CC BY
33
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Противовирусная активность экстрактов базидиомицетов и гуминовых соединений в отношении вируса иммунодефицита человека (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Lentivirus: Human immunodeficiency virus 1) и вируса простого герпеса (Herpesviridae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1)
Носик Д.Н.1, Носик Н.Н.1, Теплякова Т.В.2, Лобач О.А.1, Киселева И.А.1, Кондрашина Н.Г.1, Бочкова М.С.1, Ананько ГГ.2
'Институт вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва; 2ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская обл.
Введение. Актуальнейшей проблемой современной медицины является борьба с заболеванием, вызываемым вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), - ВИЧ-инфекцией. Применяемые химические соединения улучшили ситуацию для инфицированных, однако они токсичны, нарушают обмен веществ и не могут избавить организм от интегрированного вируса. Появление резистентных штаммов ВИЧ делает эти лечебные средства неэффективными. Часто смерть ВИЧ-инфицированных наступает в результате развития оппортунистических инфекций, вызванных вирусами семейства Herpesviridae. Поэтому актуален поиск новых лечебных и профилактических препаратов, менее токсичных, активных в отношении нескольких вирусов одновременно. Базидиомицеты, высшие грибы, являются источником лекарственных соединений, обладающих антимикробными и противовирусными свойствами. Гуминовые соединения (ГС) различной природы также обладают противовирусной активностью.
Цель исследования - получение и испытание нетоксичных препаратов из базидиомицета Inonotus obliquus и ГС из бурых углей в отношении вирусов, патогенных для человека: ВИЧ и вируса простого герпеса (ВПГ). Материал и методы. На модели лимфобластоидных клеток MT-4, инфицированных штаммами ВИЧ, тип 1 (ВИЧ-1), и монослойной культуры клеток Vero, инфицированной ВПГ, тип 1 (ВПГ-1), изучена противовирусная активность экстрактов меланина, полученных из культивируемой культуры гриба чага Inonotus obliquus, и ГС - из бурого угля Канско-Ачинского месторождения с использованием вирусологических и статистических методов исследования.
Результаты и обсуждение. Установлено, что все исследованные соединения не обладали цитотоксиче-ским действием на клетки при концентрации 100 мкг/мл. Показано, что экстракты базидиомицетов и ГС обладают противовирусной активностью в отношении ВИЧ-1 и ВПГ-1. ЭК50 (50% эффективная концентрация) в отношении ВИЧ-1 составила 3,7-5,0 мкг/мл, индекс селективности - 28-35. Противогерпетическая активность обнаружена при дозе 50-100 мкг/мл. Противовирусная эффективность меланиновых соединений установлена как при «профилактической» (за 2 ч до инфицирования клеток), так и при «лечебной» схеме введения препаратов как в отношении ВИЧ-1, так и ВПГ-1. Наличие противовирусной активности меланина и ГС в отношении РНК-содержащего вируса ВИЧ-1 и ДНК-содержащего вируса ВПГ-1 в нашем исследовании совпадает с результатами ряда авторов в отношении вирусов гриппа, герпеса, ВИЧ, гепатита В, Коксаки, осповакцины, что позволяет высказать предположение о том, что тип нуклеиновой кислоты вируса не играет принципиальной роли в антивирусном действия этих препаратов. Очевидно также, что ГС эффективны как в отношении вирусов с оболочкой, так и безоболочечных вирусов. Заключение. В целом можно заключить, что для меланиновых и гуминовых соединений характерна низкая токсичность при наличии и вирулицидной, и противовирусной активности. Это позволяет рассматривать исследованные соединения как основу для создания безопасных лекарственных средств, эффективных в отношении возбудителей различных вирусных инфекций.
Ключевые слова: противовирусная активность; ВИЧ-1; ВПГ-1; базидиомицеты; гуминовые соединения. Для цитирования: Носик Д.Н., Носик Н.Н., Теплякова Т.В., Лобач О.А., Киселева И.А., Кондрашина Н.Г., Бочкова М.С., Ананько Г.Г. Противовирусная активность экстрактов базидиомицетов и гуминовых соединений в отношении вируса иммунодефицита человека (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Lentivirus: Human immunodeficiency virus 1) и вируса простого герпеса (Herpesviridae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1). Вопросы вирусологии. 2020; 65(5): 276-283. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-5-4 Для корреспонденции: Лобач Ольга Александровна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории противовирусных и дезинфекционных средств Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи», 123098, Москва. E-mail: [email protected]
ORIGINAL RESEARCH
Участие авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Финансирование. Работа была частично поддержана финансированием по теме ГНЦ ВБ «Вектор» 03-02-14. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
Поступила 30.04.2020 Принята в печать 17.09.2020
Antiviral activity of extracts of basidiomycetes and humic compounds substances against Human Immunodeficiency Virus (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Lentivirus: Human immunodeficiency virus 1) and Herpes Simplex Virus (Herpesviridae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1)
Dmitry N. Nosik1, Nickolay N. Nosik1, Tamara V. Teplyakova2, Olga A. Lobach1, Irina A. Kiseleva1, Nina G. Kondrashina1, Marina S. Bochkova1, Grigoriy G. Ananko2
1The D.I. Ivanovsky Institute of Virology FSBI «National Research Center of Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia, 123098, Moscow; 2FBU State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector» of Rospotrebnadzor, 630559, Koltsovo district, Novosibirsk region.
Introduction. One of the most urgent problem of modern medicine is the fight against the disease caused by the Human Immunodeficiency Virus (HIV) - HIV infection. The chemical compounds have improved the situation for infected people, but they are toxic, disrupt the metabolism and cannot eliminate the integrated virus from the body. The emergence of resistant HIV strains makes these treatments ineffective. Often, the death of HIV-infected people occurs as a result of the development of opportunistic infections caused by viruses of the Herpesviridae family. Therefore, the search for new therapeutic and preventive drugs that are less toxic and active against several viruses at the same time is relevant. Basidiomycetes, higher fungi, are a source of medicinal compounds that have antimicrobial properties, as well as antiviral ones. Humic compounds (HS) of various nature also have antiviral activity.
The aim of the study was to obtain nontoxic compounds from the basidiomycete Inonotus obliquus and humic compounds from brown coals and to test their activity against viruses that are pathogenic to humans: HIV and Herpes Simplex Virus (HSV).
Material and methods. The antiviral activity of melanin extracts obtained from the culture of the chaga fungus Inonotus obliquus and HS from the brown coal of the Kansko-Achinsk Deposit was studied using a model of MT-4 lymphoblastoid cells infected with HIV type 1 (HIV-1) strains and a monolayer culture of Vero cells infected with HSV type 1 (HSV-1) using virological and statistical research methods.
Results and discussion. It was found that all the studied compounds did not have a cytotoxic effect on cells at a concentration of 100 mcg/ml. It was shown that extracts of basidiomycetes and HS have antiviral activity against HIV-1 and HSV-1. EC50 (50%-effective concentration) for HIV-1 was 3.7-5.0 mcg/ml, selectivity index 28-35. Antiherpetic activity was detected at a dose of 50-100 mcg/ml. The antiviral effectiveness of melanin compounds was established both in the «preventive» (2 hours before cell infection) and in the «therapeutic» regimen of drug administration, both for HIV-1 and HSV-1. The presence of antiviral activity of melanin and HS in relation to the RNA-containing HIV-1 virus and DNA-containing HSV-1 virus in our study coincides with the results of a number of authors in relation to influenza viruses, herpes virus, HIV, hepatitis B virus, Coxsackievirus, smallpox vaccine virus, which suggests that the type of nucleic acid in the virus does not play a fundamental role in the antiviral action of these drugs. It is also clear that HS is effective against both enveloped and non-enveloped viruses. Conclusion. In general, it can be concluded that melanin and humic compounds are characterized by low toxicity in the presence of both virucidal and antiviral activity. This allows us to consider the studied compounds as the basis for creating safe medicines that are effective against pathogens of various viral infections.
Keywords: antiviral activity; HIV-1; HSV-1; basidiomycetes; humic compounds.
For citation: Nosik D.N., Nosik N.N., Teplyakova T.V., Lobach O.F., Kiseleva I.A., Kondrashina N.G., Bochkova M.S., Ananko G.G. Antiviral activity of extracts of basidiomycetes and humic compounds against Human Immunodeficiency Virus (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Lentivirus: Human immunodeficiency virus 1) and Herpes Simplex Virus (Herpesviridae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1). Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2020;65(5): 276-283. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-5-4
For correspondence: Olga A. Lobach, Cand. Sci. Biol., senior researcher at the Laboratory of antiviral and disinfection agents of The D.I. Ivanovsky Institute of Virology FSBI «National Research Center of Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia, 123098, Moscow. E-mail: [email protected] Information about the authors: Nosik D.N., http://orcid.org/0000-0001-5757-5671 Nosik N.N., http://orcid.org/0000-0003-1943-6536 Teplyakova T.V., http://orcid.org/0000-0003-4754-5051 Lobach О.А., http://orcid.org/0000-0001-9351-6433 Kiseleva I.A., http://orcid.org/0000-0003-3693-6081 Kondrashina N.G. http://orcid.org/0000-0003-3985-3839
Bochkova M.S., http://orcid.org/0000-0001-9295-8379 Ananko G.G., http://orcid.org/0000-0001-6570-5501 Contribution: the authors contributed equally to this article.
Acknowledgements. The work was partially supported by funding on the topic of FBU VB «Vector» 03-02-14. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 30 April 2020 Accepted 17 September 2020
Введение
Актуальнейшей проблемой современной медицины является борьба с заболеванием, вызываемым вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), - ВИЧ-инфекцией, которая за короткий срок привела к заражению и смерти миллионов человек. Применяемые химические соединения улучшили ситуацию для инфицированных, однако они токсичны для человека, нарушают обмен веществ и не могут избавить организм от интегрированного вируса [1-3]. Появление резистентных штаммов ВИЧ делает эти лечебные средства неэффективными. Течение ВИЧ-инфекции тесно связано с развитием оппортунистических инфекций, и часто смерть больных наступает в результате развития вирусных инфекций, вызванных вирусами семейства Herpesviridae.
В связи с этим актуален поиск новых лечебных и профилактических препаратов, менее токсичных, активных в отношении нескольких вирусов одновременно, способных также атаковать резервуары вируса, пока недоступные для проникновения существующих лекарств. Поэтому заявление, прозвучавшее во Всемирной Организации Здравоохранения еще в 1989 г. о необходимости обратить внимание на возможности этномедицины, фитотерапии и использование натуральных продуктов для борьбы с ВИЧ/СПИДом, и сегодня не потеряло своей актуальности [3].
Базидиомицеты, высшие грибы, используемые в пищу, являются источником лекарственных соединений, обладающих антимикробными свойствами, в том числе противовирусными [4]. Большинство исследователей связывают эти эффекты с наличием в грибах меланинов - высокомолекулярных гетерогенных полимеров, представленных в виде черных и коричневых пигментов. Темный цвет меланинов определяется тем, что они не излучают поглощенный видимый или невидимый свет, а преобразуют энергию во вращательную и вибрационную активность внутри молекулы, рассеивая ее в виде тепла. Свободные электроны, способные к обменному взаимодействию, определяют антиоксидантные свойства меланинов [5].
Меланины повышают толерантность грибов к экологическим стрессам, улучшая их выживаемость. Они защищают грибковые структуры от ультрафиолетового излучения, повышенной температуры, высыхания, окислителей, токсичных соединений и атак микробов благодаря своей хелатирующей способности [5, 6]. Имеется ряд данных о непосредственном взаимодействии молекул меланина с вирионами, находящимися в межклеточной среде [7]. Имеется также предположение, что экстракт чаги ингибировал
репродукцию вируса простого герпеса (ВПГ-1), воздействуя на вирусные гликопротеины [8].
Гуминовые соединения (ГС) (производное от латинского humus - «земля» или «почва») различной природы также обладают широким спектром активностей, поскольку сами являются важнейшими компонентами биосферы. Они участвуют в миграции катионов, снижают негативное действие токсичных веществ, влияют на развитие организмов и тепловой баланс планеты [9].
Установлена противовирусная активность ГС в отношении различных вирусов с оболочкой и без ли-пидной оболочки: вируса гриппа А, ВПГ-1, цитомега-ловируса, ВИЧ, вируса Коксаки [10, 11].
Целью данных исследований было получение и испытание нетоксичных препаратов из базидиомицета Inonotus obliquus и ГС из бурых углей в отношении ряда вирусов, патогенных для человека, таких как ВИЧ-1 и ВПГ-1.
Материал и методы
Вирусы. В качестве источника ВИЧ использовали штамм ВИЧ-1899А (субтип В; Германия), штамм ВИЧ-1вд73Дсубтип В; Россия), штамм ВИЧ-1 (субтип АЕ; Россия) из коллекции штаммов ВИЧ Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
В работе использовали ВПГ-1, штамм Л2, полученный из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Клетки. Для работы с ВИЧ использовали перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Для работы с ВПГ использовали перевиваемую культуру клеток почки зеленых мартышек Vero. Клеточные культуры получены из коллекции культур клеток Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Исследование цитотоксического действия препаратов. Исследуемые образцы добавляли к клеткам в различных концентрациях. Инкубировали клетки при 37°С в атмосфере с 5% СО2 и 98% влажности 1-5 дней (в зависимости от типа клеток). Учет результатов: определение жизнеспособности и количества клеток при помощи красителя.
Исследование противовирусного действия образцов в отношении ВИЧ-1. Внесение исследуемого образца в различных дозах проводили одновременно с инфицированием вирусом в дозе 0,01 ТЦИД50/ клетку (50% тканевая цитопатическая инфекционная доза) или при предварительной 2-часовой инкуба-
ORIGINAL RESEARCH
ции. Инкубацию клеток проводили в течение 5 дней при 37°С в атмосфере с 5% СО2 и 98% влажности. Учет результатов осуществляли окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (методом МТТ) со спектрофотометрией и световой микроскопией - исследованием цитопатического эффекта вируса (ЦПЭ) и вирус-индуцируемого синцития (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран), определением антигена вируса в культу-ральной жидкости инфицированных клеток.
Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса определяли по формуле:
% защиты = ———— х 100, К - В
где А - число жизнеспособных клеток в опытной группе;
В - то же в инфицированной культуре (контроль вируса);
К - то же в неинфицированной культуре (контроль клеток).
Определение антигена вируса в культуральной жидкости инфицированных клеток проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора GENSCREEN™ ULTRA HIV Ag-Ab фирмы BIO-RAD согласно инструкции изготовителя. Результаты учитывали с помощью фотометра Stat Fax-3200 производства США при длине волны 450/630 нм. Чувствительность тест-системы -менее 25 пкг/мл.
Исследование противовирусного действия образцов в отношении ВПГ-1. В монослойную культуру клеток Vero вносили испытуемые образцы в различных концентрациях с вирусом в дозе 100 ТЦИД50 одновременно или за 2 ч до инфицирования. Контролем служили клетки, не обработанные исследуемыми веществами и инфицированные ВПГ-1. Опытные и контрольные клетки в 96-луночных панелях помещали в инкубатор при 37°С и 5,0% СО2 до поражения 100% клеток в контроле. Учет проводили микроскопически и методом МТТ (с помощью тет-разолиевого красителя).
Получение культуральных меланинов (образцы 1423, 15-48, 15-54, 16-32, 16-42). Для получения меланинов в глубинной культуре использовали штамм гриба чага Inonotus obliquus F-1244, выращенный на глюко-зо-триптонной среде следующего состава, г/л: глюкоза -30; триптон - 2,5; дрожжевой экстракт - 1,25; KH2PO4 -1,1; K2HPO4 - 4,4; MgSO4 - 0,25; рН 7,0-8,0. Культивирование осуществлялось в 0,75 л колбах на качалке при 200 об./мин, 26°С в течение 12 сут, до максимального накопления меланинов. Для выделения меланинов, секретированных в среду, сначала фильтрованием отделяли мицелий, а затем меланины осаждали соляной кислотой. Меланины из мицелия экстрагировали 2% NaOH, отделяли экстракт центрифугированием, а затем меланины также осаждали соляной кислотой. Меланины подвергали очистке посредством 6-кратного переосаждения. После очистки и высушивания препарат меланина представлял собой черные кристал-
лы с ярким мерцающим блеском. После измельчения кристаллов меланин представлял собой темно-бурый порошок.
Получение образцов ГС (образцы 12-47, 14-46, 1475, 14-80, 14-82, 16-35). В качестве источника ГС использовали бурый уголь Канско-Ачинского месторождения, предварительно измельченный в мельнице (размер частиц до 0,25 мм). Для получения водорастворимых соединений порошок обрабатывали 2,5% раствором аммиака в гомогенизаторе, с последующим отделением нерастворимой фракции и очисткой ГС методом 6-кратного переосаждения по методике, описанной ранее [12].
Методы статистической обработки результатов. Статистический анализ данных описательной статистики и определения коэффициента Стьюдента проводили с помощью программы BioStat 2009 (Апа-lystSoft). Уровень значимости (а) был равен 0,05.
Результаты исследования
1. Антиретровирусная активность гуминовых и меланиновых веществ в культуре клеток
Результаты антиретровирусной активности образцов представлены в табл. 1—2.
Полученные данные (см. табл. 1) показали, что наименьшей цитотоксичностью обладал образец 1482. При концентрации 50-400 мкг/мл жизнеспособность клеток составила 97,7-95,9% соответственно по сравнению с контролем. Наибольшая цитоток-сичность обнаружена у образца 15-54 - при концентрации 400 мкг/мл жизнеспособность клеток составила 69,2%. В целом все исследованные соединения не обладали цитотоксическим действием на клетки при концентрации 100 мкг/мл. СТ50 (50% среднеток-сичная концентрация) для соединений 16-32 и 16-35 составила 140 и 130 мкг/мл соответственно.
Противовирусная активность в отношении ВИЧ-1 обнаружена у образцов 12-47, 14-23, 14-46, 14-75, 1480, 14-82, 16-32, 16-35 при концентрации 10-400 мкг/ мл. Наибольшей противовирусной активностью в отношении ВИЧ-1 обладали образцы 16-32, 16-35 - при концентрации 10 мкг/мл отмечена 92,4-94,1% защита клеток от ЦПЭ вируса и отсутствовали вирус-инду-цированные синцитии, а также обнаружено снижение на 60,3-81,6% уровня вирусного антигена в культу-ральной жидкости ВИЧ-инфицированных клеток. ЭК50 (50% эффективная концентрация) препарата 16-32 -3,7 мкг/мл, 16-35 - 5,0 мкг/мл. Индекс селективности для препарата 16-32 - 35, 16-35 - 28. При этом препараты были эффективны в отношении штаммов ВИЧ-1 разных субтипов, выделенных в разных регионах мира (Западная Европа и Россия) (см. табл. 2).
2. Противогерпетическая активность гуминовых и меланиновых веществ в культуре клеток.
Результаты исследования противогерпетической активности гуминовых и меланиновых веществ представлены в таблицах 3 и 4.
В отношении ВПГ-1 также наблюдался про-
Таблица 1. Исследование противовирусной активности образцов на модели клеток человека (МТ-4), инфицированных ВИЧ-1 Тable 1. Study of antiviral activity of samples on a model of human cells (MT-4) infected with HIV-1
Образец Sample Концентрация, мкг/мл Без вируса(токсичность) No virus (toxicity) **ВИЧ-инфекция **HIV-infection
Concentration, mcg/ml *жизнеспособность клеток, % *Cell viability, % ЦПЭ-синцитии, % CPE- syncytia,% защита клеток, % Cell protection,% ^ижение уровня вирусного антигена, % Reduction of the level of viral antigen, %
12-47 150 91,4 ± 0,02 0 68,0 ± 0,01 74,9 ± 0,01
125 93,2 ± 0,02 0 60,8 ± 0,02 67,6 ± 0,03
100 98,4 ± 0,03 0 50,4 ± 0,03 65,1 ± 0,02
75 98,8 ± 0,02 0 46,7 ± 0,02 63,7 ± 0,03
50 99,2 ± 0,04 10 31,2 ± 0,04 52,0 ± 0,04
25 99,4 ± 0,05 100 12,8 ± 0,05 34,4 ± 0,05
14-23 150 89,0 ± 0,02 0 73,6 ± 0,01 66,8 ± 0,03
125 90,4 ± 0,01 0 71,9 ± 0,02 61,0 ± 0,02
100 97,2 ± 0,03 0 63,4 ± 0,01 58,3 ± 0,04
75 97,8 ± 0,02 0 63,2 ± 0,02 58,1 ± 0,04
50 98,6 ± 0,04 10 37,8 ± 0,03 54,9 ± 0,05
25 99,8 ± 0,05 10 29,5 ± 0,04 5,7 ± 0,02
14-46 150 92,0 ± 0,03 0 79,9 ± 0,01 63,2 ± 0,02
125 93,0 ± 0,02 0 78,0 ± 0,02 54,7 ± 0,04
100 97,3 ± 0,02 0 60,7 ± 0,02 51,3 ± 0,05
75 97,8 ± 0,03 0 59,3 ± 0,04 50,1 ± 0,03
50 98,4 ± 0,03 0 54,2 ± 0,05 48,6 ± 0,04
25 98,8 ± 0,04 10 49,9 ± 0,05 36,0 ± 0,05
14-75 400 85,8 ± 0,03 0 89,0 ± 0,02 98,2 ± 0,01
200 87,4 ± 0,03 0 88,6 ± 0,01 97,7 ± 0,02
100 87,9 ± 0,04 10 68,9 ± 0,02 58,1 ± 0,05
50 89,0 ± 0,05 100 47,0 ± 0,03 5,1 ± 0,05
14-80 400 89,9 ± 0,02 0 89,0 ± 0,02 97,3 ± 0,03
200 91,1 ± 0,03 0 85,8 ± 0,03 96,6 ± 0,04
100 92,7 ± 0,04 10 68,1 ± 0,04 32,3 ± 0,05
50 94,3 ± 0,05 100 21,7 ± 0,05 7,2 ± 0,01
14-82 400 95,9 ± 0,03 0 95,6 ± 0,01 98,4 ± 0,02
200 96,4 ± 0,03 0 86,7 ± 0,02 97,3 ± 0,03
100 96,8 ± 0,03 0 84,3 ± 0,04 96,4 ± 0,03
50 97,7 ± 0,04 10 59,1 ± 0,04 23,8 ± 0,02
15-48 400 81,1 ± 0,05 10 27,0 ± 0,03 1,1 ± 0,05
200 82,2 ± 0,05 100 13,5 ± 0,03 0,8 ± 0,04
100 83,3 ± 0,03 100 5,7 ± 0,05 0,7 ± 0,03
50 83,6 ± 0,04 100 5,3 ± 0,05 0,2 ± 0,05
15-54 400 69,2 ± 0,04 100 7,1 ± 0,04 4,4 ± 0,05
200 70,1 ± 0,02 100 3,2 ± 0,05 3,8 ± 0,05
100 70,8 ± 0,04 100 0,2 ± 0,05 2,1 ± 0,05
50 71,2 ± 0,05 100 0 0,5 ± 0,04
Контроль клеток Cell Control 100 0 - -
Контроль вируса Virus Contol - 100 - -
Примечание: * - жизнеспособность клеток по отношению к интактному контролю клеток, %; ** - внесение препаратов одновременно с инфицированием.
Note: * - cell viability in comparison to intact control cells, %; ** - introduction of compounds simultaneously with infection.
тивовирусный эффект исследованных соединений: 12-47, 14-46, 15-48, 15-54, 16-32 (см. табл. 3, 4). В контрольных культурах клеток (инфицированных ВПГ-1 и не обработанных исследуемыми соединениями) через 48 ч развивался вирус-индуцирован-ный ЦПЭ. ГС (образцы №12-47 и 14-46) защищали клетки от цитопатического действия ВПГ-1 при ми-
нимальных концентрациях 100 мкг/мл для №12-47 и 150 мкг/мл - для №14-46 (см. табл. 4). В случае меланиновых соединений противовирусный эффект был несколько выше - противогерпетическая активность отмечена уже при дозе препарата 50 мкг/мл. Предварительная инкубация клеток с препаратом в течение 2 ч увеличивала противовирусный эффект.
ORIGINAL RESEARCH
Таблица 2. Противовирусная активность образцов водного раствора ГС и меланина из жидкой биомассы штамма чаги F-1244 на модели клеток человека, инфицированных различными штаммами ВИЧ-1 (концентрация 10 мкг/мл)
Table 2. Antiviral activity of samples of an aqueous solution of humic compound and melanin from the liquid biomass of the F-1244 chaga strain on a model of human cells infected with various HIV-1 strains (concentration 10 mcg/ml)
Образец Sample Защита клеток от цитодеструктивного действия вируса, % Protection of cells from the cytodestructive action of the virus, %
Штаммы вируса иммунодефицита человека Human Immunodeficiency Virus strains
ВИЧ-1899А (субтип В) HIV-1899a (subtype B) ВИЧ-1иВ735 (субтип В) Н№1„73, (subtype B) ВИЧ-1ши1 (субтип АЕ) Н№1„74, (subtype AE)
Гуминовое соединение Humic compound (16-35) Меланин
Melanin (16-32)_
92,7 ± 0,02 81,9 ± 0,03
93.2 ± 0,02
82.3 ± 0,04
93,2 ± 0,03
92,4 ± 0,02
Таблица 3. Противогерпетическое действие гуминовых соединений в культуре клеток Vero Table 3. Antiherpetic effect of humic compounds in Vero cell culture
Концентрации испытуемых веществ, мкг/мл Защита от цитопатического действия 100 ТЦИД50 ВПГ-1, % Protection from cytopathic action 100 TCID50 HSV-1, %
Concentrations of the tested substances, mcg/ml №12-47 №14-46 Контроль ВПГ-1 Control HSV-1
100,0 100,0 ± 0,0 75,0 ± 0,04 0,0
150,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 0,0
200,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 0,0
300,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 0,0
Таблица 4. Противогерпетическое действие меланиновых веществ в культуре клеток Vero Table 4. Antiherpetic effect of melanin substances in Vero cell culture
Схема применения испытуемых веществ Scheme of application of the tested substances Концентрация веществ, мкг/мл The concentration of substances, mcg/ml Степень защиты клеток от 100 ТЦИД50 вируса, % The degree of protection of cells from 100 TCID50 virus %
контроль Control 15-48 15-54 16-32
Одновременно с инфицированием 50 0 87,5 ± 0,02 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
Simultaneously with the infection 100 0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
250 0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
За 2 ч до инфицирования 50 0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
2 hours before infection 100 0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
250 0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
Обсуждение
Желание использовать возможности природы для борьбы с инфекционными заболеваниями у человечества было всегда. С древних времен люди лечились травами, растениями, грибами, минералами и т.п.
Поэтому в конце прошлого и начале этого века многие грибы исследовали на противовирусную активность и обнаружили в некоторых из них соединения, обладающие противовирусным эффектом в отношении патогенных для человека вирусов [4-7, 13].
Экстракты из базидиальных грибов подавляли репродукцию вирусов гриппа, ортопоксвирусов, ВПГ 1 и 2 типов, вируса Западного Нила, ВИЧ, вируса гепатита В [13-17].
Особый интерес представляют соединения из гриба чага, Inonotus obliquus, который содержит широкий спектр биологически активных веществ, основным компонентом которых является меланин.
В разных научных коллективах получены сходные данные о выраженном антиретровирусном и про-тивогерпетическом эффекте соединений из Inonotus obliquus [17-20]. Эффективные в отношении ВИЧ-1 ингибирующие концентрации препаратов расположены в пределах 0,5-100 мкг/мл и, несомненно, зависят от технологических моментов получения соединений.
Следует отметить, что противовирусная активность меланиновых соединений установлена как при профилактической (за 2 ч до инфицирования клеток), так и при лечебной схеме введения препаратов как в отношении ВИЧ-1, так и ВПГ-1.
У препаратов, полученных из базидиомицетов, имеется также вирулицидная активность. В работе И.А. Разумова и соавт. (2010) [21] описана противовирусная активность водных экстрактов и по-лисахаридных фракций, полученных из мицелия и плодовых тел высших грибов. Однако из схемы экспериментов следует, что вирусы первоначально инкубировались с исследуемыми соединения-
ми в течение 1 ч, а затем эту суспензию вносили в культуру клеток. Это означает, что фактически исследована вирулицидная активность веществ, т.к. препараты, действующие на вирус вне клетки, называют вирулицидными, а препараты, действующие внутри клетки, - противовирусными.
Источниками гуминовых кислот служат бурый уголь, торф, лечебные грязи. В этих случаях обнаружена противовирусная активность в отношении вирусов гриппа человека и птиц, вирусов герпеса, ВИЧ [6, 9, 10, 22]. Время добавления препаратов показывает, что ГС обладают противовирусной активностью как на стадии проникновения ВИЧ в клетку, так и на стадии обратной транскрипции РНК в ДНК, а также на стадии интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина [11, 23, 24]. Влияние полимера гуми-новой кислоты на раннюю стадию репликации герпе-свируса было подтверждено результатами экспериментов на животных [25].
Нами также подтверждена противовирусная эффективность ГС, полученных на основе бурого угля Канско-Ачинского месторождения, в отношении ВИЧ-1 и ВПГ-1.
Наличие у ГС из угля вирулицидной активности, по нашему мнению, требует экспериментального уточнения. В работе Г.В. Корнилаевой и соавт. (2010) [26] предлагается применение этих препаратов в качестве микробицидных средств в связи с их высоким индексом селективности. В описании исследований указывается, что клетки предварительно инкубировали с соединениями, затем заражали вирусом (ВИЧ-1) и после 24 ч инкубации клеток с вирусом в присутствии препаратов не связавшийся вирус удаляли низкоскоростным центрифугированием. Это означает, что контакта вируса с препаратом вне клетки не было.
Анализируя наш опыт, а также опыт коллег в исследованиях активности веществ при одновременном инфицировании клеток и добавлении препаратов на определенный период времени, необходимо отметить, что фактически изучались два вида активности: противовирусная и вирулицидная. С одной стороны, действие соединений на вирус вне клетки - вирули-цидный эффект, а с другой - на вирус, который попал в клетку, - противовирусный эффект.
Только в случае внесения препарата в уже зараженные клетки можно говорить об «истинно» противовирусном действии. Однако и здесь требуется уточнение -если исследуемое вещество осталось в культураль-ной среде до момента учета результатов, то вполне вероятна возможность действия препарата вне клетки на вирионы, выходящие из инфицированных клеток, что представляет собой вирулицидный эффект.
Результаты исследования противовирусной активности меланина и ГС в отношении РНК-содер-жащего вируса ВИЧ-1 и ДНК-содержащего вируса ВПГ-1 в нашем исследовании совпадают с результатами ряда авторов в отношении вирусов гриппа, герпеса, ВИЧ, гепатита В, Коксаки, осповакцины [8, 10, 11, 13-16, 18, 22-25], что позволяет высказать
предположение о том, что тип нуклеиновой кислоты у вируса не играет принципиальной роли в антивирусном действии этих препаратов. Очевидно также, что ГС эффективны как в отношении вирусов с оболочкой, так и безоболочечных вирусов.
Заключение
В целом можно заключить, что для меланиновых и гуминовых соединений характерна низкая токсичность при наличии и вирулицидной, и противовирусной активности. Это позволяет рассматривать исследованные соединения как основу для создания безопасных лекарственных средств, эффективных в отношении возбудителей различных вирусных инфекций.
Литература
1. Руководство по применению антиретровирусных препаратов у взрослых и подростков, инфицированным ВИЧ-1. М.: Р.Ва-лент; 2011.
2. Носик Д.Н., Носик Н.Н. ВИЧ-инфекция: профессиональный риск и экстренная профилактика. М.; 2004.
3. Смирнов Ю.А., Носик Н.Н., Носик Д.Н. Подходы к фитотерапии ВИЧ-инфекции. Традиционная медицина. 2017; 4(51): 26-34.
4. Теплякова Т.В. Высшие грибы Западной Сибири - перспективные объекты для биотехнологии лекарственный: препаратов. Новосибирск; 2014.
5. Lopusiewicz L. Isolation, characterisation and biological activity of melanin from Exidia nigricans. WorldSci. News. 2018; 91: 111-29.
6. Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 1. Биохимический аспект (обзор литературы). Вестник Российской Академии естественный: наук. 2016; 16(1): 11-8.
7. Ананько Г.Г., Казачинская Е.И., Косогова Т.А., Теплякова Т.В. Механизмы антигерпетической активности меланина чаги (Inonotus obliquus). В кн.: Дьяков Ю.Т., Сергеев Ю.В., ред. Современная микология в России. Материалы четвертого съезда микологов России. Том 7. М.; 2017: 395-7.
8. Pan H.H., Yu X.T., Li T., Wu H.L., Jiao C.W., Cai M.H., et al. Aqueous extract from a Chaga medicinal mushroom, Inonotus obliquus (higher Basidiomycetes), prevents Herpes Simplex Virus entry through inhibition of viral-induced membrane fusion. Int. J. Med. Mushrooms. 2013; 15(1): 29-38. https://doi.org/10.1615/intjmed-mushr.v15.i1.40
9. Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект. Обзор литературы. Вестник Российской Академии естественный: наук. 2016; 16(5): 9-15.
10. Jacob K.K., Prashob P.K.J., Chandramohanakumar N. Humic substances as a potent biomaterials for therapeutic and drug delivery system - a review. Int. J. App. Pharm. 2019; 11(3): 1-4. https://doi. org/10.22159/ijap.2019v11i3.31421
11. Kornilaeva G.V., Siniavin A.E., Schultz A., Germann A., Moog C., Von Briesen H., et al. The differential Anti-HIV effect of a new humic substance-derived preparation in diverse cells of the immune system. Acta Naturae. 2019; 11(2): 68-76. https://doi. org/10.32607/20758251-2019-11-2-68-76
12. Теплякова Т.В., Ананько Г.Г., Ильичева Т.Н., Казачинская Е.И., Носик Н.Н., Носик Д.Н. и др. Противовирусное средство на основе гуминовых кислот. Патент РФ №2678986; 2019.
13. Рытик П.Г., Горовой Л.Ф., Кучеров И.И., Сенюк О.Ф. Антире-тровирусная активность некоторых видов базидиальных грибов. СПИД, рак и общественное здоровье. 2007; 11(1): 59-61.
14. Brandt C.R., Pirano F. Mushroom antiviral. Recent Res. Dev. Anti-microb. Agent Chemother. 2000; 4(1): 11-26.
15. Теплякова Т.В., Булычев Л.Е., Косогова Т.А., Ибрагимова Ж.Б., Юрганова И.А., Кабанов А.С. и др. Противовирусная активность экстрактов из базидиальных грибов в отношении ортопоксвиру-сов. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; (3): 99-101.
16. Gao Y., Zhou Sh., Huang M., Xu A. Antibacterial and antiviral value of the genus Ganoderma P.Karst. Species (Aphyllophoromy-cetideae): a review. Int. J. Med. Mushroom. 2003; 5(3): 235-46. https://doi.org/10.1615/InterJMedicMush.v5.i3.20
ORIGINAL RESEARCH
17. Теплякова Т.В., Гашникова Н.М., Балахнин С.М., Косогова Т.А. Антиретровирусная активность экстрактов из чаги, меланина и гуминовых соединений. В кн.: Современная микология в России. Материалы 3-го съезда микологов России. Том 3. М.; 2012: 419-20.
18. Разумов И.А., Казачинская Е.А., Пучкова Л.И., Косогова Т.А., Горбунова И.А., Локтев В.Б. и др. Протективная активность водных экстрактов из высших грибов при экспериментальной герпесвирусной инфекции у белых мышей. Антибиотики и химиотерапия. 2013; 58(9-10): 8-12.
19. Полковникова М.В., Носик Н.Н., Гараев Т.М., Кондрашина Н.Г., Финогенова М.П., Шибнев В.А. Изучение противогерпетиче-ских свойств экстрактов из березового гриба Inonotus obliquus. Вопросы вирусологии. 2014; 59(2): 45-8.
20. Шибнев В.А., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Калнина Л.Б., Носик Д.Н. Противовирусное действие водных экстрактов березового гриба Inonotus obliquus на вирус иммунодефицита человека. Вопросы вирусологии. 2015; 60(2): 35-8.
21. Разумов И.А., Косогова Т.А., Казачинская Е.А., Пучкова Л., Щербакова Н.С., Горбунова И.А. и др. Противовирусная активность водных экстрактов и полисахаридных фракций, полученных из мицелия и плодовых тел высших грибов. Антибиотики и химиотерапия. 2010; 55(9-10): 14-8.
22. Ilycheva T.N., Balakhnin S.M., Gashnikova N.M., Durymanov
A.G., Anan'ko G.G., Kosogova T.A., et al. Antiviral Activity of Hu-mic Substances. In: Third International Conference of CIS IHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference daRostim «Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture» HIT-daRostim-2014. Moscow; 2014.
23. Schneider J., Weis R., Maenner C., Kary B., Werner A., Stubert B.J., et al. Inhibition of HIV-1 in cell culture by synthetic humate analogues derived from hydroquinone: mechanism of inhibition. Virology. 1996; 218(2): 389-95. https://doi.org/10.1006/viro.1996.0208
24. Zhernov Y., Karamov E., Perminova I., Khaitov M.R., Khaitov R.M. Humic substance-based antivirals: antiretroviral activity, mechanisms of action, and impact on mucosal immunity. Allergy. 2017; 72(S103): 164-5.
25. Neyts J., Snoeck R., Wutzler P., Cushman M., Klocking R., Helbig
B., et al. Poly (hydroxy) carboxylates as selective inhibitors of Cytomegalovirus and Herpes simplex virus replication. Antivir. Chem. Chemother. 1992; 3(4): 215-22.
26. Корнилаева Г.В., Перминова И.В., Гилязова А.В., Хаметова К.М., Каратов Э.В. Гуминовые вещества как перспективные соединения для создания микробицидных препаратов. Российский иммунологический журнал. 2010; 4(3): 255-60.
REFERENCES
1. Guidelines for the use of antiretroviral drugs in adults and adolescents infected with HIV-1 [Rukovodstvo po primeneniyu antiretrovirusnykh preparatov u vzroslykh i podrostkov, infitsirovannykh VICh-1]. Moscow: R.Valent; 2011. (in Russian)
2. Nosik D.N., Nosik N.N. HIV Infection: Occupational Risk and Emergency Prevention [VICh-infektsiya: professional 'nyy risk i ekstrennayaprofilaktika]. Moscow; 2004. (in Russian)
3. Smirnov Yu.A., Nosik N.N., Nosik D.N. Approaches to phytotherapy of HIV infection. Traditsionnaya meditsina. 2017; 4(51): 26-34. (in Russian)
4. Teplyakova T.V. Higher Mushrooms ofWestern Siberia - Promising Objects for Biotechnology of Medicinal Products [Vysshie griby Zapadnoy Sibiri - perspektivnye ob"ekty dlya biotekhnologii lekarstvennykhpreparatov]. Novosibirsk; 2014. (in Russian)
5. Lopusiewicz L. Isolation, characterisation and biological activity of melanin from Exidia nigricans. WorldSci. News. 2018; 91: 111-29.
6. Popov A.I., Zelenkov V.N., Teplyakova T.V. Biological activity and biochemistry of humic substances. Part 1. Biochemical aspect (a review). Vestnik Rossiyskoy Akademii estestvennykh nauk. 2016; 16(1): 11-8. (in Russian)
7. Anan'ko G.G., Kazachinskaya E.I., Kosogova T.A., Teplyakova T.V. Mechanisms of antiherpetic activity of chaga melanin (Inonotus obliquus). In: D'yakov Yu.T., Sergeev Yu.V., ed. Modern Mycology in Russia. Materials of the fourth Congress of mycologists ofRussia. Volume 7 [Sovremennaya mikologiya v Rossii. Materialy chetvertogo s"ezdamikologovRossii. Tom 7]. Moscow; 2017: 395-7. (in Russian)
8. Pan H.H., Yu X.T., Li T., Wu H.L., Jiao C.W., Cai M.H., et al. Aqueous extract from a Chaga medicinal mushroom, Inonotus obliquus (higher Basidiomycetes), prevents Herpes Simplex Virus entry through inhibition of viral-induced membrane fusion. Int.
J. Med Mushrooms. 2013; 15(1): 29-38. https://doi.org/10.1615/ intjmedmushr.v15.i1.40
9. Popov A.I., Zelenkov V.N., Teplyakova T.V. Biological activity and biochemistry of humic substances. Part 2. Medico-biological aspect (a review). Vestnik Rossiyskoy Akademii estestvennykh nauk. 2016; 16(5): 9-15. (in Russian)
10. Jacob K.K., Prashob P.K.J., Chandramohanakumar N. Humic substances as a potent biomaterials for therapeutic and drug delivery system - a review. Int. J. App. Pharm. 2019; 11(3): 1-4. https://doi. org/10.22159/ijap.2019v11i3.31421
11. Kornilaeva G.V., Siniavin A.E., Schultz A., Germann A., Moog C., Von Briesen H., et al. The differential Anti-HIV effect of a new humic substance-derived preparation in diverse cells of the immune system. Acta Naturae. 2019; 11(2): 68-76. https://doi. org/10.32607/20758251-2019-11-2-68-76
12. Teplyakova T.V., Anan'ko G.G., Il'icheva T.N., Kazachinskaya E.I., Nosik N.N., Nosik D.N., et al. Antiviral agent based on humic acids. Patent RF № 2678986; 2019. (in Russian)
13. Rytik P.G., Gorovoy L.F., Kucherov I.I., Senyuk O.F. Anti-Retrovi-ral activity of some types of basidial fungi. SPID, rak i obshchest-vennoe zdorov'e. 2007; 11(1): 59-61. (in Russian)
14. Brandt C.R., Pirano F. Mushroom antiviral. Recent Res. Dev. Anti-microb. Agent Chemother. 2000; 4(1): 11-26.
15. Teplyakova T.V., Bulychev L.E., Kosogova T.A., Ibragimova Zh.B., Yurganova I.A., Kabanov A.S., et al. Antiviral activity of extracts from basidiomycetes for orthopoxviruses. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; (3): 99-101. (in Russian)
16. Gao Y., Zhou Sh., Huang M., Xu A. Antibacterial and antiviral value of the genus Ganoderma P.Karst. Species (Aphyllophoromy-cetideae): a review. Int. J. Med. Mushroom. 2003; 5(3): 235-46. https://doi.org/10.1615/InterJMedicMush.v5.i3.20
17. Teplyakova T.V., Gashnikova N.M., Balakhnin S.M., Kosogova T.A. Anti-Retroviral activity of extracts from chaga, melanin and humic compounds. In: Modern Mycology in Russia. Materials of the 3rd Congress of mycologists of Russia. Volume 3 [Sovremennaya mikologiya v Rossii. Materialy 3-go s"ezda mikologov Rossii. Tom 3]. Moscow; 2012: 419-20. (in Russian)
18. Razumov I.A., Kazachinskaya E.A., Puchkova L.I., Kosogova T.A., Gorbunova I.A., Loktev V.B., et al. Protective activity of aqueous extracts from higher mushrooms against Herpes sipmlex virus type-2 on albino mice model. Antibiotiki i khimioterapiya. 2013; 58(9-10): 8-12. (in Russian)
19. Polkovnikova M.V., Nosik N.N., Garaev T.M., Kondrashina N.G., Finogenova M.P., Shibnev V.A. A study of the antiherpetic activity of the chaga mushroom (Inonotus obliquus) extracts in the vero cells infected with the herpes simplex virus. Voprosy virusologii. 2014; 59(2): 45-8. (in Russian)
20. Shibnev V.A., Garaev T.M., Finogenova M.P., Kalnina L.B., Nosik D.N. Antiviral activity of aqueous extracts of the birch fungus Inonotus obliquus on the human immunodeficiency virus. Voprosy virusologii. 2015; 60(2): 35-8. (in Russian)
21. Razumov I.A., Kosogova T.A., Kazachinskaya E.A., Puchkova L., Shcherbakova N.S., Gorbunova I.A., et al. Antiviral activity of aqueous extracts and polysaccharide fractions from mycelium and fruit bodies of higher fungi. Antibiotiki i khimioterapiya. 2010; 55(9-10): 14-8. (in Russian)
22. Ilycheva T.N., Balakhnin S.M., Gashnikova N.M., Durymanov
A.G., Anan'ko G.G., Kosogova T.A., et al. Antiviral Activity of Hu-mic Substances. In: Third International Conference of CIS IHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference daRostim «Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture» HIT-daRostim-2014. Moscow; 2014.
23. Schneider J., Weis R., Maenner C., Kary B., Werner A., Stubert B.J., et al. Inhibition of HIV-1 in cell culture by synthetic humate analogues derived from hydroquinone: mechanism of inhibition. Virology. 1996; 218(2): 389-95. https://doi.org/10.1006/viro.1996.0208
24. Zhernov Y., Karamov E., Perminova I., Khaitov M.R., Khaitov R.M. Humic substance-based antivirals: antiretroviral activity, mechanisms of action, and impact on mucosal immunity. Allergy. 2017; 72(S103): 164-5.
25. Neyts J., Snoeck R., Wutzler P., Cushman M., Klöcking R., Helbig
B., et al. Poly (hydroxy) carboxylates as selective inhibitors of Cy-tomegalovirus and Herpes simplex virus replication. Antivir. Chem. Chemother. 1992; 3(4): 215-22.
26. Kornilaeva G.V., Perminova I.V., Gilyazova A.V., Khametova K.M., Karatov E.V. Humic acids as the promising ingredient for microbicides design. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2010; 4(3): 255-60. (in Russian)
