CC BY
49
DOI: 10.37489/0235-2990-2019-64-11-12-25-30
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Определение чувствительности штамма вируса гриппа A(H7N9) к противовирусным препаратам in vitro и in vivo
*М. А. СКАРНОВИЧ, М. О. СКАРНОВИЧ, Л. Н. ШИШКИНА, Н. И. БОРМОТОВ, А. Б. РЫЖИКОВ, А. П. АГАФОНОВ
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская обл., п. Кольцово
Determination of Sensitivity of Influenza Virus Strain A(H7N9) to Antiviral Drugs In Vitro and In Vivo
*M. A. SKARNOVICH, M. O. SKARNOVICH, L. N. SHISHKINA, N. I. BORMOTOV, A. B. RYZHIKOV, A. P. AGAFONOV
State Research Center of Virology and Biotechnology Vector, Novosibirsk region, Koltsovo
Исследована фенотипическая чувствительность штамма вируса гриппа A/Anhui/1/2013 (H7N9) к противовирусным препаратам различного механизма действия в культуре клеток MDCK и в опытах на аутбредных мышах ICR. В экспериментах in vitro штамм вируса гриппа A/Anhui/1/2013 (H7N9) проявлял наиболее высокую чувствительность к Тамифлю, тогда как к Ингавирину и Римантадину чувствительность данного штамма вируса гриппа была менее выраженной. В экспериментах in vivo штамм A/Anhui/1/2013 (H7N9) проявлял абсолютную чувствительность только к Тамифлю при исследовании таких показателей как титры вируса в лёгких, коэффициент защиты и средняя продолжительность жизни животных. Чувствительности данного штамма вируса гриппа к Ингавирину в использованной дозе и схеме введения in vivo обнаружено не было. К Римантадину чувствительность данного штамма in vivo была значительно более слабой, чем к Тамифлю, и проявлялась только в снижении титров вируса в лёгких через 3 сут после заражения мышей.
Ключевые слова: вирус гриппа A(H7N9), чувствительность к препарату, противовирусная активность, in vitro, in vivo.
The phenotypic sensitivity of the influenza virus strain A/Anhui/1/2013 (H7N9) to antiviral drugs with different mechanisms of action in the MDCK cell culture and in outbred ICR mice experiments was observed. The A/Anhui/1/2013 (H7N9) strain of influenza virus showed the highest sensitivity to Tamiflu in in vitro experiments, whereas the sensitivity of this influenza virus strain to Rimantadine and Ingavirin was less pronounced. The A/Anhui/1/2013 (H7N9) strain exhibited absolute sensitivity only to Tamiflu in in vivo studies of such factors as virus titers in the lungs, the protection factor, and the average life expectancy of the animals. The sensitivity of this strain of influenza virus to Ingavirin was not detected in dose and administration regimen used in vivo. Rimantadine sensitivity of this strain in vivo was significantly weaker than to Tamiflu, and manifested only in reducing viral titers in the lungs 3 days after the mice were infected.
Keywords: influenza virus A(H7N9), drug sensitivity, antiviral activity, in vitro, in vivo.
Высокий уровень заболеваемости гриппом во время ежегодных эпидемий, а также возможность развития тяжёлых осложнений заболевания остаются актуальными медицинскими и социально-экономическими проблемами здравоохранения. Сезонная заболеваемость вызывается штаммами вируса гриппа А двух субтипов НШ1 и НЗШ, при этом каждый год возникают их разновидности с изменёнными генетическими и биологическими свойствами. Кроме того, практически ежегодно появляется информация о возникновении вспышек заболеваний, вызванных новыми штаммами вируса гриппа, которые раньше не выявлялись у людей, и представляют собой реассортанты субтипов вируса
© Коллектив авторов, 2019
*Адрес для корреспонденции: E-mail: skarnovich ma@vector.nsc.ru
гриппа А, циркулирующих в популяциях людей, птиц и свиней [1].
В марте 2013 г. органы здравоохранения Китая сообщили о трёх случаях лабораторно подтверждённого заражения людей вирусом гриппа птиц A(H7N9) [2]. Уже через 2 мес. после первого сообщения было зарегистрировано 132 случая заражения вирусом гриппа птиц A(H7N9), 39 из них закончились смертельным исходом [3]. По данным CDC (Centers for Disease Control and Prevention) Китая, на 24 февраля 2017 г. зарегистрировано 1258 лабораторно подтверждённых случаев заражения вирусом гриппа птиц A(H7N9), из которых 516 (41%) случаев закончились смертельным исходом [4]. У большинства пациентов первоначально развивалось гриппоподобное заболевание, которое впоследствии прогрессировало до респираторного дистресс-синдрома, приводившего к госпитализации [5, 6]. Многие пациен-
ты, заболевшие гриппом A(H7N9), контактировали с домашней птицей, как правило, на рынках живой птицы [5, 6]. В настоящее время не существует вакцины от гриппа A(H7N9). Исследования штаммов вируса гриппа A(H7N9), выделенных от человека, свидетельствуют о том, что они устойчивы к адамантановым противовирусным химиопрепаратам, но восприимчивы к ингибиторам нейраминидазы — Озельтамивиру, Занами-виру и Перамивиру [7, 8].
Антивирусная терапия является важнейшей составляющей комплексного лечения гриппа. Например, как было показано, вирус гриппа A(H1N1)pdm09 чувствителен к Осельтамивиру и Занамивиру, а также Ингавирину, поэтому Министерство здравоохранения Российской Федерации рекомендует эти препараты для лечения тяжёлого и осложнённого гриппа [9]. Вместе с тем к настоящему времени отсутствует информация о чувствительности вируса гриппа A(H7N9) к официально разрешённым противогриппозным препаратам с иными механизмами действия, чем ингибиторы нейраминидазы и М2-белка вируса.
Цель исследования — оценка фенотипичес-кой чувствительности штамма вируса гриппа A/Anhui/1/2013 (H7N9) к противовирусным препаратам (Тамифлю, Римантадин и Ингавирин) в культуре клеток MDCK и в экспериментах на аут-бредных мышах ICR.
Материал и методы
В работе использовали штамм вируса гриппа (ВГ) A/Anhui/1/2013 (H7N9), полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, доставленный туда из Сотрудничающего Центра ВОЗ (Китай). Штамм прошёл 4 пассажа на 9-10-суточных куриных эмбрионах (КЭ). Для наработки вируса КЭ заражали в аллантоисную полость и инкубировали в течение 2 сут при 37°С, после чего собирали вирус-содержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ), осветляли центрифугированием при 4500 g в течение 1 ч при 0°С. Концентрацию вируса в ВАЖ определяли путём титрования в культуре клеток MDCK [10], рассчитывали и выражали в lg ТЦД50/мл (десятичных логарифмах 50% тканевых цитопатических доз в мл) по методу Спирмена—Кербера [11]. Значения титров вируса были представлены как M+I95, где M — среднее значение, I95 — 95% доверительный интервал. Концентрация вируса в ВАЖ составляла 10,50+0,46 lg ТЦД50/мл. Наработанную и использованную в работе серию ВАЖ с указанным титром хранили при температуре минус 70°С.
Для определения концентрации (титра) ВГ в работе использовали культуру клеток MDCK (эпителиоподобные клетки из почки самки кокер-спаниеля), полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнад-зора. Клетки культивировали в 96-луночных культуральных планшетах до формирования полного монослоя в среде DMEM («Биолот», Россия) с использованием 10% сыворотки плодов коров («HyClone», США) и антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, Россия) при 37°С и 5% СО2. В лунки вносили по 100 мкл последовательных десятикратных разведений вируса, приготовленных в среде DMEM («Биолот», Россия), содержащей 2 мкг/мл ТРСК трипсина («Sigma», США) и 0,2% бычьего сывороточного аль-
бумина («Sigma», США) [10]. Инфицированные клетки инкубировали в течение 4—5 сут при 37°С и 5% СО2. Результаты учитывали визуально по цитопатическому действию вируса и в реакции гемагглютинации с 0,5% суспензией куриных эритроцитов, титр вируса рассчитывали по методу Спирме-на—Кербера и выражали в lg ТЦО^/мл [11].
В исследованиях in vivo использовали мышей аутбредной популяции ICR (обоего пола, массой 13—15 г), полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды, согласно ветеринарному законодательству, и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях [12].
Для определения 50% летальной дозы (ЛД50) ВГ по 6 мышей интраназально инфицировали десятикратными разведениями ВГ, вводя по 40 мкл суммарно в обе ноздри, что соответствовало дозам 1031, 1041, 1051, 1061, 1071, 1081 и 1091 ТЦД50/мышь. В течение последующих 16 сут регистрировали гибель животных в каждой группе. На основании полученных данных о гибели животных рассчитывали титр ВГ в lg ЛД50/мл (+I95) и выражали величину ЛД50 в lg ТЦД50/мышь (±195) по методу Спирмена—Кербера [11]. При исследовании чувствительности штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) к препаратам in vivo для интраназально-го заражения мышей использовали 10 ЛД50 ВГ/мышь.
В работе использовали коммерчески доступные в аптечной сети противовирусные препараты: ингибитор нейраминидазы — Тамифлю (Озельтамивира фосфат, Ля Рош Лтд., Швейцария), ингибитор М2-белка — Римантадин (Риманта-дина гидрохлорид, ОАО «Биосинтез», Россия) и ингибитор миграции вновь синтезированного белка NP вируса из цитоплазмы в ядро — Ингавирин (Имидазолилэтанамид пентан-диовой кислоты, ОАО «Валента Фармацевтика», Россия).
В культуре клеток препараты применяли в нетоксических для клеток MDCK концентрациях, установленных и использованных ранее в экспериментах in vitro с другими субтипами ВГ А [13, 14]: Тамифлю — 50 и 100 мкг/мл, Римантадин — 5 и 10 мкг/мл и Ингавирин — 100 и 200 мкг/мл. Фенотипическая чувствительность штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) к исследуемым препаратам оценивалась по изменению его инфекци-онности (титра) в культуре клеток MDCK по сравнению с контролем. При этом использовали 2 схемы внесения препаратов: в лунки 96-луночных планшетов с клеточным монослоем вносили по 150 мкл определённых разведений препаратов за 1 ч до или через 1 ч после инокуляции ВГ. Заражение клеточного монослоя осуществляли десятикратными разведениями ВГ (с 1-го по 10-е) в объёме 100 мкл. В контроле ВГ вместо препаратов использовали питательную среду в объёме 150 мкл. Через 5 сут культивирования инфицированного монослоя клеток определяли титры ВГ (в lg ТЦД50/мл) и отличия между ними в каждой схеме применения препаратов и в соответствующем контроле по методу Спирмена—Кербера [11]. Кроме того, высчитывали индекс нейтрализации ВГ под влиянием препаратов (ИН, в lg), где ИН = Титр вируса в контроле — Титр вируса в опыте (lg) [15].
При оценке фенотипической чувствительности штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) к исследуемым препаратам в экспериментах на животных растворённые в дистиллированной воде препараты вводили перорально в объёме 0,2 мл через 1 ч после заражения и далее в течение 5 сут в дозах, ранее исследуемых нами в отношении других субтипов ВГ [13, 16]: Тамифлю 15 мкг/г массы мыши (2 раза в день), Римантадин 25 мкг/г (2 раза в день), Ингавирин 45 мкг/г (1 раз в день). Дозы препаратов для введения лабораторным животным рассчитывали с учётом доз, рекомендованных для человека, и зависимости скорости метаболизма введённого вещества от соотношения площади поверхности тела и массы животного [15, 17]. Инфицированным мышам в контрольной группе вместо препаратов вводили 0,2 мл дистиллированной воды 2 раза в день. Гибель животных регистрировали в течение 16 сут наблюдения после заражения ВГ. В каждой группе определяли долю выживших
Таблица 1. Инфекционность (титры) штамма ВГ А/АпИш/1/2013 (И7М9) в монослое клеток МйСК в присутствии препаратов в среде культивирования
Препараты (концентрация Схема применения препаратов
в среде культивирования) за 1 ч до заражения через 1 ч после заражения
титр вируса, ИН титр вируса, ИН
¡8 ТЦЦ50/мл (¡8) ¡8 ТЦЦ50/мл (18)
(М±195, и=6) (М±195, и=6)
Тамифлю (50 мкг/мл) 7,00+0,53* ** 3,50 7,00+0,53* ** 3,50 ~
Тамифлю (100 мкг/мл)_7,50+0,00* **_3,00_7,67+0,53* **_2,83_
Римантадин (5 мкг/мл)_8,83+0,55*_1,67_8,83+0,41*_1,67_
Римантадин (10 мкг/мл)_8,83+0,41*_1,67_9,17+0,41*_1,33_
Ингавирин (100 мкг/мл)_9,17+0,41*_1,33_9,33+0,33*_1,17_
Ингавирин (200 мкг/мл)_9,00+0,53*_1,50_8,83+0,41*_1,67_
Контроль ВГ (без препаратов) 10,50+0,53 10,50+0,33
Примечание. * — отличие от контроля при р<0,01; ** - отличие от всех других показателей в соответствующей схеме внесения препаратов при р<0,01; п — число лунок с монослоем клеток, инфицированных разными разведениями вируса; М - среднее значение и 195 — 95%-й доверительный интервал, рассчитанные по методу Спирмена-Кербера.
животных, рассчитывали коэффициент защиты (КЗ = % гибели в контроле — % гибели в опыте) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей. При оценке СПЖ учитывали число животных, проживших определённое количество дней после заражения до гибели и число выживших животных. За максимальное значение продолжительности жизни для выживших животных принимали 16 сут после заражения ВГ, т. е. гарантированное время прекращения гибели инфицированных мышей, что было установлено эмпирически при многократном повторении аналогичных экспериментов [18]. Кроме того, через 1, 3, 5 и 8 сут после инфицирования определяли титры ВГ (в lg ТЦД,5о/мл) в 10% гомогенатах лёгких инфицированных мышей в контрольной и опытных группах.
Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли с помощью пакета компьютерных программ анализа данных «Statistica 7.0» [19]. Для проверки статистических гипотез о виде распределения показателей применяли критерий Колмогорова—Смирнова для вероятности ошибки — />0,10. Различия показателей титров вируса в лёгких между группами инфицированных животных оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и D-критерия Манна—Уитни. Показатели СПЖ представлены в виде M+I95, где M — среднее арифметическое значение и I95 — доверительный интервал. Сравнение СПЖ мышей в разных группах проводили с использованием D-критерия Манна—Уитни. Различия показателей выживаемости животных оценивались с помощью кривых Ка-плана—Мейера по логранговому критерию [19]. Кроме того, при сравнении групп по доле выживших животных использовали критерий х2 с учётом поправки Йетса для малых выборок. Отличия считались статистически значимыми при /><0,05 [19].
Результаты исследования
Фенотипическая чувствительность штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) к исследуемым противовирусным препаратам оценивалась in vitro по изменению его инфекционности (титра) в культуре клеток MDCK при использовании 2 схем внесения препаратов: за 1 ч до и через 1 ч после заражения монослоя.
Было обнаружено, что штамм ВГ A/Anhui/ 1/2013 (H7N9) in vitro наиболее чувствителен к Тамифлю при обеих исследованных концентрациях и схемах применения, поскольку индексы нейтрализации ВГ в присутствии Тамифлю были наиболее высокими (табл. 1). Снижение титров штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) в присутст-
вии Римантадина и Ингавирина тоже происходило при обеих исследованных концентрациях и схемах применения, но было менее выраженным, чем в присутствии Тамифлю (табл. 1).
Далее быша проведена оценка фенотипичес-кой чувствительности штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) к противовирусным препаратам в экспериментах на мышах аутбредной популяции ICR. Для этого предварительно оценили величину ЛД50 вируса для этого вида животныгх при интра-назальном способе инфицирования. Бышо показано, что титр используемого в работе ВГ составлял 5,27±0,60 lg ЛД50/мл, а величина ЛД50, соответственно, была равна 5,23±0,46 lg ТЦД50/мышь. Для заражения мышей в экспериментах при введении противовирусных препаратов данный штамм ВГ использовали в дозе 10 ЛД50 (6,23±0,46 lg ТЦД50/мышь).
Чувствительность штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) к противовирусным препаратам in vivo определяли по изменению его репродукции в лёгких через 1, 3, 5 и 8 сут после заражения мышей в группах, получавших препараты, в сравнении с соответствующими значениями в контрольной группе.
В табл. 2 представлена динамика накопления ВГ в лёгких мышей в зависимости от времени после заражения штаммом ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9). Из приведённых данныгх следует, что уже через 8 сут продукция вируса снижалась и не отличалась во всех группах. Как бышо обнаружено, в экспериментах in vivo данный штамм ВГ обладал наибольшей чувствительностью к Тамифлю, о чём свидетельствует достоверное уменьшение титров вируса в лёгких мышей через 1, 3 и 5 сут после заражения при введении Тамифлю (табл. 2). При этом чувствительность к Римантадину быша выражена меньше, поскольку достоверное снижение продукции вируса в лёгких относительно контроля наблюдалось только через 3 сут после заражения. Чувствительности данного штамма вируса
Таблица 2. Определение чувствительности вируса гриппа (ВГ) А/АпИш/1/2013 (И7М9) к противовирусным препаратам по динамике накопления ВГ в лёгких мышей при и/н заражении в дозе 10 ЛД50
Группы животных, получавших препараты, Титры ВГ (lg ТЦЦ50/мл) в лёгких мышей
и контрольная группа в разные сроки после заражения, M+I95
1 сут, n=5 3 сут, n=5 5 сут, n=5 8 сут, n=4
Тамифлю, 15 мкг/г 4,57+0,49* 6,30+0,23* 5,40+0,99* 0,90+0,56**
Римантадин, 25 мкг/г 5,57+0,29 5,70+0,17* 6,00+0,15 0,73+0,57**
Ингавирин, 45 мкг/г 5,70+0,40 6,50+0,15 5,90+0,33 0,60+0,17**
Контроль ВГ 5,30+0,45 6,70+0,35 6,40+0,63 0,70+0,29**
Примечание. * — отличие от Контроля по ^-критерию Стьюдента и ¿/-критерию Манна-Уитни при р<0,05; ** -отличие от показателей в соответствующей группе в предыдущие сроки исследования по ^-критерию Стьюдента и ¿/-критерию Манна-Уитни при р< 0,001; М— среднее арифметическое значение, 195 — 95% доверительный интервал; п — число животных в группе.
Таблица 3. Определение чувствительности вируса гриппа (ВГ) А/АпИш/1/2013 (И7№) к противовирусным препаратам по показателям выживаемости мышей, инфицированных ВГ в дозе 10 ЛД50
Группы животных, Доза препарата Число и доля КЗ (%) СПЖ (сут),
получавших препараты, в мкг/г массы мыши# (%) выживших M+I95
и контрольная группа (схема введения) животных
Тамифлю (n=10) 15 (2 раза в день) 9**(90) 70 15,2+1,8*
Римантадин (n=10) 25 (2 раза в день) 5 (50) 30 11,8+3,2
Ингавирин (n=10) 45 (1 раз в день) 2 (20) 0 9,9+2,4
Контроль ВГ (n=10) 0 2 (20) — 9,0+2,8
Примечание. # - препараты вводили перорально в объёме 0,2 мл воды; * - отличие от Контроля по ¿/-критерию Манна-Уитни при p=0,005; ** - отличие от Контроля по критериюх2 с поправкой Йетса при p=0,007. Коэффициент защиты (КЗ) рассчитывали по формуле: КЗ = % гибели в контроле - % гибели в опыте. СПЖ - средняя продолжительность жизни (за максимальный срок жизни выживших животных принимали 16 сут, т. е. эмпирически установленное, гарантированное время прекращения гибели инфицированных ВГ мышей). М- среднее арифметическое значение; I95 - 95% доверительный интервал; n - число животных в каждой группе.
гриппа к Ингавирину в использованной дозе и схеме введения in vivo обнаружено не было, судя по отсутствию снижения титров ВГ относительно соответствующих контрольных показателей на всех сроках исследования (см. табл. 2).
Кроме того, проводили оценку чувствительности штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) к противовирусным препаратам in vivo по показателям выживаемости мышей при интраназальном заражении этим штаммом ВГ в дозе 10 ЛД50 и перо-ральном введении исследованных препаратов. Было обнаружено, что наиболее выраженной чувствительностью in vivo данный штамм ВГ обладал к Тамифлю (Озельтамивиру), о чём свидетельствует увеличение СПЖ и число выживших инфицированных животных (табл. 3). В экспериментах на животных при их инфицировании ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9), данный вирус не проявлял чувствительности к Ингавирину в выбранной нами дозе 45 мкг/г, о чём можно судить по отсутствию достоверного отличия от контроля по показателям СПЖ и доли выживших животных. В группе мышей, получавших Римантадин, также отсутствовали достоверные отличия от контроля по обоим показателям выживаемости (см. табл. 3).
Анализ кривых выживаемости Каплана-Мей-ера, представленных на рисунке, выявляет значимые отличия между контрольной группой мышей,
100
90 ■ ............ .У
10 ■
О -'-'-'-'-'-'-*-»-'-»-*-*-*-»-1-*-
О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Время после заражения вирусом гриппа (сут)
-Тамифлю — Ингавирин
— Ремантадин ......Контроль
Графики выживаемости животных, построенные по методу Каплана-Мейера, при заражении штаммом ВГ а/апИш/1/2013 (И7№) в дозе 10 ЛД50 в контрольной группе и при введении препаратов. Примечание. «+» — окончание срока наблюдения, т. е. эмпирически установленное, гарантированное время прекращения гибели мышей, инфицированных ВГ.
инфицированных штаммом ВГ A/Anhui/1/ 2013 (H7N9) в дозе 10 ЛД50, и группой инфицирован-ныгх мышей, получавших Тамифлю (р=0,00183). При этом отличий выживаемости инфицирован-ныгх мышей при введении Ингавирина от показателей в контрольной группе не было (^=0,48551), хотя в группе инфицированных мышей, получавших Римантадин, наблюдалась тенденция к повышению показателей выживаемости (р=0,10595).
Обсуждение результатов
В данной работе представлены результаты исследования фенотипической чувствительности штамма ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) к противовирусным препаратам, которую принято оценивать наряду с соответствующими известными генотипи-ческими маркерами [20]. Считают, что новые вирусы гриппа A(H7N9) являются первыми слабопатогенными вирусами гриппа птиц, которые, как было зарегистрировано, выгзышают тяжёлое заболевание у человека [21]. При этом генетические характеристики штаммов вируса гриппа A(H7N9) позволяют предположить наличие у них пандемического потенциала, поскольку они обладают способностью связываться с рецепторами вируса гриппа птиц и человека: остатками сиаловык кислот с а-2,3- и а-2,6-последовательностями, соответственно, и реплицироваться в организме человека [22].
Поскольку клеточные сиаловые рецепторы с а-2,3-последовательностью присутствуют на поверхности клеток респираторного тракта как у людей, так и у мышей, патогенетические характеристики штаммов вируса гриппа A(H7N9) были исследованы в экспериментах на мышах [23, 24]. Авторами данных публикаций было установлено, что ЛД50 штамма A/Anhui/1/2013 (H7N9) для мышей линии Balb/c составляла 3,4 lg БОЕ (бляшко-образующих единиц) [23] и 6,3 lg ТЦД50 [24]. Полученные нами и другими авторами величины ЛД50 изолятов ВГ субтипа A(H7N9), выделенных в 2013 г. в Китае, свидетельствуют о том, что при заражении лабораторный мышей они проявляли умеренные патогенные свойства по сравнению с высокопатогенным вирусом гриппа птиц A(H5N1) [23—25]. Вместе с тем, высокий уровень заболеваемости людей, вызванный вирусом гриппа птиц субтипа A(H7N9), и обнаружение его устойчивости к препаратам адамантанового ряда диктует необходимость исследования его чувствительности к различным по механизму действия противогриппозным препаратам.
В предыдущих наших исследованиях при использовании Римантадина чувствительными к нему in vitro и in vivo быши штаммы ВГ субтипов A(H3N2) и A(H5N1), а нечувствительными — штаммы пандемического ВГ A(H1N1) [14, 16]. При этом чувствительностью к Тамифлю и Инга-вирину при их использовании в таких же концен-
трациях in vitro и дозах in vivo обладали штаммы ВГ субтипов A(H3N2), A(H5N1) и A(H1N1) [13, 14, 16]. Полученные нами и данные литературы дают основания утверждать, что разные субтипы вируса гриппа A обладают неодинаковой чувствительностью к противогриппозным препаратам.
В данной работе впервые приведены обобщённые данные сравнительной оценки чувствительности штамма A/Anhui/1/2013 (H7N9) к противовирусным препаратам в экспериментах на клеточных культурах и лабораторных мышах. В проведённых нами исследованиях бышо обнаружено, что штамм ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) проявлял очень высокую чувствительность к Тамифлю в экспериментах как in vitro, так и in vivo, тогда как к Римантадину и Ингавирину его фенотипическая чувствительность быша выражена значительно меньше. С учётом того, что в данной работе и ранее [13, 14, 16] Риман-тадин и Ингавирин были использованы нами в максимальных дозах, превышающих в 20 раз дозы, рекомендованные для человека [15, 17], применение их в более высоких дозах in vivo для достижения чувствительности ВГ A(H7N9) являлось необоснованным. Полученные нами результаты подтверждают необходимость поиска новых лекарственных препаратов с различными механизмами действия в отношении высокопатогенного вируса гриппа A/H7N9 и исследования их активности с использованием моделей гриппозной инфекции in vitro и in vivo с целью лечения и предотвращения распространения заболеваний, вызванных субтипами вируса гриппа A с пандемическим потенциалом.
Заключение
Таким образом, в экспериментах in vitro было установлено, что штамм ВГ A/Anhui/1/2013 (H7N9) проявлял наиболее высокую фенотипиче-скую чувствительность к Тамифлю, в то время как к Ингавирину и Римантадину чувствительность данного штамма ВГ быша менее выраженной.
В экспериментах на мышах, интраназально инфицированных этим штаммом ВГ, бышо показано наличие его абсолютной чувствительности только к Тамифлю, что подтверждается достоверным снижением концентрации ВГ в лёгких, а также увеличением доли выживших животных и продолжительности их жизни. Чувствительности данного штамма вируса гриппа к Ингавирину в использованной дозе и схеме введения in vivo обнаружено не бышо. К Римантадину фенотипичес-кая чувствительность данного штамма in vivo была значительно более слабой, чем к Тамифлю, и проявлялась только в снижении титров вируса в лёгких через 3 сут после заражения мышей.
Результаты данных исследований были получены в рамках выполнения государственного задания ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
ЛИТЕРАТУРА
1. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Expert Opinion on neuraminidase inhibitors for prevention and treatment of influenza 2016 [26/01/2017]. URL: http://ecdc.europa.eu/en/publica-tions/publications/neuraminidase-inhibitors-flu-consultation.pdf.
2. Food and agriculture organization of the united nations, 2017. URL: http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/H7N9/back-ground.html.
3. Zhou J., Wang D, Gao R, Zhao B, Song J., Qi X. et al. Biological features of novel avian influenza A (H7N9) virus. Nature 2013; 61: 500-503.
4. Iuliano A.D., Jang Yu, Jones J., Davis C.T., Wentworth D.E., Uyeki T.M. et al. Increase in human infections with avian influenza A(H7N9) virus during the fifth epidemic — China, October 2016 — February 2017. Weekly / March 10, 2017; 66 (9): 254-255. URL: https://www.cdc.gov/mmwr/vol-umes/66/wr/mm6609e2.htm.
5. Gao R., Cao B, Hu Y, FengZ, Wang D, Hu W. et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus. The New England journal of medicine 2013; 368 (20): 1888-1897.
6. Li Q, Zhou L, Zhou M, Chen Z, Li F, Wu H. et al. Epidemiology of human infections with avian influenza A(H7N9) virus in China. The New England journal of medicine. 2013; 370: 520-532.
7. Watanabe T., Kiso M, Fukuyama S., Nakajima N, Imai M, Yamada S. et al. Characterization of H7N9 influenza A viruses isolated from humans. Nature 2013; 501 (7468): 551-555.
8. Cao R.Y., Xiano J.H., Cao B, Li S, Kumaki Y, Zhong W. Inhibition of novel reassortant avian influenza H7N9 virus infection in vitro with three antiviral drugs, oseltamivir, peramivir and favipiravir. Antivir Chem Chemother 2014; 23: 237-240, doi: 10.3851/IMP2672.
9. Методические рекомендации по диагностике и лечению гриппа. Министерство здравоохранения Российской Федерации, М.: 2016. URL: https://petrsu.ru/files/user/fdbd9903df09bb6f04f397450a13732b/ Recom_Flu.pdf.
10. Virology Methods Mannual Edited by: Brian W. J. Mahy and Hillar O. Kangro. Academic Press. 1996; 374.
11. ЗаксЛ.Статистическое оценивание. М.: Статистика, 1976. — 598 с. / Zaks L. Statisticheskoe otsenivanie. M.: Statistika; 1976; 598. [in Russian]
12. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Перевод с английского. Washington, D.C.: National Academy Press, 1996. — 138 с. / Rukovodstvo po soderzhanijyu i ispol'-zovanijyu laboratornykh zhivotnykh. Perevod s anglijskogo. Washington, D.C.: National Academy Press; 1996; 138. [in Russian]
13. Онищенко Г.Г., Агафонов А.П., Демина O.K., Сергеев A.A., Терновой В.А., Шишкина Л.Н. и др. Свойства штаммов пандемического вируса гриппа, выделенных на территории России. Проблемы особо опасных инфекций. — 2009. — Т. 101. — № 3. — С. 5-9. / Onishchenko G.G., Agafonov A.P., Demina O.K., Sergeev A.A., Ternovoj V.A., Shishkina L.N. i dr. Svojstva shtammov pandemicheskogo virusa grippa, vydelennykh na territorii Rossii. Problemy osobo opasnykh infektsij 2009; 101: 3: 5-9. [in Russian]
14. Шишкина Л.Н., Небольсин В.Е., Кабанов А.С., Скарнович М.О., Эр-дынеева У.Б., Мазуркова Н.А. и др. Изучение эффективности Инга-вирина® in vitro в отношении штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1/09)v. Антибиотики и химиотер. — 2010. — Т. 55. — № 3-4. С. 12-16. / Shishkina L.N, Nebol'sin V.E., Kabanov A.S., Skarnovich M.O., Erdyneeva U.B., Mazurkova N.A. i dr. Izuchenie effek-tivnosti Ingavirina® in vitro v otnoshenii shtammov pandemicheskogo virusa grippa A(H1N1/09)v. Antibiotiki i khimioter 2010; 55: 3-4: 12-16. [in Russian]
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Скарнович Мария Александровна — младший научный сотрудник отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская область, п. Кольцово
Скарнович Максим Олегович — научный сотрудник отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская область, п. Кольцово
Шишкина Лариса Николаевна — д. б. н., заведующая отделом профилактики и лечения особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская область, п. Кольцово
15. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ /Под ред. Хабриева Р.У. М.: Медицина, 2005. — 832 с. / Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izuchenijyu novykh farmakologicheskikh veshchestv /Pod red. Khabrieva R.U. M.: Meditsina, 2005; 832. [in Russian]
16. Шишкина Л.Н., Небольсин B.E., Скарнович M.O., Кабанов A.C., Сергеев A.A., Эрдынеева У.Б. и др. Изучение эффективности Ингавирина® in vivo в отношении штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1/09)v. Антибиотики и химиотер. — 2010. — Т. 55. — № 5-6. — С. 32-35. / Shishkina L.N., Nebol'sin V.E., Skarnovich M.O., Kabanov A.S., Sergeev A.A., Erdyneeva U.B. i dr. Izuchenie effektivnosti Ingavirina® in vivo v otnoshenii shtammov pandemicheskogo virusa grippa A(H1N1/09)v. Antibiotiki i khimioter 2010; 55: 5-6: 32-35. [in Russian]
17. Трахтенберг И.М., Сова P.E., Шефтель B.O., Оникиенко Ф.А. Проблема нормы в токсикологии. 2-е изд. М.: Медицина, 1991. — 208 с./ TrakhtenbergI.M., Sova R.E., Sheftel'V.O., OnikienkoF.A. Problema normy v toksikologii. 2-e izd. M.: Meditsina, 1991; 208. [in Russian]
18. Скарнович M.O., Шишкина Л.Н., Кабанов A.C., Мазуркова H.A., Да-ниленко Е.Д., Масычева В.И., Дроздов И.Г. Эффективность комбинированного применения ридостина и озельтамивира (тамифлю) для лечения и профилактики экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гриппа (H5N1) у мышей. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 2011. — № 5. — С. 79-82. / Skarnovich M.O., Shishkina L.N., Kabanov A.S., Mazurkova N.A., Danilenko E.D., Masycheva V.I., Drozdov IG. Effektivnost' kom-binirovannogo primeneniya ridostina i ozel'tamivira (tamifljyu) dlya lecheniya i profilaktiki eksperimental'noj infektsii, vyzvannoj virusom grippa (H5N1) u myshej. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii 2011; 5: 79-82. [in Russian]
19. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера, 2006. — 312 с. / Rebrova O.Jyu. Statisticheskij analiz meditsin-skikh dannykh. Primenenie paketa prikladnykh programm STATISTI-CA. M.: Media Sfera, 2006; 312. [in Russian]
20. Шмелева Н.П., Грибкова Н.В., Яцышина С.Б., Миненко A.H. Чувствительность к Римантадину и озельтамивиру вирусов гриппа А, изолированных на территории Республики Беларусь. Военная медицина. — 2008. — № 4 (9). — С. 95-98. / Shmeleva N.P., Gribkova N.V., Yatsyshina S.B., Minenko A.N.Chuvstvitel'nost' k Rimantadinu i ozel'tamiviru virusov grippa A, izolirovannykh na territorii Respubliki Belarus'. Voennaya meditsina 2008; 4 (9): 95-98. [in Russian]
21. Human infection with avian influenza A(H7N9) virus Fifth update, 27 January 2017. European Centre for Disease Prevention and Control, Stockholm, 2017. URL: http://ecdc.europa.eu/en/publications/ Publications/rra-influenza-a-h7n9-update-five.pdf.
22. Watanabe T, Watanabe S, Maher E.A., Neumann G, Kawaoka Y. Pandemic potential of avian influenza A(H7N9) viruses. Trends Microbiol 2014; 22 (11): 623-631.
23. Belser J.A., Gustin K.M., Pearce M.B., Maines T.R., Zeng H, Pappas C. et al. Pathogenesis and transmission of avian influenza A (H7N9) virus in ferrets and mice. Nature 2013; 501: 556-559.
24. Xu L, Bao L, Deng W, Zhu H, Chen T, Lv Q.et al.The mouse and ferret models for studying the novel avian-origin human influenza A (H7N9) virus. Virology Journal, 2013; 10: 253. URL: http://www.virol-ogyj.com/content/10/1/253.
25. Mok C.K.P., Lee H.H.Y., Chan M.C.W., Sia S.F, Lestra M, Nicholls J.M. et al. Pathogenicity of the novel A/H7N9 influenza virus in mice. mBio 2013; 4 (4): e00362-13. doi: 10.1128/mBio.00362-13.
Бормотов Николай Иванович — заведующий лабораторией химических препаратов отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская область, п. Кольцово Рыжиков Александр Борисович — к. б. н., заведующий отделом зоонозных инфекций и гриппа ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская область, п. Кольцово
Агафонов Александр Петрович — д. б. н., заместитель генерального директора по научной работе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская область, п. Кольцово
