CC BY
13
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2021 - Vol. 28, № 3 - P. 36-39
УДК: 605.615/4.616 DOI: 10.24412/1609-2163-2021-3-36-39
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОЗИЦИИДОКСОРУБИЦИНА С ФИТОПРЕПАРАТАМИ ПРИ ОПУХОЛИ WALKER 256
В.И. ИНЧИНА, ХАК ЗИАУЛ, О.А. КУЛИКОВ
ФГБОУ ВО НИИ Мордовский государственный университет им. «Н.П. Огарева»,
ул. Большевистская, д. 68, г. Саранск, Республика Мордовия, 430005, Россия, e-mail: [email protected]
Аннотация. Цель исследования. Экспериментальная разработка новых эффективных методов лечения злокачественных новообразований путём создания композиций противоопухолевого антибиотика доксорубицина гидрохлорида с водными экстрактами трав Trigonella foenum-graecum (пажитник-хелба), Cymbopogon proximus на модели перевиваемой солидной опухоли Walker 256 у 40 крыс. Материалы и методы исследования. Группы животных: 11 крыс контрольной группы (контроль1). 5 крыс, доксорубицин внутривенно (4мг/кг/мл) на пятый день от перевивки опухоли - контроль 2. Опытной группе №1 (6 крыс) вводили водные экстракты Cymbopogon proximus каждый день внутрибрюшинно (2 мг/кг/мл) в течение 20 дней и доксорубицин (2мг/кг/мл) однократно, опытной группе №2 из 6 крыс вводили водный экстракт Trigonella foenum-graecum (2мг/кг/мл) вместе с доксорубицином (2мг/кг/мл) однократно. В сыворотке крови крыс определяли содержание общего белка, альбуминов, активность трансаминаз - АЛТ, АСТ, общего холестерина, триглицеридов, мочевины и креатинина. Противоопухолевый эффект оценивали по объему первичного опухолевого узла и в конце эксперимента. Результаты исследования. Включение в комплекс терапии опухоли доксорубицина в дозе 2 мг/ кг и водных экстрактов Cymbopogon proximus или Trigonella foenum-graecum существенно повышает противоопухолевую активность доксорубицина даже в сниженной дозировке и снижает его токсичность. Выводы. Введение экстрактов исследуемых фитоагентов на фоне уменьшенной в два раза дозы доксорубицина - 2 мг/кг, полностью предотвратило гибель животных с опухолевым ростом, повысило противоопухолевую активность и снизило токсическое действие доксорубицина.
Ключевые слова: доксорубицин, опухоль WALKER 256, Cymbopogon proximus, Trigonella foenum-graecum.
STUDY OF THE ANTITUMOR ACTIVITY OF THE COMPOSITION DOXORUBICIN WITH PHYTOPREPARATIONS
IN WALKER 256 TUMORS
V. I. INCHINA, HAK ZIAUL, O.A. KULIKOV
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Mordovia State University named after "N.P. Ogarev", Bolshevistskaya Str., 68, Saransk, Republic of Mordovia, 430005, Russia, e-mail: [email protected]
Abstract. The research purpose is an experimental development of new effective methods for the treatment of malignant neoplasms by creating compositions of the antitumor antibiotic doxorubicin hydrochloride with water extracts of the herbs Trigonella foe-num-graecum( fenugreek-helba), Cymbopogon proximus on a model of a Walker 256 solid tumor in 40 rats. Materials and research methods. Animal groups: 11 control group rats (control 1). There were 5 rats with doxorubicin intravenously (4 mg/kg/ml) on the fifth day after tumor transplantation-control 2. Experimental group No. 1 (6 rats) was administered aqueous extracts of Cymbopogon proximus every day intraperitoneal (2 mg/kg/ml) for 20 days and doxorubicin (2 mg/kg/ml) once, experimental group No. 2 of 6 rats was administered aqueous extract of Trigonella foenum-graecum (2 mg/kg/ml) together with doxorubicin (2 mg/kg/ml) once. In the blood serum of rats, the content of total protein, albumins, the activity of transaminases - ALT, AST, total cholesterol, triglycerides, urea and creatinine were determined. The anti-tumor effect was evaluated by the volume of the primary tumor node and at the end of the experiment. Results and its discussion. The inclusion of doxorubicin at a dose of 2 mg/ kg and aqueous extracts of Cymbopogon proximus or Trigonella foenum-graecum in the complex of tumor therapy significantly increases the anti-tumor activity of doxorubicin even at a reduced dosage and reduces its toxicity. Conclusions. The introduction of extracts of the studied phytoagents against the background of a halved dose of doxorubicin - 2 mg / kg, completely prevented the death of animals with tumor growth, increased the anti-tumor activity and reduced the toxic effect of doxorubicin.
Keywords: Doxorubicin, WALKER 256 tumor, Cymbopogon proximus, Trigonella foenum-graecum..
Актуальность. Оптимизация противоопухолевой терапии проводится в различных областях фармакотерапии, направленной на повышение эффективности и снижение риска развития токсических эффектов. Наличие в ряде лекарственных растений соединений с противоопухолевой активностью создаёт предпосылки для использования фитопрепаратов в комплексной терапии злокачественных новообразований. К соединениям, с которыми связывают противоопухолевую активность пажитника, относят фитоэстрогены и сапонины [1]. Сапонины селективно ингибируют деление опухолевых клеток и могут
также активировать программы апоптоза [2]. В исследованиях in vivo и in vitro была продемонстрирована профилактическая противоопухолевая активность диосгенина из пажитника, выражавшаяся в подавлении индуцируемого канцерогенами предопухолевого процесса в кишечнике, а также прямое противоопухолевое действие в отношении клеток HT-29 (человеческая клеточная линия рака кишечника), связанное с ингибированием пролиферации и индукцией апоптоза. Другой сапонин пажитника - протодиос-цин, также продемонстрировал проапоптотическое
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2021 - Vol. 28, № 3 - P. 36-39
действие при исследовании на лейкемических клетках [1]. В ряде исследований были показаны противоопухолевые свойства других веществ в составе пажитника, в частности алкалоида тригонеллина [4].
Цель исследования - экспериментальная разработка новых эффективных методов лечения злокачественных новообразований путём создания композиций противоопухолевого антибиотика доксоруби-цина гидрохлорида с водными экстрактами трав Trigonella foenumgraecum (пажитник-хелба), Cymbopo-gon proximus на модели перевиваемой солидной опухоли Walker 256 у крыс.
Материалы и методы исследования. Исследование проведено на базе вивария ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва» в весенне-летнее время. Исследование проведено на 40 нелинейных белых крысах обоего пола массой 200-250 г., полученных из питомника лабораторных животных «Андреевка» (филиал ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская обл.). Все манипуляции с животными проводили в соответствии с «Руководством по содержанию и использованию лабораторных» животных. - Washington, DC: National Academy Press., в соответствии с Директивой № 63 от 22 сентября 2010 года Президиума и Парламента Европы «О защите животных используемых для научных исследований», «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник от 06.04.1993 и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». В соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [2005] максимально допустимое внутривенное введение жидкости белым нелинейным крысам составляет 2,0 мл/кг. Все манипуляции, вызывающие боль, проводились под наркозом, состоявшем из Рометара (2% ксилазина гидрохлорида) 0,05 на 1 кг и Золетил (зола-зепама гидрохлорид, тилетамина гидрохлорид в равных пропорциях) 10 мг/кг.
В работе использованы противоопухолевые препараты: доксорубицин Доксорубицин-тева («TEVA» Израиль).
Опухоль была перевита 28 крысам. Эффективность терапии оценивали по торможению роста опухоли, а также по площади под кинетической кривой роста опухоли и индексу роста опухоли. В зависимости от проводимой терапией химиотерапии и фитотерапии крысы были разделены на группы в каждой:
Группа 1: 11 крыс контрольной группы. Наблюдалась в течение всего периода без лечения.
Группа 2: в этой группе 5 крыс, получившие в нео-адъювантном режиме химиотерапии, монохимиотерапию 1 раз 5 крысам вводили доксорубицин внутривенно (4мг/кг/мл) в зависимости от массы крыс на пятый день от перевивки опухоли - контроль 2.
Группа 3: в данной группе 6 крыс получали водные экстрактов Cymbopogon proximus (трава вер-блюда-махарееп) каждый день внутрибрюшинно (2 мг/кг/мл) после роста опухоли (5 день) в течение
20 дней+цикл химиотерапии доксорубицином (2 мг/кг/мл) внутривенно однократно на 5-й день после перевивки опухоли.
Группа 4: Группа из 6 крыс получала в неоадъ-ювантном режиме водный экстракт Trigonella foenumgraecum каждый день внутрибрюшинно (2 мг/кг/мл) после роста опухоли (5 день)+цикла химиотерапии доксорубицином (2 мг/кг/мл) внутривенно однократно на 5-й день.
12 крыс составили группу интактных животных.
По окончании эксперимента из хвостовой вены крыс забирали кровь, стабилизировали раствором цитрата натрия в соотношении 1:10, исследовали на гематологическом анализаторе PCE-90Vet (США). Биохимические исследования проводили в сыворотке крови на автоматическом биохимическом анализаторе фирмы «HUMASTAR 600, (Германия)». В сыворотке крови крыс определяли содержание общего белка, альбуминов, активность трансаминаз - АЛТ, АСТ, общего холестерина, триглицеридов, мочевины и креатинина. Противоопухолевый эффект оценивали по объему первичного опухолевого узла и в конце эксперимента - по его массе. Размеры опухолей на месте трансплантации определяли с помощью штангенциркуля и рассчитывали их объем по формуле эллипсоида: V=0,131 хLх (D1+D2)2, где L - длина опухоли, а D1 и D2 - два других взаимно перпендикулярных диаметра (Забежинский М.А., 1999).
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере Pentium IV с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel». Статистическая обработка включала расчет средних арифметических значений (М), ошибок средних арифметических (±m), определение достоверности различий средних арифметических (р) с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при значении р<0,05
Результаты и их обсуждение. Без введения противоопухолевого препарата - контрольная 1 группа - наблюдался прогрессивный опухолевый рост, достигающий максимума к 20 суткам от момента имплантации опухолевого штамма, превышая данные 5-х суток на 95% (рис.) На фоне коррекции доксорубицином в режиме монотерапии - 2-я группа контроля, наблюдалась тенденция подавления опухолевого роста (рис.1), однако сохранялись высокие показатели летальности экспериментальных животных, как в 1-й контрольной группе без фармакотерапии летальность достигала 40%. В группах опытных животных 3-й и 4-й коррекция опухолевого роста проводилась уменьшенными в два раза по сравнению с контролем дозами доксорубицина гидрохлорида - 2 мг/кг в комбинации с водными экстрактами в концентрации 1:10 Cymbopogon proximus или Trigonella foenum-graecum 2 мл на крысу в течении 20 суток внутрибрюшинно. Исследуемые композиции проявляли выраженный проти-вооопухолевый эффект, ингибируя рост опухоли на 20% достоверно с 13 суток от момента имплантации клеток опухоли WOLKER 256 (рис).
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2021 - Vol. 28, № 3 - P. 36-39
Рис. Динамика роста опухоли WOLKER 256 фоне коррекции доксорубицином 2 мг/кг однократно внутривенно в сочетании с водными экстрактами Cymbopogon ртхтш или Т^опеНа foenum-graecum 2 мл на крысу в течении 20 суток
Максимальное ингибирование роста опухоли на фоне исследуемых композиций достигло к 19 суткам и различие составило 218% по сравнению с 1-й контрольной серией (без лечения). Весьма позитивен факт отсутствия летальности в данных группах.
В группе животных, получавших стандартное лечение - 4 мг/кг доксорубицина без экстрактов трав, подавление роста опухоли к 19 суткам было существенно меньше - 168%.
Доксорубицин проявляет системную органную токсичность, на что указывают изменения функциональных показателей. Наблюдается явления кардио-и гепатотоксичности, о чём свидетельствуют рост активности ферментов АЛТ (аланиновая трансаминаза) на 44,4% и АСТ (аспарагиновая трансаминаза) на 228%. Нарушается и белковосинтетическая функция печени, на что указывают уменьшение значений общего белка на 36,3% % и альбуминов сыворотки крови на 25% (табл.).
О развитии нефротоксичности свидетельствуют рост креатинина на 9,65% и мочевины сыворотки крови на 321%%. (табл.). Повышение уровня общего холестерина на 35% и триглицеридов в сыворотки крови на 33,9%, вызванное ростом опухоли и влиянием доксорубицина, также признак системных метаболических сдвигов и развития дислипидемии. О высокой токсичности доксорубцина при коррекции опухолевого процесса свидетельствует и летальность экспериментальных животных, составляющая 40% к 25 суткам эксперимента.
Таким образом, побочные эффекты доксорубицина, в том числе и катаболические процессы, приводящие к системным органным нарушениям являются основным лимитирующим фактором выживания при фармакотерапии противоопухолевыми препаратами.
В этой связи остро возникает проблема коррекции цитотоксичности используемых в лечении опухолевых заболеваний фармакологических средств. Для решения данной проблемы нами использованы фитопрепараты на основе водных экстрактов Trigonella foenum-graecum, Cymbopogon ртхтш в концентрации 1:10. Введение экстрактов исследуемых трав на фоне уменьшенной в два раза дозы доксору-бицина - 2 мг/кг, полностью предотвратило гибель животных с опухолевым ростом и повысило противо-
опухолевую активность доксорубицина, что свидетельствует о синергетическом эффекте фитокомпо-зиций в комбинации с цитостатиком.
Таблица
Биохимические показатели сыворотки крови крыс при моделирования острого опухолевого процесса на фоне доксорубицина 2 мг/кг с введения водных экстрактов трав
Показатели Интактные Контроль доксоруби-цин 4 мг/кг Доксорубицин 2 мг/кг+ Cymbopogon proximus Доксоруби-цин 2 мг/кг +Trigonella foenum-grae-cum
1 Общий белок, г/л 64±5,61 40,8±3,27 Ри<0,05 43,4±10,83 Ри<0,005 Рк<0,05 49,4±6,54 Ри<0,05 Рк<0,05
2 Альбумины, г/л 29,6±3,28 22,2±1,30 Ри<0,005 23,8±6,65 Ри>0,05 Рк>0,05 26,8±4,44 Ри>0,05 Рк<0,05
41±10,22 59,2±11,23 Ри<0,05 48,8±13,08 63,8±24,44
АЛТ, Ед/л Ри>0,05 Рк>0,05 Ри>0,05 Рк>0,05
479,5±57,88 Ри<0,05 670,8±331,01 490±85,05
5 АСТ, Ед/л 146,4±20,99 Ри<0,05 Рк>0,05 Ри<0,05 Рк>0,05
Об.холе- 1,76 на 1,4±0,46 1,66±0,46
6 стерин, 1,3±0,27 35%±0,16 Ри<0,05 Ри>0,05
ммоль/л Ри<0,05 Рк>0,05 Рк>0,05
7 Триглице-риды 1,09±0,34 1,46±0,39 Ри<0,05 0,97±1,33 Ри>0,05 0,76±0,27 Ри>0,05
моль/л Рк>0,05 Рк>0,05
8 Мочевина, 5,2±0,87 21,9±2,46 Ри<0,005 33,48±21,17 Ри<0,05 32,4±21,35 Ри>0,05
моль/л Рк>0,05 Рк>0,05
9 Креати-нин, 0,047±0,005 0,052±0,008 Ри<0,05 0,056±0,011 Ри>0,05 0,09±0,05 Ри<0,05
мкмоль/л Рк>0,05 Рк>0,05
Примечание: достоверность различия Ри рассчитана по отношении к интактным животным, Рк - контролю
Значимую роль в реализации выраженного противоопухолевого действия исследуемых композиций имеет и коррекция цитотоксических эффектов противоопухолевого антибиотика. Наиболее эффективно корригировали снижение показателей белкового обмена - общего белка и альбуминов сыворотки крови -экстракты Trigonella foenum-graecum. Данная композиция была эффективной и в устранении нарушений дислипидемий, снижая рост холестерина и триглице-ридов сыворотки крови, корригировала снижение показателей общего белка и альбуминов сыворотки крови, что свидетельствует о анаболической активности фитокомпозиции Trigonella foenum-graecum.
Мы не выявили уменьшения роста ферментов АЛТ и АСТ, а также снижения креатинина и мочевины сыворотки крови на фоне доксорубицина с фитопрепаратами Trigonella foenum-graecum и Cymbopogon prox-тш.
В этой связи основными критериями эффективности лечения противоопухолевыми препаратами следует считать клинические проявления - регрессию опухолевого процесса и отсутствие летальности.
Таким образом, включение в комплекс терапии опухоли доксорубицина в уменьшенной в два раза
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2021 - Vol. 28, № 3 - P. 36-39
дозировки и водных экстрактов Cymbopogon proximus или Trigonella foenum-graecum существенно повышает противоопухолевую активность доксорубицина даже в сниженной дозировке и снижает его токсичность.
Заключение. Таким образом, исследованная нами композиции малых (в 2 раза меньше стандартной) доз доксорубицина - 2 мг/кг в сочетании с экстрактами Trigonella foenum-graecum и Cymbopogon proximus обладают мощной противоопухолевой активностью на модели Wolker 256, что подтверждается регрессом опухолевого роста уже с 11 суток от момента имплантации опухоли и сохраняется до окончания эксперимента. Очень важно, что при данной композиции не наблюдалась гибель животных от истощения и интоксикации, развивались позитивные метаболические сдвиги - рост общего белка и альбуминов сыворотки крови, коррекции дислипидных нарушений. Как следует из опубликованных научных исследований, семена пажитника греческого обладают антиканцерогенными свойствами из-за ингибирования активности в-глюкоронидазы - фермента, который гидролизует токсины и мутагены, высвобождая активные канцерогенные вещества в печени [5].
Многие авторы связывают это с системным действием галактоманнанов, сапонинов и флавоноидов.
Противоопухолевая активность зависит и от структуры агликона (стероидной части молекулы) -количества гидроксильных и кетогрупп, наличия двойных связей [5].
Пажитник греческий обладает антиоксидантной активностью за счет содержания широкого спектра флавонидов (апигенин, лютеолин, ориентин, витек-син, кварцетин), содержащихся в семенах [1]. Флаво-ноиды выступают мощными ингибиторами окисления LDL-холестерина, а также обладают противовоспалительным, ранозаживляющим, капилляроукреп-ляющим эффектом [3,6,7].
Немаловажную роль в реализации онкопротек-торного эффекта растений имеет и его нутрицевтив-ная ценность, поэтому применение Trigonella foenum-graecum и Cymbopogon proximus в качестве пищевого продукта может быть эффективной мерой профилактики онкологических заболеваний.
Выводы:
1. Выявлено потенцирующее действие водных экстрактов Trigonella foenum-graecum или Cymbopogon proximus на противоопухолевые эффекты доксоруби-цина гидрохлорида и уменьшение его токсичности на модели опухоли Wolker 256 крыс.
2. Лекарственные композиции доксорубицина гидрохлорида 2 мг/кг внутривенно однократно с водным экстрактом Trigonella foenum-graecum или Cymbopogon proximus 2 мл внутрибрюшинно в течении 20 дней обладают выраженным противоопухолевым эффектом по сравнению со стандартными 4 мг/кг дозами доксорубицина гидрохлорида в виде монотерапии на модели опухоли Wolker 256 крыс.
Достоверная регрессии опухолевого роста начинается на 11 сутки от момента перевивания опухоли и сохраняется до окончания эксперимента. Введение в противоопухолевую терапию фитопрепаратов на основе Trigonella foenum-graecum и Cymbopogon proximus предотвращает летальность экспериментальных животных и корригирует негативные изменения метаболических процессов.
Литература / References
1. Кузьмичева Н.А. Фитохимический анализ семян пажитника сенного // Вестник фармации. 2017. №2. С. 23-27 / Kuz'micheva NA. Fitokhimicheskiy analiz semyan pazhitnika sennogo [Phytochemical analysis of hay fenugreek seeds]. Vestnik farma-tsii. 2017;2:23-7. Russian.
2. Asadi-Samani M.1, Moradi M.T.2, Mahmoodnia L., Alaei S., Asadi-Samani F., Luther T. Traditional uses of medicinal plants to prevent and treat diabetes; an updated review of ethnobotanical studies in Iran. // J Nephropathol. 2017. N6. Р. 118-125 / Asadi-Samani M1, Moradi MT2, Mahmoodnia L, Alaei S, Asadi-Samani F, Luther T. Traditional uses of medicinal plants to prevent and treat diabetes; an updated review of ethno-botanical studies in Iran. J Nephropathol. 2017;6:118-25.
3. Avalos-Soriano A., De la Cruz-Cordero R., Rosado J.L., Garcia-Gasca T. Hydroxyisoleucine from Fenugreek (Trigonella foenum-grae-cum): Effects on Insulin Resistance Associated with Obesity // Molecules. 2016. No 22. Р.1596 / Avalos-Soriano A, De la Cruz-Cordero R, Rosado JL, Garcia-Gasca T-Hydroxyisoleucine from Fenugreek (Trigonella foenum-graecum): Effects on Insulin Resistance Associated with Obesity. ^/Molecules. 2016;22:1596.
4. Avoseh, Opeyemi&Oyedeji, Opeoluwa&Rungqu, Pamela &Nkeh-Chungag, Benedicta&Oyedeji, Adeola. Cymbopogon Species; Ethnopharmacology // Phytochemistry and the Pharmacological Importance. Molecules. 2015. N 20. P. 7438-7453 / Avoseh, Opeyemi&Oyedeji, Opeoluwa&Rungqu, Pamela &Nkeh-Chungag, Benedicta&Oyedeji, Adeola. Cymbopogon Species; Ethnopharmacology. Phy-tochemistry and the Pharmacological Importance. Molecules. 2015;20:7438-53.
5. El Bairi K.1, Ouzir M.2, Agnieszka N.3, Khalki L.4. Anticancer potential of Trigonella foenum-graecum: Cellular and molecular targets // Bi-omed Pharmacother. 2017. N 90. P. 479-491 / El Bairi K1, Ouzir M2, Agnieszka N3, Khalki L4.Anticancer potential of Trigonella foenum-graecum: Cellular and molecular targets. Biomed Pharmacother. 2017;90:479-91.
6. Gong J.1, Fang K.1, Dong H.1, Wang D.1, Hu M.1, Lu F. Effect of fenugreek on hyperglycaemia and hyperlipidemia in diabetes and prediabetes: A meta-analysis // J Ethnopharmacol. 2016. N.194. P. 260-268 / Gong J1, Fang K1, Dong H1, Wang D1, Hu M1, Lu F Effect of fenugreek on hyperglycaemia and hyperlipidemia in diabetes and prediabetes: A meta-analysis. J Ethnopharmacol. 2016;194:260-8.
7. Zafar M.I.1, Gao F. 2.4-Hydroxyisoleucine: A Potential New Treatment for Type 2 Diabetes Mellitus // BioDrugs. 2016. N4. P. 255-262 / Zafar MI1, Gao F2.4-Hydroxyisoleucine: A Potential New Treatment for Type 2 Diabetes Mellitus. BioDrugs. 2016;4:255-62.
Библиографическая ссылка:
Инчина В.И., Зиаул Х., Куликов О.А. Исследование противоопухолевой активности композиции доксорубицина с фитопрепаратами при опухоли walker 256 // Вестник новых медицинских технологий. 2021. №3. С. 36-39. DOI: 10.24412/1609-2163-2021-3-36-39.
Bibliographic reference:
Inchina VI, Hak Ziaul, Kulikov OA. Issledovanie protivoopukholevoy aktivnosti kompozitsii doksorubitsina s fitopreparatami pri opu-kholi walker 256 [Study of the antitumor activity of the composition doxorubicin with phytopreparations in walker 256 tumors]. Journal of New Medical Technologies. 2021;3:36-39. DOI: 10.24412/1609-2163-2021-3-36-39. Russian.
