CC BY
13ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оригинальное исследование DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-316
Исследование противовирусной активности водорастворимого меланина из аптечной чаги (Inonotus obliquus) в отношении вируса гриппа A субтипов H5N1, H3N2 и H1N1pdm09 в экспериментах in vitro
Филиппова Е.И., Макаревич Е.В., Проценко М.А.И, Мазурков О.Ю., Теплякова Т.В., Мазуркова Н.А.
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Россия
Аннотация
Актуальность. Вирус гриппа А является причиной возникновения эпидемий и пандемий, наносящих колоссальный вред здоровью и социально-экономическому положению населения. В связи с необходимостью разработки новых методов этиотропной терапии, а также с возрастающей способностью вирусов противодействовать применяемым препаратам поиск новых фармакологически активных веществ и последующее изучение их лекарственных свойств обладает неоспоримой актуальностью. Цель — изучение противовирусных свойств меланина, полученного из аптечной чаги (Inonotus obliquus), в отношении разных субтипов вируса гриппа.
Материалы и методы. Образец водорастворимого меланина Inonotus obliquus, полученный методом щелочного гидролиза и высушенный при 40°С, был исследован на токсичность и противовирусную активность. В качестве референс-препарата использован коммерческий противогриппозный препарат Та-мифлю®. Статистическая обработка полученных данных проведена по методу Спирмена-Кербера. Результаты. Для культуры клеток MDCK были установлены маркеры токсичности меланина из чаги (образец 20-24), такие как максимально переносимая концентрация, составляющая 237 мкг/мл, а также 50% цитотоксическая концентрация (ЦТД50), равная 153,45 мкг/мл. Под действием исследуемого образца в отношении субтипов вируса гриппа А H5N1, H3N2 и H1N1pdm09 обнаружено снижение инфекционности вируса гриппа на 2,5-3,5 lg, а также установлены 50% эффективные дозы (ЭД50), составляющие 1,559,52 мкг/мл. На основании полученных значений ЦТД50 и ЭД50 были рассчитаны химиотерапевтические индексы образца, характеризующие его перспективность для дальнейших исследований. Заключение. Меланин, полученный из аптечной чаги, проявил наибольшую активность против штамма пандемического вируса гриппа человека A/California/04/2009 (H1N1)pdm09, вызывал снижение его инфекционности на 3,5 lg и обладал ЭД50, равной 1,6 мкг/мл. Полученные результаты указывают на перспективность создания противовирусного препарата на основе меланинов из чаги в отношении вируса гриппа.
Ключевые слова: меланин, агарикомицеты, противовирусное средство, вирус гриппа А
Источник финансирования. Статья подготовлена в рамках выполнения государственного задания ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Для цитирования: Филиппова Е.И., Макаревич Е.В., Проценко М.А., Мазурков О.Ю., Теплякова Т.В., Мазуркова Н.А. Исследование противовирусной активности водорастворимого меланина из аптечной чаги (Inonotus obliquus) в отношении вируса гриппа A субтипов H5N1, H3N2 и H1N1pdm09 в экспериментах in vitro. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2023;100(1):103-109. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-316
© Коллектив авторов, 2023
ORIGINAL RESEARCHES
Original Study Article
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-316
Research on the antiviral activity of water-soluble melanin from the pharmaceutical chaga mushroom (Inonotus obliquus) against influenza А virus subtypes H5N1, H3N2 and H1N1pdm09 in experiments in vitro
Ekaterina I. Filippova, Elena V. Makarevich, Maria A. Protsenko^, Oleg Yu. Mazurkov, Tamara V. Teplyakova, Natalya A. Mazurkova
State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector'; Koltsovo, Russia Abstract
Introduction. Influenza A virus is the cause of epidemics and pandemics that severely affect the health and socioeconomic status of the world's population. The need to develop new methods of etiotropic therapy, and the increasing ability of viruses to counteract the antiviral drugs makes extremely relevant the search for new pharmacologically active substances and the subsequent study of their medicinal properties. The aim of the study is to conduct research into the antiviral properties of melanin obtained from the pharmaceutical chaga mushroom in relation to different subtypes of the influenza A virus.
Materials and methods. A sample of water-soluble melanin from Inonotus obliquus obtained by alkaline hydrolysis and dried at 40°C was tested for toxicity and antiviral activity. The commercial anti-influenza drug Tamiflu® was used as a reference drug. Statistical processing of the obtained data was carried out according to the Spearman-Kerber method.
Results. Inonotus obliquus melanin (sample 20-24) toxicity markers, such as a maximum tolerable concentration (MTC) of 237.0 pg/mL, and a 50% cytotoxic concentration (CC50) of 153,45 pg/mL were established for MDCK cell culture. The assessment of antiviral activity of test sample against three subtypes of the influenza A virus (H5N1, H3N2 and H1N1pdm09) demonstrated a decrease in the infectivity of the influenza virus by 2.5-3.5 lg with 50% virus-inhibiting concentrations (IC50) of 1.55-9.52 pg/mL. Based on the obtained values of CC50 and IC50, the selectivity indices (SI) of the sample were calculated, characterizing its prospects for further research. Conclusions. Melanin obtained from the pharmaceutical chaga mushroom showed the highest activity against the strain of the human pandemic influenza virus A/California/04/2009 (H1N1)pdm09, caused a decrease in its infectivity by 3.5 lg and had an IC50 of 1.6 pg/ml. The obtained results indicate the prospects for creating an antiviral drug based on Inonotus obliquus melanins against the influenza virus.
Keywords: melanins, agaricales, antiviral agents, influenza A virus
Funding source. The article was prepared as part of the state task of the State Research Center for Virology and Biotechnology "Vector".
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
For citation: Filippova E.I., Makarevich E.V., Protsenko M.A., Mazurkov O.Yu., Teplyakova T.V., Mazurkova N.A. Research on the antiviral activity of water-soluble melanin from the pharmaceutical chaga mushroom (Inonotus obliquus) against influenza A virus subtypes H5N1, H3N2 and H1N1pdm09 in experiments in vitro. Journal of microbiology, epidemiology andimmunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2023;100(1):103-109. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-316
Введение
Широкое разнообразие зоонозных вирусов, способных преодолевать межвидовой барьер, ведёт к появлению в человеческой популяции новых, потенциально пандемических вирусов. За последние 10 лет человечество столкнулось с двумя пандемиями: гриппа свиного происхождения А/H1N1pdm09 в 2009 г. и СОУГО-19 в 2019 г. Совместно с вирусами, имеющими пандемическое значение, циркулирует множество сезонных респираторных вирусов, которые вносят свой вклад в структуру заболеваемости людей, а сочетанные инфекции отягчают состояние заболевших [1].
Вирус гриппа характеризуется активной сезонной циркуляцией, затрагивающей большую часть населения Земли (до 1 млрд случаев гриппа ежегодно), группы риска — дети раннего возраста, пожилые люди, лица с сопутствующими хроническими заболеваниями и ослабленным иммунитетом [2]. Высокий уровень генетической изменчивости вирусов гриппа обусловливает отсутствие 100% эффективной вакцины, а также возникновение резистентности штаммов вируса к имеющимся противовирусным препаратам [3].
В настоящее время в мире активно проводятся поиск и разработка противовирусных препаратов
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
на основе соединений природного происхождения, обладающих более мягким терапевтическим действием и низкой токсичностью по сравнению с синтетическими лекарственными средствами. В этом отношении базидиальные грибы представляют значительный интерес как источники лечебных и профилактических средств с противоопухолевой, иммуностимулирующей и противовирусной активностью.
С 2008 г. в ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» проводятся изучение противовирусной активности плодовых тел грибов Юго-Западной Сибири и выделение их в чистую культуру. На основе скрининга полисахаридов и меланина из грибов, самый широкий спектр противовирусной активности обнаружен у чаги (Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilat; трутовик скошенный) [4, 5].
Известна высокая протективная активность образцов меланинов из чаги in vitro в отношении вируса гриппа субтипа H1N1pdm09, вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2), вируса Западного Нила, вируса натуральной оспы и вируса оспо-вакцины [6].
Показана высокая противовирусная активность в отношении SARS-CoV-2 водных экстрактов чаги, содержащих меланин и гуминовые вещества. Данные экстракты обладали низкой токсичностью, 50% эффективной дозой (ЭД50) 0,75 мкг/мл, высоким хи-миотерапевтическим индексом (ХТИ) — 155,5 [7].
Водные экстракты, полученные из склероция чаги, ингибировали инфекционность штаммов вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Moscow/226/2009(H1N1)pdm09 с индексами нейтрализации 4,7 и 3,2 lg соответственно. Противогриппозное действие данных образцов было сопоставимо с активностью препарата Тамифлю® [6].
Целью настоящего исследования является изучение противогриппозных свойств меланина, полученного из аптечной чаги. Задачи исследования: получение водорастворимого меланина, определение токсичности полученного образца, тестирование способности меланина подавлять инфекцион-ность вируса гриппа, определение 50% токсических и 50% ингибирующих вирус гриппа концентраций образцов.
Материалы и методы
Культура клеток
Для определения токсичности и противовирусной активности грибных меланинов использовали перевиваемую линию клеток MDCK, полученную из коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор». Клетки выращивали в среде DMEM (ООО «Био-лот») в присутствии 10% инактивированной сыворотки крови плодов коровы (ООО «Биолот») и антибиотиков (пенициллин 100 МЕ/мл, стрепто-
мицин 100 мкг/мл). Клеточную суспензию вносили в 96-луночные планшеты по 100 мкл в лунку в концентрации 1,0-1,5 х 105 клеток/мл. Планшеты с клетками помещали в термостат при 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 2-3 сут до образования клеточного монослоя.
Вирусы
В работе использовали штаммы вируса гриппа А: штамм вируса гриппа птиц A/chicken/ Kurgan/05/2005 (H5N1) с инфекционным титром 7,25 ± 0,49 lg ТЦД50/мл; штамм адаптированного к лабораторным мышам вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) с инфекционным титром 4,50 ± 0,69 lg ТЦД50/мл; штамм пандемического вируса гриппа человека A/California/04/2009 (H1N1)pdm09 с инфекционным титром 5,00 ± 0,57 lg ТЦД50/мл. Все используемые штаммы получены из Государственной коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор».
Концентрацию вируса каждого субтипа определяли путём титрования в культуре клеток MDCK при культивировании в течение 3 сут в термостате при 37°C, 5% СО2 и 100% влажности. Титры вируса рассчитывали по методу Спирмена-Кербера, выражали в десятичных логарифмах 50% тканевых ци-топатических доз в 1 мл (lg ТЦД50/мл) и представляли в виде М ± I95 для (где M — среднее значение, I95 — 95% доверительный интервал) и сравнивали по методу Спирмена-Кербера с помощью пакета компьютерных программ «Statistica 6.0» [8, 9].
Исследуемые образцы
Для получения водорастворимого меланина из аптечной чаги (образец 20-24) к 5 г сухого измельчённого (до 1 мм) природного сырья чаги добавляли 100 мл 2% NaOH и выдерживали в автоклаве 30 мин при избыточном давлении 0,7 атм. Далее полученный раствор фильтровали через капроновый и бумажный фильтры. Меланин осаждали концентрированной соляной кислотой и центрифугировали (центрифуга «Centra CL3») 20 мин при 4000 об/ мин. Далее проводили 3-кратное переосаждение 1Н соляной кислотой и трижды промывали осадок дистиллированной водой (1 : 10). Полученный препарат не растворяется в воде, но хорошо растворяется в щелочах. Водорастворимую форму меланина получали путём растворения полученного пигмента в 10% водном растворе аммиака (значение рН от 7 до 8) с последующим мягким выпариванием остаточного аммиака и воды до сухого состояния при температуре воздушного потока 30°С. Полученный препарат полностью растворим в воде. Для проведения экспериментов по изучению токсичности и противовирусной активности сухой меланин был растворён в дистиллированной воде до концентрации 2 мг/мл.
В качестве референс-препарата использовали Тамифлю® («Hoffmann-La Roche Ltd.»).
ORIGINAL RESEARCHES
Определение максимально переносимых концентраций образцов и изучение их способности подавлять инфекционность вируса гриппа in vitro
При определении токсических концентраций меланина из чаги исходную концентрацию образца (800 мкг/мл) разводили в 1,5; 2,3; 3,4; 5,0; 7,6; 11,4; 17,1; 25,6; 38,5; 57,5; 86,5; 129,7 раза (с шагом 1,5) средой DMEM, вносили по 100 мкл разведений меланина в лунки 96-луночного планшета с клеточным монослоем (по 4 лунки на каждое разведение образца) и убирали в термостат на 2 сут при 37°C, 5% СО2 и 100% влажности. Спустя 2 сут с помощью инвертированного микроскопа производили оценку деструктивных изменений монослоя клеток MDCK, инкубированных с различными концентрациями исследуемого образца. Параллельно, в качестве клеточного контроля, использовали монослой культуры MDCK без внесения препарата. За максимально переносимую концентрацию (МПК) принимали ту концентрацию, при которой не было выявлено цитотоксического эффекта.
Исследование способности грибного меланина 20-24 влиять на инфекционную активность (титр) вируса гриппа А в монослое клеток было проведено при использовании МПК для данной клеточной культуры. Препарат сравнения Тамифлю® был использован в концентрации 100 мкг/мл. В лунки 96-луночных планшетов с клеточным монослоем за 1 ч до заражения вносили по 100 мкл образца, разведённого до необходимой концентрации средой DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK («Sigma»). Инфицирование монослоя клеток осуществляли десятикратными разведениями вируса гриппа, приготовленными на этой же среде, в объёме 100 мкл/лунку (по 4 лунки на каждое разведение вируса). Клетки инкубировали 2 сут при 37°C, 5% СО2 и 100% влажности. Далее определяли наличие вируса гриппа в культивируемой среде по реакции гемагглютинации с 1% суспензией куриных эритроцитов. Титр вируса гриппа в опыте (с исследуемым образцом), а также в соответствующем контроле (без образца) определяли в lg ТЦД50/мл и рассчитывали индекс нейтрализации (ИН), составляющий разницу между титрами вируса в контроле и опыте (lg) [10]. В соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [10] вещество обладает высокой активностью, если подавляет инфекцион-ность вируса в 100 и более раз (ИН > 2,0 lg).
Определение 50% цитотоксических и 50% ингибирующих вирус гриппа концентраций образцов in vitro
Изучали изменение оптической плотности (ОП) раствора красителя, поглощённого живыми клетками в монослое культуры клеток MDCK,
определяли 50% цитотоксические (ЦТД50) и 50% вирусингибирующие (ЭД50) концентрации препаратов колориметрическим методом [11]. В эксперименте использовали ряд 12-кратных и последовательных 2-кратных разведений водного раствора меланина из чаги: в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2051, 4000 раз средой DMEM (диапазон исследуемых концентраций составлял 0,38-800 мкг/мл). Препарат сравнения Тамифлю® разводили 8 раз с шагом 3 средой DMEM (диапазон исследуемых концентраций составлял 0,046100,0 мкг/мл).
Для определения ЦТД50 ряд полученных разведений вносили на монослой клеток в объёме 100 мкл/лунку 96-луночного планшета и ставили в термостат при 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 3 сут. В качестве клеточного контроля использовали интактный монослой (без внесения исследуемого образца).
Для определения ЭД50 в отношении 3 штаммов вируса гриппа А в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток вносили ряд разведений образцов в объёме 100 мкл/лунку, через 2 ч инкубирования при 37°C, 5% СО2 и 100% влажности препарат удаляли из лунок и вносили по 100 мкл разведения вируса с множественностью инфицирования 0,1 ТЦД50/клетку. Спустя 1 ч адсорбции вируса на клетках удаляли вируссодержащую жидкость и снова вносили исследуемые образцы на монослой. В качестве контроля вируса использовали инфицированный монослой клеток (без внесения препарата). Планшеты помещали в термостат при 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 3 сут.
После инкубирования в лунки планшета, содержащие культуральную среду, вносили витальный (прижизненный) краситель нейтральный красный (50 мкл/лунку) и инкубировали 2 ч при 37°C. Далее клетки промывали двукратно физиологическим раствором в объёме 400 мкл/лунку, вносили лизирующий буфер (смесь равных частей 96% этилового спирта и 0,01 М раствора моноаммонийфос-фата, pH 3,5) и через 30 мин определяли ОП. Величину ОП измеряли с помощью многофункционального спектрофотометра «xMark Microplate Absorbance Reader» при длине волны 540 нм, которая является показателем количества жизнеспособных клеток в монослое, сохранившихся при цитопатическом действии вируса или токсическом действии исследуемого образца. Затем при помощи компьютерной программы «SoftMaxPro 4.0» результаты ОП представляли в полулогарифмической системе координат. На основании полученных данных рассчитывали ЦТД50 и ЭД50 для исследуемых препаратов. ЦТД50 — величина концентрации определённого образца препарата в лунке планшета, под воздействием которого разрушается 50% клеточного монослоя, ЭД50 — величина концентрации определённого образца препарата в
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
лунке планшета, под воздействием которого сохраняется 50% жизнеспособного клеточного монослоя. Полученные данные дают возможность рассчитать химиотерапевтический индекс (ХТИ) препарата по формуле: ХТИ = ЦТД50/ЭД50. Активными считаются соединения с ХТИ > 8 [10].
Результаты
При визуальном изучении цитотоксичности водного раствора меланина из чаги установлено, что МПК данного препарата, не оказывающая на клетки токсического действия, составила 237,0 мкг/мл. Результаты определения противовирусной активности экспериментального образца 20-24, снижающего инфекционность (титры) 3 штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK, представлены в табл. 1.
Под действием исследуемого образца чаги наблюдалось снижение титра вируса гриппа А/Са-Нйэгша/04/2009 (Н1Ш^т09 в 3162 раза, титра вируса А/АюЫ/2/68 (Н3Ш) — в 1000 раз, титра вируса А/сЫскеп/Кш^ап/05/2005 (Н5Ш) — в 316 раз относительно соответствующих контролей (без образца). ИН составляли 2,5-3,5
Определены ЦТД50 и ЭД50 для образца 20-24 и Тамифлю® в отношении 3 штаммов вируса гриппа А и рассчитаны соответствующие значения ХТИ (табл. 2). ЭД50 образца 20-24 для 3 субтипов вируса
гриппа находились в пределах от 1,6 до 9,5 мкг/мл. В отношении пандемического вируса гриппа A/H1N1pdm09 исследуемый образец оказался наиболее активным, т.к. проявил 50% вирусингибиру-ющую активность при наименьшей концентрации (ЭД50 = 1,6 мкг/мл).
Обсуждение
Проведённые исследования показали, что образец меланина 20-24, полученный из чаги, обладает противовирусным действием в системе in vitro в отношении исследуемых штаммов вируса гриппа: A/California/04/2009 (H1N1)pdm09, A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1). В исследовании по изучению снижения инфекцион-ности под действием меланина из чаги для 3 субтипов вируса гриппа А выявлены статистические отличия от соответствующих контролей вируса (без внесения образца), установленные по методу Спир-мена-Кербера (табл. 1). В данном эксперименте обнаружено, что противовирусное действие образца 20-24 в отношении всех исследуемых штаммов вируса гриппа было сопоставимо с действием Тамифлю®. Разница индексов нейтрализации между референс-препаратом и тестируемым образцом не превышала 1,0 lg.
При сравнении значений ХТИ для меланина, полученного из чаги, в отношении 3 штаммов виру-
Таблица 1. Снижение инфекционности вируса гриппа А в культуре клеток MDCK под действием водорастворимого меланина из чаги и референс-препарата Тамифлю®
Table 1. Reduction of the influenza А virus infectivity under the influence of water-soluble melanin 20-24 obtained from Inonotus obliquus and reference drug Tamiflu®
Штамм вируса гриппа Influenza virus strain Опыт/контроль Experiment/control Титр вируса гриппа, lg ТЦД50/мл Virus titer, lg TCID50/mL (М ± У n = 4) ИН, lg Neutralization index (IN), lg
A/California/04/2009 (H1N1)pdm09 Образец 20-24 Sample 20-24 1,50 ± 0,00* 3,50
Тамифлю® Tamiflu® 2,25 ± 0,49 2,75
Контроль вируса Virus control 5,00 ± 0,57 -
A/Aichi/2/68 (H3N2) Образец 20-24 Sample 20-24 1,50 ± 0,00* 3,00
Тамифлю® Tamiflu® 0,50 ± 0,00* 4,00
Контроль вируса Virus control 4,50 ± 0,69 -
A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) Образец 20-24 Sample 20-24 4,75 ± 0,49* 2,50
Тамифлю® Tamiflu® 5,00 ± 0,57* 2,25
Контроль вируса Virus control 7,25 ± 0,49 -
Примечание. n — число лунок с монослоем клеток, инфицированных разными разведениями вируса. *p < 0,05 по сравнению с контролем (без образца) по методу Спирмена-Кербера.
Notes. TCID50 — 50% tissue culture infectious doses; M (mean) and SD (standard deviation) for 95% confidence interval calculated by the Spearman-Kerber method; n means the number of wells with the cell monolayer infected with viruses in different concentrations. *p < 0.05 compared to the control (sample-free) by the Spearman-Kerber method.
ORIGINAL RESEARCHES
Таблица 2. Противовирусная активность водорастворимого меланина 20-24 из чаги и референс-препарата Тамифлю® в отношении вируса гриппа А в культуре клеток MDCK
Table 2. Antiviral activity of water-soluble melanin 20-24 obtained from Inonotus obliquus and reference drug Tamiflu® against influenza A virus in MDCk cell culture
Штамм вируса гриппа Influenza virus strain Опыт/контроль Experiment/control ЦTД50, мкг/мл CC50 Mg/mL ЭД50, мкг/мл IC5,,, Mg/mL x™ SI
A/California/04/ Образец 20-24 | Sample 20-24 153,45 1,55 99,00
2009 (H1N1)pdm09 Тамифлю® | Tamiflu® > 100,00 0,94 > 106,38
A/Aichi/2/68 (H3N2) Образец 20-24 | Sample 20-24 153,45 5,70 26,92
Тамифлю® | Tamiflu® > 100,00 0,06 > 1666,67
A/chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1) Образец 20-24 | Sample 20-24 153,45 9,52 16,07
Тамифлю® | Tamiflu® > 100,00 0,02 > 5000,00
Note. CC50 — 50% cytotoxic concentration; IC50 — 50% inhibitory (effective) concentration; SI — selectivity index.
са гриппа установлено, что самое высокое значение данного показателя, составляющее 99,Q (сопоставимое со значением XTH Tамифлю®), было обнаружено для вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1) pdmQ9. T.B. Tепляковой и соавт. установлено высокое значение XTH меланинов, выделенный из куль-туральной жидкости и биомассы культивируемого мицелия чаги (штамм F-1244), которое достигало 16Q в отношении этого же штамма вируса гриппа [6, 12]. В отношении вируса гриппа A субтипов H3N2 и H5N1 нами были получены значения ЭД5С 5,7 и 9,52 мкг/мл, а XTH — 26,92 и 16,Q7 соответственно.
Tаким образом, меланин из чаги 2Q-24 проявил высокую активность в отношении вируса гриппа A разный субтипов (HlNlpdmQ9, H3N2, H5N1). При этом наибольшую активность образец меланина оказал против пандемического вируса гриппа A/HlNlpdmQ9 (снижал его инфекционность на 3,5 lg и обладал ЭД5С 1,6 мкг/мл) [6].
Полученные результаты указывают на перспективность создания противогриппозного препарата на основе меланина Inonotus obliquus широкого спектра, снижающего вирусную нагрузку.
СПИСОК И^ОЧНИКОВ
1. Киселева И.В., Ларионова Н.В., Григорьева Е.П., Ксена-фонтов A^., Фарруx M.A., Руденко Л.Г. Особенности циркуляции респираторный вирусов в нред- и пандемические но гриппу и COVID-19 периоды. Инфекция и иммунитет. 2Q21; 11(6): 1QQ9-19.
https://doi.org/lQ.l5789/222Q-76l9-SFO-l662
2. Lampejo T. Influenza and antiviral resistance: an overview. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2Q2Q; 39(7): 12Q1-Ü8. https://doi.org/lQ.lQQ7/slQQ96-Q2Q-Q384Q-9
3. Зырянов С.К., Бутранова О.И., Гайдай Д.С., Крышень К.Л. Фармакотерапия острый респираторный инфекций, вызванный вирусами гриппа. Терапевтический архив. 2Q21; 93(1): 114-24. https://doi.org/lQ.26442/QQ4Q366Q.2Q2l.Ql.2QQ55l
4. Косогова T.A. Штаммы базидиальных грибов юга Западной Сибири — перспективные продуценты биологически активных препаратов: дисс. ... канд. биол. наук. Кольцово; 2Q13.
5. Tеплякова ТВ., Косогова T.A. Высшие грибы Западной Сибири — перспективные объекты для биотехнологии лекарственных препаратов. Новосибирск; 2Q14.
6. Теплякова Т.В., Ильичева Т.Н., Маркович Н.А. Перспективы создания препаратов против гриппа на основе лекарственных грибов (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2020; 5б(5): 409-18. https://doi.org/10.31857/S0555109920050141
7. Teplyakova T.V., Pyankov O.V., Safatov A.S., Ovchinni-kova A.S., Kosogova T.A., Skarnovich M.O., et al. Water extract of the chaga medicinal mushroom, Inonotus obliquus (Agaricomycetes), inhibits SARS-CoV-2 replication in Vero E6 and Vero cell culture experiments. Int. J. Med. Mushrooms. 2022; 24(2): 23-30.
https://doi.org/10.1615/IntJMedMushrooms.2021042012
8. Закс Л. Статистическое оценивание. Пер. с нем. М.: Статистика; 1976.
9. Халафян А.А. Statistica 6. Статистический анализ данных. М.: Бином-Пресс; 2010.
10. Хабриев Р.У., ред. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина; 2005.
11. Paragas J., Whitehouse C.A., Endy T.P., Bray M. A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Antiviral. Res. 2004; 62(1): 21-5. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2003.11.006
12. Теплякова Т.В., Косогова Т.А., Ильичева Т.Н., Гражданце-ва А.А., Даниленко Е.Д., Лебедев Л.Д. и др. Штамм бази-диального гриба Inonotus obliquus — продуцент пигмента меланина, обладающего противовирусной и противоопухолевой активностью. Патент РФ № 2716590С1; 2020.
REFERENCES
1. Kiseleva I.V., Larionova N.V., Grigor'eva E.P., Ksenafon-tov A.D., Farrukh M.A., Rudenko L.G. Salient features of circulating respiratory viruses in the pre- and pandemic influenza and Covid-19 seasons. Infektsiya i immunitet. 2021; 11(6): 1009-19. https://doi.org/10.15789/2220-7619-SF0-1662 (in Russian)
2. Lampejo T. Influenza and antiviral resistance: an overview. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2020; 39(7): 1201-08. https://doi.org/10.1007/s10096-020-03840-9
3. Zyryanov S.K., Butranova O.I., Gayday D.S., Kryshen' K.L. Pharmacotherapy for acute respiratory infections caused by influenza viruses: current possibilities. Terapevticheskiy arkhiv. 2021; 93(1): 114-24.
https://doi.org/10.26442/00403660.2021.01.200551 (in Russian)
4. Kosogova T.A. Strains of basidial fungi of the south of Western Siberia - promising producers of biologically active drugs: Diss. Kol'tsovo; 2013. (in Russian)
5. Teplyakova T.V., Kosogova T.A. Higher fungi of Western Siberia — Promising Objects for Biotechnology of Medicines
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
[Vysshie griby Zapadnoy Sibiri — perspektivnye ob"ekty dlya biotekhnologii lekarstvennykh preparatov]. Novosibirsk; 2014. (in Russian)
6. Teplyakova T.V., Il'icheva T.N., Markovich N.A. Future developing medicines against influenza on the basis of medicinal mushrooms (review). Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2020; (5): 409-18.
https://doi.org/10.31857/S0555109920050141 (in Russian)
7. Teplyakova T.V., Pyankov O.V., Safatov A.S., Ovchinniko-va A.S., Kosogova T.A., Skarnovich M.O., et al. Water extract of the chaga medicinal mushroom, Inonotus obliquus (Agarico-mycetes), inhibits SARS-CoV-2 replication in Vero E6 and Vero cell culture experiments. Int. J. Med. Mushrooms. 2022; 24(2): 23-30.
https://doi.org/10.1615/IntJMedMushrooms.2021042012
8. Sachs L. Statistische Auswertungsmethoden. Berlin: SpringerVerlag; 1972.
9. Khalafyan A.A. Statistica 6. Statistical Data Analysis [Statis-tica 6. Statisticheskiy analiz dannykh]. Moscow: Binom-Press; 2010. (in Russian)
10. Khabriev R.U., ed. Guidelines for Experimental (Preclinical) Study of New Pharmacological Substances [Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novykh far-makologicheskikh veshchestv]. Moscow: Meditsina; 2005. (in Russian)
11. Paragas J., Whitehouse C.A., Endy T.P., Bray M. A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hem-orrhagic fever virus. Antiviral. Res. 2004; 62(1): 21-5. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2003.11.006
12. Teplyakova T.V., Kosogova T.A., Il'icheva T.N., Grazhdant-seva A.A., Danilenko E.D., Lebedev L.D., et al. The strain of the basidial fungus Inonotus obliquus is a producer of melanin pigment with antiviral and antitumor activity. Patent RF No. 2716590C1; 2020. (in Russian)
Информация об авторах
Филиппова Екатерина Игоревна — н.с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Россия, https://orcid.org/0000-0001-9554-4462 Макаревич Елена Викторовна — н.с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Россия, https://orcid.org/0000-0002-5146-8979
Проценко Мария Анатольевнаш — к.б.н., с.н.с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Россия, protsenko_ma@vector.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0002-1995-7588
Мазурков Олег Юрьевич — к.б.н., с.н.с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Россия, https://orcid.org/0000-0001-8164-4091
Теплякова Тамара Владимировна — д.б.н., профессор, в.н.с. отдела биофизики и экологических исследований ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Россия, https://orcid.org/0000-0003-4754-5051 Мазуркова Наталья Алексеевна — д.б.н., в.н.с. отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Россия, https://orcid.org/0000-0002-1896-2684 Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
Статья поступила в редакцию 22.09.2022; принята к публикации 29.11.2022; опубликована 14.02.2022
Information about the authors
Ekaterina I. Filippova — researcher, Department of prevention and treatment of especially dangerous infections, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Russia, https://orcid.org/0000-0001-9554-4462
Elena V. Makarevich — researcher, Department of prevention and treatment of especially dangerous infections, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Russia, https://orcid.org/0000-0002-5146-8979
Maria A. ProtsenkoM — Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Department of prevention and treatment of especially dangerous infections, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Russia, protsenko_ma@vector.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0002-1995-7588
Oleg Yu. Mazurkov — Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Department of prevention and treatment of especially dangerous infections, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Russia, https://orcid.org/0000-0001-8164-4091
Tamara V. Teplyakova — D. Sci. (Biol.), Professor, leading researcher, Department of Biophysics and Ecological Research, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Russia, https://orcid.org/0000-0003-4754-5051
Natalya A. Mazurkova — D. Sci. (Biol.), leading researcher, Department of prevention and treatment of especially dangerous infections, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Russia, https://orcid.org/0000-0002-1896-2684 Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
The article was submitted 22.09.2022; accepted for publication 29.11.2022;
published 14.02.2022
