CC BY
25© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
И.М.Грубер, Н.Б.Егорова, Н.А.Михайлова, Л.С.Черкасова,
0.Е.Тарасова, Е.А.Асташкина, О.М.Игнатова, Е.А.Курбатова
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИНЫ «СТАФИЛОВАК-2»
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва
Цель. Исследование протективных свойств вакцины «Стафиловак-2». Материалы и методы. Образцы вакцины, приготовленной на производстве НПО «Микроген» по разработанной технологии, изучены на мышах линии BALB/с при 3- и 6-кратных схемах иммунизации. Определена протективная активность препарата в опытах активной и пассивной защиты при внутрибрюшинном заражении, исследована высеваемость возбудителя из селезенки и почек при внутривенном заражении животных. Результаты. В опытах активной защиты мышей как при 3-кратной, так и при 6-кратной схемах иммунизации определена существенная протективная активность изученных серий по сравнению с группой контрольных мышей. Сыворотки, полученные после иммунизации животных (кролики, мыши) стафилококковой вакциной, обладали протективными свойствами. На модели генерализованной стафилококковой инфекции выявлено снижение степени об-семененности Staphylococcus aureus селезенки и почек у иммунизированных мышей по сравнению с контрольной группой. Заключение. Проведенные доклинические исследования вакцины «Стафиловак-2», разработанной на основе комплекса протективных антигенов стафилококков, подтвердили высокую протективную активность препарата.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 54—58
Ключевые слова: вакцина «Стафиловак-2», сыворотки, протективная активность, вы-севаемость
1.M.Gruber, N.B.Egorova, N.A.Mikhailova, L.S.Cherkasova, O.E.Tarasova, E.A.Astashkina, O.M.Ignatova, E.A.Kurbatova
STUDY OF PROTECTIVE ACTIVITY OF «STAPHYLOVAC-2» VACCINE
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Study the protective properties of«Staphylovac-2» vaccine. Materials and methods. Samples of the vaccine manufactured by SPA «Microgen» based on the developed technology were studied in balb/c mice during 3- and 6-fold immunization schemes. Protective activity of the preparation was determined in experiments with active and passive protection during intraperitoneal infection, seeding of the causative agent from spleen and kidneys during intravenous infection of animals. Results. In experiments with active protection ofmice for both 3- and 6-fold immunization schemes, a significant protective activity of the studied series was determined compared with the control group of mice. Sera obtained after animal immunization (rabbits, mice) by staphylococcus vaccine had protective properties. A reduction of spleen and kidneys seeding by Staphylococcus aureus in immunized mice compared with the control group was detected in the model of generalized staphylococci infection. Conclusion. The preclinical studies carried out with the «Staphylovac-2» vaccine, developed based on the complex of protective staphylococci antigens, have confirmed the high protective activity of the preparation.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 54—58
Key words: «Staphylovac-2» vaccine, sera, protective activity, seeding
ВВЕДЕНИЕ
Многочисленные усилия исследователей по разработке стафилококковых вакцин, проводимые в мире, до настоящего времени не увенчались успехом. Эффективных коммерческих иммунопрепаратов для контроля стафилококковой инфекции прак-
тически не создано [6 — 11]. Экспертная оценка неудач в этом направлении показала, что конструирование вакцин на основе 1 — 2 антигенов З.аигеш не обеспечивает достаточный протективный эффект, поскольку возбудитель имеет много значимых факторов патогенности [10].
Результаты неудачных клинических испытаний моновалентных вакцин определяют целесообразность исследования протективных антигенов стафилококка и новых подходов для их выделений и использования в вакцинных композициях [3]. Согласно этому направлению в НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова разработана вакцина «Стафиловак» на основе протективных антигенов (пептидогликан, тейхоевые кислоты, лабильные белковые антигены и др.), выделенных из 4 отобранных имму-ногенных штаммов З.аигеш, обладающих внутривидовой перекрестной протективной активностью. Антигены, входящие в состав вакцины, являются агонистами То11-подобных рецепторов [10] и обеспечивают стимуляцию врожденного и адаптивного противостафилококкового иммунитета [4, 5]. Разработан технологичный способ получения препарата, включающий реакторное культивирование З.аигеш и мембранные методы выделения и очистки.
Цель работы — доклинические испытания протективных свойств экспериментально производственных серий вакцины «Стафиловак-2».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вакцина «Стафиловак-2» — лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения в комплекте с растворителем, произведена НПО «Микроген» Минздрава РФ (серии У2 и У3).
В работе использованы мыши линии BALB/с массой 12 — 14 г (самцы) из питомника филиал Андреевка НЦБМТ, содержащиеся в условиях вивария НИИВС им. И.И.Мечникова.
В настоящем исследовании использованы две схемы иммунизации, предусматривающие введение 0,5 мг вакцины с интервалом между инъекциями 7 суток: при первой животным производили 1 подкожную и 2 внутрибрюшинные инъекции (3-кратная), при второй — 3 подкожные и 3 внутрибрюшинные инъекции (6-кратная). Для оценки протективной активности стафилококковой вакцины через 14 дней после последней иммунизации проводили заражение мышей внутрибрюшинно четырьмя двукратно убывающими дозами З.аигеш № 1986 в 0,4% голодном агаре. Опыт сопровождали контролем, для чего использовали интактных мышей той же партии, которых заражали теми же дозами живой вирулентной культуры стафилококка. По отношению числа павших мышей к зараженным определяли LD50 в каждой группе и индекс эффективности — ИЭ (отношение LD50 иммунизированных мышей к LD50 неиммуни-зированных). Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием критерия согласия Пирсона %2 [1].
Исследование протективной активности вакцины проводили в трех вариантах экспериментов на мышах: изучение обсемененности органов иммунизированных мышей и зараженных сублетальной дозой S.aureus; изучение выживаемости вакцинированных мышей при заражении их смертельными дозами S.aureus; изучение защитной активности сывороток иммунизированных мышей и кроликов.
Для изучения высеваемости S.aureus из органов мышей, вакцинированных 3- и 6-кратно, заражали через 14 дней после последней иммунизации внутривенно ретро-орбитально сублетальной дозой, равной 0,1 LD50, которую вводили в 0,1 мл 0,9% раствора натрия хлорида. На 1, 4 и 7 сутки мышей выводили из опыта под эфирным наркозом. Высевы проводили с соблюдением условий стерильности. Каждый извлеченный при вскрытии орган (почку, селезенку) помещали в пробирку с определенным количеством стеклянного песка. Затем в пробирку добавляли 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 0,1 г массы органа. Орган растирали стеклянной палочкой, после чего осуществляли высев 0,1 мл полученной гомогенизированной массы на питательный агар. Посевы инкубировали при 37°С 16 — 18 ч. Учет результатов высева проводили через 18 часов путем подсчета КОЕ и определения ^ КОЕ/г. В качестве контроля использовали органы неиммунизированных животных.
Для исследования протективной активности использовали иммунные кроличьи и мышиные сыворотки, полученные в результате 6-кратной схемы иммунизации. При постановке эксперимента пассивной защиты мышам линии BALB/c вводили внутри-брюшинно по 0,5 мл разведенных в 5 раз сывороток, полученных от иммунных и интактных животных. Контрольной группе интактных животных вводили внутри-брюшинно 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Через 2 ч после введения сывороток животных заражали внутрибрюшинно 4 LD50 S. aureus № 1986 в 0,4% голодном агаре. Наблюдали за количеством выживших мышей в опыте и контроле (интактные животные) в динамике в течение 7 суток и рассчитывали критерий значимости различий.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 7.0), Exel и BioStat D. Достоверность различий между средними показателями оценивали с помощью критерия Стьюдента и критерия согласия Пирсона %2 [1], критерия значимости различий Z по методу [2]. Различия рассматривались как значимые при p<0,05.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Для изучения высеваемости S была разработана модель генерализованной стафилококковой инфекции, заключающаяся во внутривенном ретроорбитальном заражении мышей сублетальной дозой 0,1 LD5o. Результаты представлены по отношению количества мышей, у которых высевали S.aureus из органов, к числу зараженных животных. Количественное содержание S.aureus в органах зараженных мышей выражали в ^ КОЕ/г.
В предварительных экспериментах было определено, что через 1 сутки после заражения из селезенки и почек у всех иммунизированных и контрольных мышей высевали стафилококк, поэтому в последующих исследованиях высевы производили через 4 и 7 суток после заражения. Полученные данные представлены раздельно по высевам из селезенки и из почек, значимость различий между опытом и контролем определена на основании критерия Стъюдента (табл. 1 и 2).
У всех групп мышей через 4 суток выявлена высокая обсеме-ненность селезенки, однако через 7 суток наблюдали снижение вы-севаемости как по проценту мышей, у которых высевали S.aureus, причем особенно при 6-кратной иммунизации, так и по КОЕ/г по сравнению с контролем.
При исследовании высеваемо-сти из почек (табл. 2) получены
aureus из органов вакцинированных животных
Таблица 1. Результаты высевов из селезенок мышей, иммунизированных вакциной серий У2 и У3 через 4 и 7 суток после заражения S.aureus № 1986 в дозе 1,0х108
Сутки после заражения Иммунизация Высеваемость по отношению количества мышей с высевами к числу зараженных lg КОЕ/г Х±т
серия кратность абс. %, Х±т
4 У2 6 4/4 100 3,61±0,34
3 6/6 100 4,08±0,97
К — 3/3 100 3,94±0,36
7 У2 6 4/10 40±15,5* 3,07±0,29*
3 6/10 60±15,5 3,17±0,74
У3 6 1/9 11±10** 2,9±0,30*
3 4/9 44±16,5* 3,28±0,62
К — 9/10 90±9,5 3,86±0,56
Примечание. Значимость различий между опытом и контролем):* р<0,05; ** р<0,001.
Таблица 2. Результаты высевов из почек мышеи, иммунизированных вакциной серий У2 и У3 через 4 и 7 суток после заражения 8.аигеш № 1986 в дозе 1,0х108
Сутки после заражения Иммунизация Высеваемость по отношению количества мышей с высевами к числу зараженных lg КОЕ/г Х±т
серия кратность абс. %
4 У2 6 4/4 100 7,6±0,2
3 6/6 100 7,33±0,31
К — 3/3 100 7,7±0
7 У2 6 10/10 100 7,71±0,48**
3 10/10 100 7,72±0,43**
У3 6 9/9 100 7,82±0,43*
3 9/9 100 7,27±1,13*
К — 10/10 100 8,38±0,33
Примечание. Значимость различий между опытом и контролем: * р<0,05;** р<0,01.
несколько иные результаты. Таблица 3. Протективная активность вакцины при разных Высевы из почек были поло- схемах иммунизации мышей при внутрибрюшинном
жительными (100%) у иммунизированных и контрольных животных через 4 и 7 суток, однако по КОЕ/г выявлены существенные различия через 7 суток после заражения между всеми группами иммунизированных в сравнении с контрольными животными.
Результаты изучения стафилококковой вакцины в опытах активной защиты мышей приведены в табл. 3 и свидетельствуют о существенной протективной активности изученных серий препарата при 3- и 6-кратной схемах иммунизации, поскольку по критерию х2 значимость различий (р) с контрольной неиммунизирован-ной группой мышей составляла от 0,005 до <0,001.
Дальнейшим этапом исследований явилось определение протективной активности кроличьих и мышиных сывороток, полученных при иммунизации соответствующего вида животных серией У2 стафилококковой вакцины. В предварительном эксперименте была определена заражающая доза штамма S.aureus № 1986, которая составила 1,0х109 микробных клеток.
На основании приведенных результатов (табл. 4) можно заключить, что иммунные сыворотки, полученные после иммунизации животных (кролики, мыши) стафилококковой вакциной, обладают протективными свойствами (р<0,05). Следует отметить, что сыворотки интактных животных также обладают определенной степенью защиты. Иммунные кроличьи сыворотки обеспечивали 100% защиту мышей, а сыворотки от интактных кроликов — 70%. В этом опыте выжили и 35% контрольных мышей, которым сыворотку вообще не вводили. Примерно такое же соотношение отмечено в числе выживших мышей, которым вводили мышиные сыворотки.
заражении S.aureus № 1986
Иммунизация в дозе 0,5 мг/мышь Заражение 8.ашеш № 1986, доза х108 м.к. Эффект (отношение числа павших мышей к зараженным) По сравнению с контролем LD50 х108 ИЭ
серия кратность X2 р
У2 3 1,25 2/10 11,96 <0,001 3,30 2,82
2,5 4/10
5,0 7/10
10,0 8/10
6 1,25 0/10 9,298 0,002 2,87 2,45
2,5 4/10
5,0 9/10
10,0 10/10
У3 3 1,25 2/10 8,067 0,005 2,68 2,29
2,5 5/10
5,0 8/10
10,0 9/10
6 1,25 0/10 10,596 0,001 3,08 2,63
2,5 5/10
5,0 8/10
10,0 9/10
Контроль 1,25 8/10 1,17
(интактные, 2,5 9/10
0,9% раствор 5,0 9/10
натрия хлорида) 10,0 10/10
ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное исследование выявило выраженную протективную активность стафилококковой вакцины. Это показано на модели генерализованной стафилококковой
Таблица 4. Протективная активность иммунных сывороток кроликов и мышей
Сыворотка Количество Падеж по суткам: Кол-во мышей через 7 сут Различия с контролем
зараженных
вид животного наименование мышей 1 2 3 4 живы пали критерий Z р
Кролики иммунные 20 20 0 4,72 <0,05
интактные 20 3 1 1 1 14 6 3,07 <0,05
контроль 20 9 4 7 13
Мыши иммунные 10 2 1 7 3 2,07 <0,05
интактные 10 6 4 6 0,95 >0,05
контроль 10 8 2 8
инфекции по степени обсемененности S.aureus селезенки и почек при сравнении этого показателя с уровнем у контрольных (неиммунизированных) мышей.
Об этом же свидетельствуют данные, полученные при внутрибрюшинном заражении иммунизированных мышей. Высокая степень протективной активности разработанной вакцины подтверждена не только по LD5o и индексу эффективности, но и по критерию согласия Пирсона %2 с высоким уровнем достоверности (р=0,005 — <0,001). В этих экспериментах выявлена четкая зависимость эффекта от заражающей дозы и кратности иммунизации: так, от меньшей заражающей дозы (1,25х108) в группах 6-кратно вакцинированных все мыши живы, в группах 3-кратно вакцинированных мышей пали по 2 мыши, тогда как в контрольной группе от этой же дозы пали 8 из 10 зараженных мышей (между опытными и контрольной группой р<0,05). Результаты исследования показывают также важную роль в создаваемом вакциной гуморальном иммунитете, о чем свидетельствует протективный эффект сывороток, полученных от иммунизированных стафилококковой вакциной кроликов и мышей.
Представленные материалы позволяют заключить, что стратегия конструирования стафилококковых мультивалентных вакцин на основе антигенных компонентов, выделяемых из иммуногенных штаммов, позволяет получить препараты с высокой про-тективной активностью. Выявленные протективные свойства иммунных сывороток животных позволяют подтвердить перспективность использования в терапии стафилококковой инфекции антител против важнейших факторов вирулентности S.aureus.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» по контракту 16.N08.12.1004 «Доклинические исследования лекарственного средства для профилактики и терапии гнойно-септических внутрибольничных инфекций, вызываемых условно патогенными бактериями».
ЛИТЕРАТУРА
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., Медгиз, 1962.
2. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1999.
3. Грубер И.М., Егорова Н.Б., Курбатова Е.А., Михайлова Н.А. Стратегия разработки противостафилококковых иммунопрофилактических и иммунотерапевтических препаратов. Эпидемиол. инфекц. бол. Актуальные вопросы. 2013, 4: 31-38.
4. Ефремова В.Н., Егорова Н.Б., Масюкова С.А. Бесклеточная антистафилококковая вакцина для лечения хронической стафилококковой инфекции. Патент на изобретение № 2122862 от 10.12.1998.
5. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Грубер И.М. Экспериментальная и клинико-иммунологическая оценка бесклеточной стафилококковой вакцины «Стафиловак». Журн. микробиол. 2008, 6: 102-108.
6. Bubeck W.J., Palazzolo-Ballance A.M., Otto M. et al. Panton-Valentine leukocidin is not a virulence determinant in murine models of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease. J. Infect. Dis. Oct. 2008, 198 (8): 1166-1170.
7. Etz H., Minh D.B., Henics T. et al. Identification of in vivo expressed vaccine candidate antigens from Staphylococcus aureus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99 (10): 6573-6578.
8. Lee S.S., Kim Y.J., Chung D.R., et al. Invasive infection caused by community-associated methicillin-resistant strain not carrying Panton-valentine leukocidin in Korea. J. Clin. Microbiol. 2009, 48 (1): 311-313.
9. Medzhitov R., Janeway Jr. C.A. Innate immune induction of the adaptive immune response. Cold Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 2002, 64: 429-435.
10. Otto M. Novel targeted immunotherapy approaches for staphylococcal infection. Expert. Opin. Biol. Ther. 2010, 10 (7): 1049-1059.
11. Rosengren A.T., Nyman T.A., Lashesman R. Proteonic profiling of interleukine 12 treated human T-helper cells. Proteomics. 2005, 5 (12): 3137-3141.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Грубер Ирина Мироновна, зав. лаб., д.м.н., проф., 105064, Москва, М.Казенный пер.,5а, р.т.(495)916-20-47
