CC BY
47Фізика живого, Т. 1б, No 2, 200S. С.167-171.
© Хілько Т.Д., Якубцова І.В., Тищенко О.М., Остапченко Л.І., Макай Ш., Чехун В. Ф.
УДК 577.152.151
ЯДЕРНА ДНК КЛІТИН СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ШЛУНКА ЗА УМОВ ДІЇ СТРЕСУ У ЩУРІВ
Хілько Т.Д.1, Якубцова І.В.1, Тищенко О.М.2, Остапченко Л.І.1, Макай Ш.4, Чехун В.Ф.3
1 Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, відділ біохімії, вул Володимирська, 64, Q16Q1 Київ e-mail: [email protected]
2 Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, вул.Васильківська, 31/17, Q3Q22 Київ 3Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, вул. Васильківська, 45, Q3Q22 Київ 4 Університет Західної Угорщини, Інститут рослинництва, відділення медичних і ароматичних рослин, ,
вул. Вар 2, 92QQ Мошонмадяровар, Угорщина
Поступила в редакцию 10.12.2008
Проведено порівняльне дослідження рівня полімерізації ядерної ДНК клітин слизової оболонки шлунка як за умов стресової моделі виразки шлунка, так і при інтрагастральному введенні тваринам екстракту Т^опеїіа йоепит graecum на фоні розвитку виразкових ушкоджень.
Ключеві слова: ядерна ДНК, клітини слизової оболонки шлунка, стресова виразка.
ВСТУП
За сучасними уявленнями утворення уражень при виразковій хворобі є результатом порушення рівноваги між факторами агресії та резистентності гастродуоденальної системи. Резистентність слизової оболонки шлунка (СОШ) і
дванадцятипалої кишки визначається станом покривного слизу та клітин поверхневого епітелію. Секреція слизу, склад мембранних ліпідів, а також резистентність і регенеративний потенціал поверхневого епітелію регулюються на генетичному рівні. Тому дослідження структурно-функціональної організації геному важливі як для розуміння молекулярної природи реакції клітин на зовнішні сигнали та ушкоджуючі впливи, так і для практичної медицини.
За життя організму безперервно відбуваються процеси оновлення тканин, клітин та їх елементів. Відмирання клітин характерно для живих організмів протягом їх розвитку, а також у відповідь на абіотичні та біотичні чинники. Згідно сучасним уявленням загибель клітин може відбуватися шляхом некрозу або шляхом програмованої загибелі клітин (ПЗК), які пов'язані з порушенням цілісності молекули ДНК. Слід зазначити, що порушення цілісності структури ДНК призводять до уповільнення і зупинки мітозу, що є основою виникнення значних ускладнень клітинної проліферації при розвитку патологічних процесів. Експериментальні дані підтверджують,
що із збільшенням кількісних показників патологічних мітозів на малій кривизні та в пілороантральному відділі шлунка, зростає і кількість дисплазій [1].
Останнім часом у дослідженнях, зв’язаних з рішенням питань практичної медицини, найбільш актуальним є напрямок по використанню природних речовин для лікування захворювань різного генезу.
Прикладом такого засобу є екстракт насіння рослини фенугреку (Trigonella /оєпиш graecu)m. До складу фенугрека входить біля 30-40% слизистих речовин, які відіграють важливу роль у захисті слизової оболонки шлунка та кишечнику від ушкоджень. Присутність у екстракті фенугреку біоантиоксидантів (флавоноїдів, провітамінів, вітаміноподібних речовин, органічних кислот, дубильних речовин, мікроелементів), здатних подавляти процеси перекисного окиснення, знижує ризик виникнення патологічних змін [2, 3 ].
Для з'ясування молекулярних механізмів змін, які відбуваються в умовах експериментальної моделі виразки шлунка, та оцінки ефективності впливу екстракту Trigonella /оепит graecum на ці процеси, доцільним є вивчення структурно-функціонального стану ДНК в клітинах СОШ. Метою роботи було порівняльне визначення рівня полімерності ядерної ДНК клітин СОШ як за умов стресової моделі виразки шлунка, так і при введенні тваринам екстракту фенугрека на фоні розвитку виразкових ушкоджень.
Хілько Т.Д., Якубцова І.В., Тищенко О.М., Остапченко Л.І., Макай Ш., Чехун В.Ф.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
У роботі дотримувалися міжнародних рекомендацій про проведення медично-біологічних досліджень з використанням тварин згідно Європейської конвенції.
Дослідження проводили на 97 нелінійних щурах-самцях. масою 230-240 г. Тварин утримували на стандартному раціоні віварію. За добу до проведення дослідів щурі мали доступ лише до води. Тварин розподіляли на групи: 1 - контрольна, 2 - група, у яких моделювали стресову виразку, розвиток якої контролювали гістологічними дослідженнями, у 3 групі тварин, для корекції стресової виразкової хвороби (ВХ), щурам вводили інтрагастрально (внутрішньошлунково) екстракт фенугреку у концентрації мг на кг маси тварини двічі на добу протягом 7 діб. Стресову модель виразки шлунку викликали за методикою «іммобілізаційного стресу» в модифікації Гройсмана С.Д. і Каревіної Т.Г.[4].
Щурів 2-ї групи декапітували через 24 год після створення моделі, 3-ї - через 8 діб після створення моделі і введення екстракту фенугреку.
Для виділення ядер з клітин слизової оболонки шлунку (СОШ) використовували частково модифікований метод, описаний Ісаковим Б.К. і Айтхожиним М.М.[5]. Всі маніпуляції виконували при 4 0С. Тканини СОШ витримували у діетиловому ефірі протягом 1 хв., потім промивали та далі гомогенізували у буфері, який містить 0,025 M KCl,
0,005 M Mg(CH2COO)2, 0,1 mM PMSF, 0,005 M p-меркаптоетанол, 0,02 M триетаноламін, pH 7,5, 0,25 M сахарозу. Буфер застосовували в об'ємі, що складав 510 мл на 1 г тканини. Гомогенат фільтрували через один шар нейлонової тканини і чотири шари тканини Miracloth (Calbiochem, USA), а потім нашаровували на ступінчастий концентраційний градієнт гліцерину, який займав третину центрифужної пробірки і складався з рівних об’ємів 50% и 80%-го гліцерину, приготовленого на основі буфера для гомогенізації. Суміш центрифугували при 800g протягом 15хв на центрифузі К-23Д (Германія). Фракцію, збагачену ядрами у вузькій зоні над 80% гліцерином, повторно очищували в 50-80%-му градієнті гліцерину. Ядра концентрували центрифугуванням при 800g протягом 15хв, потім осад ядер промивали 3-5 разів буфером для гомогенізації, який містив нонідет Р-40 і 50%-ний гліцерин, за тих же умов центрифугування. Якість препаратів ядер контролювали за допомогою мікроскопа Amplival (Carl Zeiss, Германія). Ядра фарбували ацетоорсеїном та підраховували у камері Горяєва за формулою:
К=4 000 х 1 000 Я / 80, де К - кількість ядер в 1мл, Я - кількість ядер у 16-ти квадратах за діагоналлю камери.
Ядерну ДНК виділяли згідно модифікованому нами методу [6]. Суспензію ядер осаджували за
допомогою центрифугування при 10000g 5хв на мікрофузі™ (Beckman), далі осад ядер ресуспендували у лізуючому буфері, який містить 0,1 M Трис-HCl, pH 7,5, 0,012 М ЕДТА, 0,15 M NaCl, 1%-й ДСН. В середовище інкубації додавали протеїнкіназу К до кінцевої концентрації 200 мкгімл і інкубували 1год при 370С. Депротеїнізацію проводили сумішшю фенол:хлороформ (1:1) до зникнення інтерфази. Нуклеїнові кислоти осаджували етанолом (2,5 об’єму) при - 20°С. Осад розчиняли у ТЕ буфері, додавали NaCl та РНК-азу А до кінцевих концентрацій 0,5 М і 100 мкгімл, відповідно, та інкубували 1 год при 37°С, після чого здійснювали депротеїнізацію та осаджували ДНК 2,5 об'ємами 9б%-го етанолу при -20 0С.
Електрофорез ядерної ДНК проводили в 0,8%- та 1,7%-ному агарозному гелі, що містив 0,5 мкгімл бромистого етидію в 1хТВЕ [7] при напруженості 3 -4 вісм протягом 5 год. В якості маркерів молекулярних мас застосовували DRgest II (Pharmacia) та RangeRulerTM 200 bp DNA Ladder Plus (“Fermentas”, Литва). Спектр фрагментів ДНК оцінювализа допомогою Total Lab.
В роботі використовували РНКазу А, протеїнкіназу К, сахарозу, агарозу, бромистий етидій, тріс-НО, ЕДТА, Р-меркаптоетанол, додецилсульфат натрію (ДСН), нонидет Р-40, PМSF (“Serva”, Германія), решта реактивів вітчизняного виробництва.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Для об’єктивного аналізу рівня полімерності
яДНК важливе значення має отримання
неушкоджених ядер без цитоплазматичних домішків. В наших дослідженнях найбільш ефективним
виявився метод, ключове положення в якому займає концентрація ядер у вузькій зоні між 50-80% ним гліцерином. Введення нами повторної процедури нашарування суспензії ядер на гліцериновий ступінчастий градієнт дозволило суттєво підвищити ступень очищення ядер від цитоплазматичних домішків та клітинного дебриса. Крім того
запропонований нами підхід мав суттєві переваги в порівнянні з раніше дослідженим методом використання градієнту сахарози, також значно збільшувався і вихід неушкоджених ядер. При цьому їх кількість складала 4,9 х 108 ядер на 1 г тканини. Ступінь чистоти ядерної ДНК визначали спектрофотометрично. Відношення оптичної густини
(О.Д2б0 : °.Д280 = 1,7 - 1,9; °.Д260 : °.Д230 = 2,3).
При кислото-залежних захворюваннях сучасні дослідники приділяють велику увагу динаміці процесів клітинного оновлення в епітелії СОШ під впливом патогенних факторів та різних видів фармакотерапії. Показники проліферативної і апоптозної активності епітелію є важливими критеріями оцінки регенеративного потенціалу СОШ,
ЯДЕРНА ДНК КЛІТИН СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ШЛУНКА ЗА УМОВ ДІЇ СТРЕСУ У ЩУРІВ
що має особливе значення в процесах розвитку адаптації СОШ при тривалому застосуванні нестероїдних антизапальних препаратів [8,9].
В останні роки набула широкого розповсюдження концепція програмованої загибелі клітин (ПЗК) - їх активної участі у процесах власного знищення. Поряд
з цим загибель клітин може відбуватися шляхом некрозу. Найбільш досліджена форма ПЗК - апоптоз, який супроводжується послідовністю характерних біохімічних, морфологічних і фізіологічних змін клітин, серед яких ключове положення займає олігонуклеосомна фрагментація ДНК. В зв’язку з цим ми проводили порівняльне визначення рівня полімерності ядерної ДНК клітин СОШ як за умов стресової моделі виразки шлунка, так і при введенні тваринам екстракту фенугрека на фоні розвитку виразкових ушкоджень.
На рис.1 представлені результати визначення рівня полімерності ДНК клітин СОШ у контрольних тварин у 0,8%-ному агарозному гелі. Як свідчать наші дані, середня молекулярна маса ДНК, виділеної з ядер клітин СОШ інтактних щурів, складає біля 40762 п.н.
1 2
23130■ б557
Рис. 1. Електрофореграма ядерної ДНК клітин СОШ контрольних щурів в 0,8 %-ному агарозному гелі:
1. ДНК -маркер молекулярних мас (DRIgest II,
Pharmacia).
2. яДНК контрольних щурів.
Результати визначення характеру змін в розмірі молекул яДНК в умовах стресової моделі виразки шлунка методом електрофорезу у 1.7 %-ному
агарозному гелі представлені на рис.2.2. На електрофореграмі спостерігається інтенсивна фрагментація яДНК. Фрагменти, що утворились, мають широкий діапазон молекулярних мас (700, 517, 359, 17б п.н.). Причому у низькомолекулярній області їх розмір є кратним приблизно 180 п.н.. Отримані дані свідчать про олігонуклеосомну фрагментацію яДНК у клітинах слизової оболонки шлунку, і дають підставу передбачати, що за умов дії стресу певно здійснюється загибель клітин шляхом апоптозу.
Вивчення біохімічних шляхів регуляції апоптозу дозволить впливати на його етапи з метою можливої корекції, оскільки вважається: якщо клітина гине від апоптозу, то вважається можливим терапевтичне втручання, а якщо внаслідок некрозу - то ні [10].
На стресовій моделі пошкодження СОШ щурів, була досліджена дія екстракту фенугреку. Введення тваринам протягом 8 діб двічі на добу показало, що спостерігаються суттєві зміни в електрофоретичній рухливості яДНК (Рис. 2 в), що проявилось в значному зменшенні кількості низькомолекулярних та відповідно збільшенні вмісту високомолекулярних фрагментів яДНК. Встановлене може свідчити про модифікуючий вплив досліджуваного екстракту. Той факт, що основну масу яДНК складають відносно високомолекулярні фрагменти (15740 п.н.), свідчить про наявність гідролізу яДНК тільки у частини клітин. Отримані результати дозволяють припустити, що в популяції клітин зберігаються такі, які залишаються життєздатними і в подальшому можуть брати участь у регенерації СОШ, активно проліферуючи і відновлюючи тканину, тобто переважаюча більшість клітин знаходяться у здатному до відновлення стані. Не виключено, що у ході репаративної регенерації ушкоджених клітин залучаються додаткові механізми, які сприяють прискоренню клітинного оновлення, але це потребує подальших досліджень.
1 2 З
3000-
2000-
1000-
б00
400
200
Рис. 2. Електрофореграма ядерної ДНК клітин СОШ щурів в 1,7 %-ному агарозному гелі:
1. маркер молекулярних мас (200 bp DNA Ladder Plus),
2. яДНК за умов стресової моделі виразки,
3. яДНК за умов введення тваринам екстракту фенугреку на фоні розвитку виразкових ушкоджень. Виявлені нами пошкодження ДНК при виразковій
хворобі у тварин можуть бути пояснені появою одноланцюгових розривів, наявністю AP-сайтів
Хілько Т.Д., Якубцова І.В., Тищенко О.М., Остапченко Л.І., Макай Ш., Чехун В.Ф.
Як показано в дослідах з культурою тканин [11], високомолекулярні фрагменти ДНК утворюються також і в клітинних лініях та при їх культивуванні в стресових умовах. Після припинення стресової дії рівень фрагментації різко знижується. Встановлений факт свідчити про те, що високомолекулярна фрагментація, є наслідком активації певних процесів метаболізму ДНК, які посилюються під час стресу, або є відповіддю геному на дію стресу.
Відомо, що оксидативний стрес призводить до ушкодження найбільш важливих полімерів - білків, ліпідів; нуклеїнових кислот (окиснення основ компліментарних пар ДНК, їх модифікації, розриви ланцюгів, пошкодження хромосом) [12]. Активні форми кисню та ліпідні гідропероксиди інгібують синтез ДНК і ділення клітин і можуть активувати програмовану загибель клітин, що корисно для організму, тому що ціною загибелі частини клітин попереджує прогресування патологічних процесів і загибель певної популяції клітин.
Деякі автори вважають, що деградація ДНК є органоспецифічною і залежить від виду патології [13]. Можна передбачати, що феномен деградації ДНК і нуклеотидні послідовності деградованих фрагментів ДНК специфічні та відображають певний фізіологічний стан органу.
Оскільки дестабілізація геному є наслідком порушення метаболічних процесів, які підтримують стабільність ДНК, то можна передбачати і корегуючу дію певних хімічних сполук на ці ланцюги метаболізму. Використання екстракту насіння
фенугреку, який містить різноманітні цінні біологічно активні сполуки, що мають широкий спектр їх фармакологічної дії, є важливим для модифікації процесів, що порушуються при стресових впливах, оскільки активні компоненти екстракту викликають мукоїдний ефект, мають антизапальну, антимікробну та антисекреторну дії, сприяють зменшенню продуктів пероксидного окиснення ліпідів та підвищенню рівня антиоксидантних продуктів.
Раніше проведені нами дослідження показників захисту клітин СОШ (глікопротеїнів шлункового слизу, нейтральних та фосфоліпідів мембран клітин, мембранозв’язаних ферментів, факторів місцевого імунітету та цитогістологічні характеристики клітин СОШ) підтверджують вплив активних компонентів екстракту фенугреку на підвищення регенеративного потенціалу клітин поверхневого епітелію, відновлення слизової [14, 15, 16].
За умов виразки спостерігається інтенсивний гідроліз яДНК, тоді як при введенні тваринам екстракту фенугрека рівень фрагментації суттєво знижується, що дозволяє передбачати його модифікуючу дію.
Таким чином, рівень полімерності яДНК виявився чутливим показником ефективності впливу
досліджуваної речовини природного походження на репаративні та регенераційні процеси в клітинах СОШ за умов ульцерогенезу.
Механізми антиапоптотичної дії екстракту фенугреку та блокування пошкоджень клітини потребують подальших досліджень.
Слід відмітити, що подальше вивчення особливостей фрагментації ДНК, регуляції експресії генома можуть стати ключовим підходом у з'ясуванні молекулярно-біологічних процесів досліджуваної патології на рівні ДНК.
ВИСНОВКИ
1. В умовах стресової моделі виразки шлунка у щурів в клітинах СОШ має місце олігонуклеосомна фрагментація яДНК, що свідчить про загибель клітин шляхом апоптозу.
2. При введенні тваринам екстракту фенугрека в клітинах СОШ на фоні розвитку виразкових ушкоджень показано суттєве зменшення рівня фрагментації яДНК, що може свідчити про можливий модифікуючий вплив біоанти-оксидантів екстрактів Trigonella foenum
graecum на ці процеси.
3. Рівень полімерності яДНК може бути показником ефективності впливу біологічно активних сполук природного походження на репаративні та регенераційні процеси в клітинах СОШ за умов ульцерогенезу.
Литература
1. Василишин Р.Й., Щербинина М.Б., Мішалов В.Д. Морфологічні показники регенераторних процесів виразкового дефекту у слизовій оболонці шлунка щурів.!! Вісник проблем біології і медицини.- №2. -2002.
2. Kaviarasan S., Vijayalakshmi K., Anuradha C.V. Polyphenol-rich extract fenugreek seeds protect erytrocytes from oxidative damage. II Plant Foods for Human Nutrition, 2004, 59, P. 143-147.
3. Sur P, Das M, Gomes A, et al. Trigonella foenum graecum (fenugreek) seed extract as an antineoplastic agent.II Phytother Res . - 2001. - №15. - Р.257.
4. Гройсман С.Д.,Каревина Т.Г. О влиянии атропина на стрессорные поражения слизистой обочки желудка у крыс. ИБибл. указ. ВИНИТИ Деп. рукописи. - 1979.
- № 12. - Б^ 131 с.
5. Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений.Отв. ред. Айтхожин М.А., Дощанов Х.И. - Алма-Ата: Наука, 1988. - 168с.
6. Paul A., Ferl R. Assays for studying chromatin structure. II Plant Mol.Biol.Manual. - 1988. - B 2. -P.1- 11.
7. Yoshida A., Shao R.-G., Pommier Y. Assessent of DNA damage in apoptosis. II Apoptosis. A practical approach.
- OXFORD university press. - 1999. - P. 41-55.
ЯДЕРНА ДНК КЛІТИН СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ШЛУНКА ЗА УМОВ ДІЇ СТРЕСУ У ЩУРІВ
8. Аруин Л.И. Апоптоз при патологических процессах в органах пищеварения. // Клин. медицина. —2000. — №1. —С. 5-10.
9. Alderman B.M., McCaffry G.J., Yomans N.D. Nonsteroidal antiinflammatorydrugs and the stomach. // Curr Opin Gastroenterol., 2002, 18(6), P.658-662.
10. Белушкина Н.Н., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза // Арх. патологии. — 2001. —№1. —С. 51-60.
11. Raju J., Patolla J.M.R., Swamy M.V., Rao Ch.V. Diosgenin, a steroid saponin of Trigonella foenum graecum (fenugreek), inhibits azoxymetane-induced aberrant crypt Foci formation in F344 rats and induced apoptosis in HT-29 human colon cancer cells. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. - 2004. - 13(8). p. 13921398.
12. Farinati F., Cardin R., Degan P., Rugge M., Di Mario F., Bonvicini P.,Naccarato R. Oxidative DNA damage accumulation in gastric carcinogenesis. // Carcinogenesis. - 2001. - Vol. 22, No. 12. - P.1947-1953.
13. Джербашьян А.Р., Захарян Р.А., Казарян П.А.,
Симонян С.Н., Карагезян К.Г. Апоптоз и деградация ДНК: теория отражения физиологического
состояния организма в деградированности ДНК. -ДНАН Армении. - 2000. - Т. 100, №1. - С. 60-63.
14. Проценко Т., Якубцова І., Чурілова Е., Осипенко К. Вплив екстракту насіння фенугрека (Trigonella foenum graecum) на вміст моносахаридів глікопротеїнів дуоденального слизу щурів за умов розвитку виразкової хвороби дванадцятипалої кишки. II Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. - 2006, вип.іі. -С.42-45.
15. Yakubtsova I., Khilko T., Preobrazhenska T., Senin S., Ostapchenko L., Makai S. Cytoprotective influence of complex of biologically active substances at experimental ulcerogenesis. II III International Conference Neuro-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes. - 2007.P. 50-51.
16. Якубцова І.В., Хілько Т.Д., Галазюк Л.В., Макай Ш., Левківська О. Корекція імунних порушень при експериметальній виразковій хворобі шлунка у щурів. II Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. -- 2007. - №12. -С.47-51.
ЯДЕРНАЯ ДНК СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ СТРЕССА У КРЫС Хилько Т.Д., Якубцова И.В., Тищенко О.М., Остапченко Л.И., Макай Ш., Чехун В.Ф.
Проведены срасвнительные исследования уроня полимеризации ядерной ДНК клеток слизистой оболочки желудка крыс как при условии воздействия стресса, так и интрагастральном введении животным экстракта Trigonella йэепит graecum на фоне развития язвенных повреждений.
Ключевые слова: ядерная ДНК, клетки слизистой оболочки желудка, стрессовая язва.
GASTRIC MUCOSA CELLS NUCLEAR DNA AT STRESS ULCER MODEL IN RATS
Khilko T.D., Yakubtsova I.V., Preobrazhenska T.D., Makai S.P., Ostapchenko L.I., ttekhun V.F.
Comparative determination of the level of nuclear DNA polymerization in gastric mucosa cells carried out at stress gastric ulcer model as well as to animals by intragastrically administration of Trigonella foenum graecum extract. Key words: nuclear DNA, gastric mucosa cells, stress ulcer.
Key words: nuclear DNA, gastric mucosa cells, stress ulcer.
