии p-TsOH, в результате чего с выходом 55% было получено соединение (VI).
На образование соединений (IV, V) указывает исчезновение в ИК-спектрах полосы 1740 см-1, соответствующей валентным колебаниям
кетонной группы изостевиола (I) и появление полос валентных колебаний связей 0=Ы и амидных групп (1540-1550, 1620-1670 см -1), а также связи КН (3200-3500 см -1).
Спектры ЯМР Н соединений (IV-VI) аналогичны в области резонанса протонов изостевиольного каркаса (0.7- 3.0 м. д.); протоны пиридиновых колец резонируют в области 7.7-8.7 м. д., протоны гидразонного фрагмента - при 10.5 м. д. В случае соединения (VI) сигналы протонов групп C5H4NCONH проявляются при 10.50 и 10.53 м. д., а группы C19ONH - при 9.34 м. д. ИК спектры записаны на спектрофотометре UR-20 в интервале 400-3600 см-1 и на Фурье-спектрометре Vector 22 фирмы Bruker в интервале 400-4000 см-1. Данные представлены в табл.1.
Таблица 1 - Характеристические полосы
поглощения в ИК-спектрах соединений (IV-VI)
№ v ,см 4
Амид I C=N Амид II 5 (NH) С=О СООСНз NH
IV V VI 1641 1650 1664 1640 1656 1651 1667 1542 1544 1552 1714 1721 3478, 3182 3201 3482, 3351, 3234
1
Спектры ЯМР Н получены на приборах Avance 600 и Bruker MSL-400. Контроль за ходом реакций осуществлялся методом тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol". Элюент -петролейный эфир:этилацетат =1:1. Проявитель -йод. Масс-спектры получены на приборе МХ-1310 при ионизирующем напряжении 60 эВ, токе коллектора электронов 30 мкА, с использованием системы прямого ввода вещества в источник ионов при температуре 120°С. Прогрев ампулы-испарителя был осуществлен в интервале 120-250 °С. Точные значения масс ионов определены методом совмещения по реперным пикам перфторкеросина. Масс-спектры матричноактивированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) получены на времяпролетном масс-спектрометре Finnigan MALDI TOF Dynamo (США) [4]. Антитуберкулезная активность соединений (IV-X) была изучена на приборе ВАСТЕС MGIT 960. Использовали питательную среду Мидлбрук 7 Н9 с обогатительной добавкой ВАСТЕС MGIT OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза). Опыты проводили методом серийных разбавлений на штамме М. tuberculosis H37RV. Культуру лабораторного штамма взвешивали на торсионных весах и навеску в количестве 10 мг помещали в фарфоровую ступку, тщательно растирали и готовили суспензию культуры по бактериальному стандарту мутности 100 млн микробных тел в миллилитре (10 ед.). Полученную суспензию в количестве 0.1 мл засевали в пробирки, содержащие питательную среду и 5.0 мл раствора исследуемого соединения (для каждого разведения) и инкубировали в термостате прибора при 37°С. Наличие роста микобактерий или отсутствие такового прибор регистрировал ежедневно в течение 11 сут. Минимальную ингибирующую концентрацию определяли как наименьшую концентрацию, при которой рост М. Tuberculosis задерживался на сутки по сравнению с изониазидом.
В результате изучения антитуберкулезной активности синтезированных гибридных соединений в отношении штамма H37RV (in vitro) было установлено, что полученные соединения (IV, V, VI) ингибируют рост М. tuberculosis при минимальной ингибирующей концентрации 20
мкг/мл. Таким образом, ковалентное связывание дитерпеноида изостевиола (I) с
противотуберкулезным препаратом изониазидом снизило значение минимальной ингибирующей концентрации с 50 до 20 мкг/мл.
Общая методика получения соединений (1У-У1). Изостевиол (I) или метиловый эфир изостевиола (III) и полуторакратный избыток гидразида пиридинкарбоновой кислоты растворяли в абсолютном метаноле. Добавляли каталитическое количество пара-толуолсульфокислоты.
Реакционную смесь кипятили 6 ч. Метанол отгоняли при пониженном давлении. Остаток промывали водой и перекристаллизовывали из метанола.
16-[№-(Пиридин-4 '-илкарбонил)гидразоно]-энт-бейеран-19-овая кислота (IV). Выход 0.23 г (85%), т. пл. 315-328°С (МеОН). ИК спектр, V, см -1: 1542 (амид II), 1650, 1664 (амид I), 1714 (С16=0), 3478; 3182 (К1Н). Спектр ЯМР 'Н, 5, м. д.: 0.79 с (ЗН, Н20), 1.08 с (ЗН, Н17), 1.12 с (ЗН, Н18), 2.02 д (1Н, Н3, J 13.7 Гц), 3.02 д. д (1Н, Н15а, J 18.44, 1.3 Гц); 7.68 д (2Н, Н2, Н6, J 5.8 Гц), 8.72 д (2Н, Н3, Н5, I 5.8 Гц), 10.50 с (1Н, ^Н). Масс-спектр МАЪБ! m/z 460 [M+Na]+. Найдено, %: С 70.58, Н 8.01. N 9.07. 026Н35Ы303. Вычислено, %: С 71.3, Н 8.0, N 9.6.
Метил-16-[К -(Пиридин-4'-
илкарбонил)гидразоно]-энт-бейеран-19-оат (V). Выход 0.23 г (85%), т. пл. 275-282°С (МеОН). ИК спектр, V, см -1: 1552 (амид II), 1651, 1667 (амид I), 3200-3500 (ЫН). Спектр ЯМР 'Н, 5, м. д.: 0.67 с (ЗН, Н20), 1.08 с (ЗН, Н17), 1.13 с (ЗН, Н18), 2.05 д (1Н, Н3 , J 13.3 Гц), 2.98 д. д (1Н, Н , J 18.44, 1.3 Гц), 3.55 с 3ЗН, Н 21), 7.68 д (2Н, Н2, Н6, J5.5 Гц), 8.72 д (2Н, Н , Н5, J 5.5 Гц), 10.48 с (1Н, Ы'Н). Масс-спектр МАЬБ! т/г 451 [М]+. Найдено, %; С 71.72; Н 7.64; N 9.21. 027Н37Ы303. Вычислено, %: С 72.0; Н 8.0; N 9.0. К- {19-Оксо-16-[№-(пиридин-4'-
илкарбонил)гидразоно]-энт-бейеран-19-ил}пиридин-4'-карбогидразид (VI). К раствору 0.18 г (0.53 ммоль) изостевиола (I) в 10 мл абсолютного пиридина прибавляли 0.15 г (1.09 ммоль) гидразида 4-пиридинкарбоновой кислоты. Реакционную смесь нагревали 12 ч при температуре бани 80°С. Пиридин отгоняли при пониженном давлении. Остаток растворяли в абсолютном метаноле, прибавляли 0.037 г (0.27 ммоль) гидразида 4-
пиридинкарбоновой кислоты и 0.02 г (0.12 ммоль) пара-толуолсульфокислоты, смесь кипятили 6 ч. Затем метанол отгоняли, остаток промывали водой, перекристаллизовывали из этанола. Выход 0.08 г (55%), т. пл. 189-192°С (ЕЮН). ИК спектр, V, см -1: 1552 (амид II), 1651, 1667 (амид I), 3200-3500 ^Н). Спектр ЯМР 1Н, 5, м. д.: 0.86 с (ЗН, Н20).' 1.08 с (ЗН, Н17), 1.19 с (ЗН, Н18), 2.23 д (1Н, Н3, I, 13.9 Гц,), 3.06 д. д (1Н, Н , J 18.44, 1.3 Гц), 7.67 д (2Н, Н2 Н6, J 5.4 Гц), 7.75 д (2Н, Н2 , Н6 , J 5.4 Гц), 8.70 д (2Н, Н3, Н5, J 5.4 Гц), 8.74 д (2Н, Н3", Н5 , J 5.4 Гц), 9.34 с (1Н, ^Н), 10.43 с (1Н, ^Н), 10.53 (1Н, с, К2Н). Масс-спектр МАЬБ! т/г 556 [М]+. Найдено, %: С 65.10; Н 7.62; N 13.64. С32Н40К603. Вычислено, %: С 61.0; Н 6.7; N 13.4.
Литература
1 Mosettig Е., Nes W.R. // J. Org.Chem. 1955. Vol. 20. N. 7. P. 884.
2 Kelmer Bracht A., Alvarez M., Bracht A. // Pharmacol. Biochem. 1985. Vol. 34. N 6. P. 873.
3 Катаев В.Е., Милицина О.И., Стробыкина И.Ю.,
Ковътяева Г.И., Мусин Р. 3., Федорова О.В., Русинов Г.Л., Зуева М.Н., Мордовской Г.Г., Толстиков А.Г. // Хим.-фарм. ж. 2006. Т. 40. № 9. С. 12.
4 ВМ. Бабаев. Масс-спектрометрия изопреноидов./ В.М. Бабаев, Р.З. Мусин, В.И. Гаврилов. // Вестник Казан, технол. ун-та.- 2011.- Т. 14, №4.-С.12-17.
© А. В. Тютюгина - магистрант каф. технологии основного органического и нефтехимического синтеза КНИТУ; О. В. Андреева - канд. хим. наук, науч. сотр. лаб. фосфорсодержащих аналогов природных соединений Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН andreeva@iopc. ги; Ф. Р. Гариева - проф. каф. технологии основного органического и нефтехимического синтеза КНИТУ, garievafr@mail.ru.
