Исследование противоопухолевых свойств пептидных последовательностей, ингибиторов взаимодействия циклина D1 и циклинзависимых киназ 4/6 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



38 МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

Материалы и методы. Исследована возможность созда- кванта света хлорином и эффективной передачи возбуждения препарата, имеющего биологическую активность по- ния с красителя на фуллерен, который генерирует актив-лимера основы, анестезирующее, антимикробное действие, ные формы кислорода в 55 раз эффективнее, чем традици-способствующее восстановлению местного иммунитета, онные красители. с пролонгированным лечебным действием для интрапу- Открывается возможность использовать для создания зырных инсталляций в виде «Колетекс-гель-ДНК», кото- фотодинамических препаратов нового поколения краси-рый представляется в измененном виде (ингредиенты: телей, возбуждаемых не только в триплетное, но и в синг-колетекс-гель, гиалуронат натрия, лидокаин, диоксидин летное состояние. В результате значительно повышается (АГДЛ)) для предклинических испытаний. Проведены ис- фотодинамическая активность традиционных красителей следования на крысах и кроликах с экспериментальным и расширяются пути поиска новых красителей, удовлетво-радиоиндуцированным циститом. Наличие цистита и сте- ряющих широкому спектру разносторонних требований, пень его выраженности подтверждались клиническими, предъявляемых к фотодинамическим препаратам. лабораторными и патоморфологическими данными. При фотодинамическом действии таких гибридных Результаты. Отработана и использована модель луче- наноструктур в результате эффективного переноса возбу-вого цистита у самок и самцов крыс и кроликов. При одно- ждения с красителя на фуллерен значительно снижается кратном внутрипузырном введении геля АГДЛ проявлений квантовый выход флуоресценции красителя. острой токсичности не получено. Период полувыведения В рамках развития методов детектирования таких про-АГДЛ из организма животных составил 5 ч. Внутрипузыр- изводных фуллерена и ковалентных диад фуллерен-хло-ное введение АГДЛ по данным ПЭТ-КТ, лабораторных рин е6 в воде и в биологических объектах разработан метод и патанатомических исследований способствует быстрому регистрации таких гибридных структур с помощью мето-исчезновению признаков постлучевого цистита по сравне- дики гигантского комбинационного рассеяния (SERS) нию с не леченными животными. и с помощью поверхностно-усиленной флуоресценции Заключение. Создано отечественное медицинское сред- (SEF) на подложках и в растворе с серебряными наноча-ство для лечения лучевых циститов, не имеющее аналогов стицами. в мире, лишенное острой токсичности при внутрипузыр- Было обнаружено, что ковалентные диады фуллерен-ном введении, с пролонгированным лечебным действием. хлорин не обладают флуоресценцией, присущей хлорину Использование АГДЛ позволит обеспечить профилактику е6, вследствие эффективного переноса электрона или син-развитие острых лучевых циститов при подведении запла- глетного возбуждения с красителя на ядро фуллерена. По-нированных канцероцидных доз облучения опухолей ма- казано, что производные хлорина е6 и ковалентные диады лого таза без снижения качества жизни, а также эффектив- фуллерен-хлорин, в которых флуоресценция хлорина по-но лечить поздние лучевые циститы. тушена, при осаждении на серебряных наноподложках обладают близкими по структуре характерными спектрами А.И. Котельников1, А.Ю. Рыбкин1, Н.С. Горячев1, SERS. В то же время у диад фуллерен-хлорин наблюдает-А.Ю. Белик1, П.А. Тараканов1, А.П. Садков1, В.С. Романова2 ся SEF, тогда как у свободного производного хлорина НОВЫЕ ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ ТАРГЕТНЫХ флуоресценция SEF на подложке практически потушена, ФОТОДИНАМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ что согласуется с теорией, предсказывающей обратную ГИБРИДНЫХ СТРУКТУР ФУЛЛЕРЕН-КРАСИТЕЛЬ зависимость интенсивности флуоресценции SEF от кван-ФГБУНИПХФ РАН, Черноголовка, Московская область, тового выхода обычной флуоресценции соединений в рас-Россия; творе. В водном растворе концентрационная зависимость 2ФГБУНИНЭОС РАН, Москва, Россия интенсивности SEF линейна для исследуемых соединений С целью получения высокоэффективных таргетных в диапазоне 0,1-1,0 мкМ, что позволяет их уверенно де-фотодинамических препаратов нового типа разработана тектировать в биологических структурах методика создания гибридных молекулярных структур кра- Полученные гибридные наноструктуры фуллерен-ситель-фуллерен-вектор на основе использования па- хлорин-гиалуроновая кислота обладают высокой раствори-тента № RU02462473 C2 совместно с В.С. Романовой мостью в воде и выраженной фотохимической активностью, (ИНЭОС РАН). Особенностью данной методики синтеза что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных является получение полифункционального производного фотосенсибилизаторов. Предлагаемые методики SERS и SEF фуллерена путем поэтапного присоединения к фуллерено- впервые позволяют исследовать процессы накопления вому ядру 2 различных функциональных групп. В качестве гибридных слабофлуоресцирующих соединений (в том чис-1-й функциональной группы может быть присоединена ле и производных фуллерена) в биологических структурах. аминокислота или векторная группа, обеспечивающая Работа выполнена по теме Государственного задания, таргетное взаимодействие соединения с опухолью, а 2-й - № гос. регистрации_01201361875, исследования триплетно или синглетно возбуждаемый краситель, обес- поддержаны Программой Президиума РАН № 1 печивающий эффективное поглощение кванта света «Наноструктуры: физика, химия, биология, в красной области спектра и конвертацию энергии в виде основы технологий» и грантом РФФИ переноса энергии возбуждения или электрона в генерацию № 16-34-01156-мол_а. активных форм кислорода. Фотохимическая активность такой гибридной структуры примерно в 5,5 раза превышает активность свободного хлорина е6 за счет поглощения

Спецвыпуск / том 17 / 2018 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

39

В.Ю. Кравцов1-2, С.Б. Оникиенко2, В.В. Лишенко1-2, Е.О. Чучалин2

иммуноцитохимические исследования PDl-ЗAвиcимыx реакций в ассоциациях лимфоцитов с комплексами злокачественных клеток

ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России, Санкт-Петербург, Россия; 2Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия

введение. Известно, что PDl-рецепторы программируемой клеточной смерти цитотоксических Т-лимфоцитов блокируют противоопухолевый иммунный ответ. Создание ингибиторов PDl-рецепторов стало прорывом в биотерапии рака. Для понимания механизмов их лечебного действия и мониторинга биотерапии рака необходимо изучение PDl-зависимых реакций в лимфоцитарно-опухолевых ассоциациях у онкологических пациентов in vivo.

Цель исследования. Иммуноцитохимическое изучение PDl-зависимых реакций в ассоциациях цитотоксических Т-лимфоцитов с комплексами злокачественных клеток в ас-цитической и плевральной жидкостях при биотерапии рака.

материалы и методы. Аспирационные биоптаты получены у 5 пациентов с метастазированием опухоли в плевральную и брюшную полости. Аспираты отстаивали в течение часа, осадок переносили на предметные стекла. Иммуноцитохимические исследования PDl-рецепторов, CD3, CD8, гранзима Б и перфорина в лимфоцитах, ассоциированных с комплексами злокачественных клеток, проводили под иммерсией (увеличение 1000) после окрашивания соответствующими первыми моноклональными антителами и адаптированными под них системами визуализации фирмы Abcam.

результаты. PDl-положительные (PD1+) лимфоциты, ассоциированные с комплексами злокачественных клеток, имеют признаки деструкции (апоптоза) в отличие от не ассоциированных PD1+ лимфоцитов (p <0,0001). Установлено, что апоптотические PD1+ тельца фагоцитируются раковыми клетками. Признаки цитонекроза и апоптоза в злокачественных клетках обнаруживаются только в тех случаях, когда они ассоциированы одновременно и PD1-и PD1+ лимфоцитами (p <0,05). При таком варианте онко-лизиса наблюдаются картины коллективного апоптоза опухолевых и иммунокомпетентных клеток. В лимфоцитах, ассоциированных со злокачественными клетками, проявляется активность гранзима Б и перфорина с транс-фекцией гранзима Б в цитоплазму злокачественных клеток. Морфометрические измерения плотности антигена в цитотоксических Т-лимфоцитах установили отрицательную корреляцию между экспрессией гранзима Б и перфорина с одной стороны и экспрессией PDl-рецептора — с другой. Иммуноцитохимические исследования свидетельствуют о том, что активация противоопухолевого иммунного ответа ингибиторами PDl-рецепторов происходит только при выявлении их исходной гиперэкспрессии в цитоток-сических Т-лимфоцитах.

Заключение. Иммуноцитохимические исследования PDl-зависимых реакций в ассоциациях Т-цитотоксичес-ких лимфоцитов с комплексами злокачественных клеток

позволяют изучать механизмы противоопухолевого иммунного ответа и мониторировать биотерапию злокачественных новообразований у пациентов с метастазированием опухоли в плевральную и брюшную полости.

В.П. Краснов

дизайн противоопухолевых препаратов на основе аминокислот

ИОС УрО РАН, Екатеринбург, Россия

Природные аминокислоты разнообразны по строению, коммерчески доступны, обладают высокой оптической чистотой и представляют собой уникальное сырье для создания на их основе новых лекарственных средств. Весьма важным является наличие в структуре этих соединений альфа-аминокислотного остатка, обеспечивающего избирательный транспорт фармакофорных групп.

В ИОС им. И.Я. Постовского УрО РАН разработаны методы синтеза большой группы нитрозоуреидо производных диаминокарбоновых кислот и исследована их противоопухолевая активность. Результатом исследований явилось создание, совместно с НМИЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, оригинального противоопухолевого препарата лизомустин, клинически используемого в настоящее время для лечения рака легкого и меланомы кожи. Успешно завершено доклиническое изучение препарата ормустин, предназначенного для лечения первичных и метастатических опухолей головного мозга.

Синтезирован ряд пептидоподобных соединений, производных карборанов, представляющих интерес для использования в бор-нейтронозахватной терапии опухолей.

В последнее время разрабатываются методы синтеза конъюгатов пурина с аминокислотами и дипептидами, обладающими различными видами биологической активности.

Модификация магнитных наночастиц на основе магнетита позволила получить материалы, перспективные для диагностики опухолей.

Проведенные исследования показали перспективность использования аминокислот для создания инновационных лекарственных средств.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант № 14-13-01077).

Н.В. Красногорова1, Д.В. Новиков1, С.Г. Фомина1, Р.Г. Пегов2, М.А. Магомедов2, В.В. Новиков1

связь между уровнями мрнк FCyRIIIa, TNF и foxp3 в опухолях больных колоректальным раком

1ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия; 2ГБУЗ НО НОКОД, Нижний Новгород, Россия

введение. Появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что локальное хроническое воспаление при колоректальном раке (КРР) является независимым мониторинговым показателем. Провоспалительное окружение клеток опухоли формируется клетками врожденного и адаптивного иммунитета, инфильтрующими опухоль. Присутствие в опухоли больных КРР натуральных киллеров, макрофагов и нейтрофилов ассоциировано с благоприятным прогнозом. Обнаружение в опухоли большого количества

Спецвыпуск / том 17 / 2018

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

40 МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

активированных Т-регуляторных клеток, наоборот, ассо- наблюдалась полная остановка пролиферации и гибель опу-циировано с присутствием регионарных и отдаленных ме- холевых клеток преимущественно по пути апоптоза. Ис-тастазов. следования последовательности Seql показали наличие Цель исследования. Исследование ассоциации экс- антипролиферативных эффектов только при концентрациях прессии генов FcyRIIIa, FcyRIIIß, TNF и FOXP3 в опухолях >20 мкМ. В экспериментах in vivo на модели подкожно больных КРР с особенностями течения заболевания. трансплантированной опухоли НТ-29 было показано, что материалы и методы. В работе использовали образцы интраперитонеальное введение последовательностей Seql опухолей от 58 больных КРР. Определение уровней мРНК и Seq2 в концентрациях 0,3 мг на мышь с интервалом 1 раз исследуемых генов выполняли методом ОТ-ПЦР с детек- в 3 дня тормозит рост опухолевого узла в 2,2 раза по срав-цией в реальном времени относительно референтных генов. нению с контрольной группой и приводит к увеличению Статистическую обработку данных проводили, используя продолжительности жизни животных. U-критерий Манна—Уитни, H-критерий Краскела-Уол- Заключение. Исследуемые пептидные последователь-лиса и коэффициент корреляции Спирмена. ности, ингибирующие взаимодействие циклина D1 и ци-результаты. Установлено, что уровень мРНК FcyRIIIa клин-зависимых киназы 4/6, обладают противоопухолевой положительно коррелировал с уровнем мРНК FOXP3 (r = активностью в отношении клеток рака толстой кишки 0,31, p = 0,02) и с уровнем мРНК TNF (r = 0,35, p = 0,009), человека. в то же время связь с уровнем мРНК FcyRIIIß не была выявлена. Уровни мРНК FcyRIIIa были наиболее высокими М.А. Лапшина1, С.И. Норко2, Н.Ф. Гольдшлегер1, в опухолях больных с множественными регионарными мета- В. Е. Баулин3 4, А.А. Терентьев1,2 5 стазами (p = 0,03), отнесенных по классификации TNM накопление и локАлиЗАЦия к категории N2 при размере опухоли T3 и T4. октА-[(4'-БЕнЗо-15-крАУБ-5)-окСи] Заключение. Высокий уровень мРНК FcyRIIIa в опу- ФТАлоЦиАнинАТА мАГния холи связан с прогрессированием КРР. в клЕТкАХ HELA ФГБУН ИПХФ РАН, Черноголовка, Т.М. Кулинич, А.М. Шишкин, А.В. Иванов, Московская область, Россия: Е.А. Кудинова, В.К. Боженко 2МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия; исследование противоопухолевых 3ФГБУНИФХЭ РАН, Москва, Россия; свойств пептидных 4ФГБУНИФАВ РАН, Черноголовка, Московская область, последовательностей, ингибиторов Россия; взаимодействия ЦиклинА D1 5НОЦ«Медицинская химия» МГОУ, Черноголовка, и ЦиклинЗАвиСимЫХ кинАЗ 4/6 Московская область, Россия ФГБУРНЦРР Минздрава России, Москва, Россия введение. В настоящее время фотодинамическая тера-введение. Образование комплексов циклин-циклин- пия (ФДТ) стала эффективным методом лечения некото-зависимая киназа является ключевым механизмом актива- рых онкологических заболеваний человека. Метод ФДТ ции (регуляции) процессов клеточной пролиферации. основывается на применении фотосенсибилизаторов (ФС), Циклины D-типа, связываясь с циклинзависимыми кина- которые после введения в организм способны накапли-зами 4 и 6, индуцируют фосфорилирование белка Rb и сти- ваться в опухоли и при лазерном возбуждении продуциро-мулируют переход G1-S. Гиперэкспрессия циклина D вать синглетный кислород и цитотоксические вещества, и CDK4/6 обнаруживается при многих злокачественных что приводит к гибели раковых клеток. Фталоцианины новообразованиях различных локализаций. (ФЦ) относятся к группе ФС 2-го поколения. Краун-со-Цель исследования. Оценка влияния на рост и проли- держащие ФЦ несут в молекуле 2 потенциально активные ферацию клеток линий аденокарцином толстой кишки медико-биологические структуры — краун-фрагменты человека НТ-29 и НСТ-116 2 пептидных последовательно- и макроцикл. Присутствие краун-групп на периферии мастей, ингибирующих взаимодействие циклина D1 и ци- кроцикла обеспечивает растворимость ФЦ в водной среде. клинзависимых киназ 4/6 (Segl и Seq2). В данной работе в качестве нового потенциального ФДТ-материалы и методы. Использованы методы проточной агента используется окта[(4'-бензо-15-краун-5)-окси]фта-цитофлуориметрии (разные виды окраски) и оценки про- лоцианинат магния (Mgcr8Pc) и исследуется его погло-лиферации «в реальном времени» (RTCA iCELLigence, США). щение и локализация в клетках HeLa — аденокарциномы Исследованные последовательности представляют со- шейки матки человека. бой химерные пептиды, включающие функциональную Цель исследования. Оценить токсичность, накопление часть и интернализуемую последовательность (Tat). и локализацию исследуемого соединения Mgcr8Pc в опухо- результаты. Было показано, что Seql и Seq2 in vivo про- левых клетках HeLa. являют антипролиферативные свойства, выражающиеся материалы и методы. Изучение накопления и локали-в задержке перехода G1-S, увеличении количества клеток зацию Mgcr8Pc в клетках HeLa проводили методом флуо-в G-фазе, замедлении процессов пролиферации в отноше- ресцентной микроскопии на микроскопе Axio Scope Al нии клеток культур НТ-29 и НСТ-116. Внесение в культу- (Carl Zeiss, Германия). Для этого клетки выращивали на ральную среду последовательности Seq2 в концентрации покровных стеклах и инкубировали с Mgcr8Pc в течение 5 мкМ приводило к 30—50 % задержке роста клеточной 24 ч в дозе IC50. Для визуализации ядра клетки использо-популяции, при увеличении концентрации до 10 мкМ вали краситель DAPI. Накопление Mgcr8Pc в клетках

Спецвыпуск / том 17 / 2018 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ