CC BY
1410. Солодовников Ю.П., Иваненко А.В., Устюжанин В.Ю., Мефодьев В.В., Филатов Н.Н., Самчук Г.Ф., Ушакова Н.С. Классификация кишечных инфекций: инфекции, ассоциированные с водным и пищевым путями передачи возбудителя. Журн. микробиол. 2009, 1: 94-96.
11. Хайтович А.Б. Биологические свойства Vibrio cholerae как составная часть эпиднадзора за холерой. Журн.микробиол. 2001, 1: 5-9.
Поступила 20.10.13
Контактная информация: Селянская Надежда Александровна, к.м.н., 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117, р.т. (863)240-91-33
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Л.С.Черкасова1, Н.Г.Плеханова2, О.Е.Тарасова1, Е.А.Асташкина1, Н.В.Мельников3, И.М.Грубер1, Н.Б.Егорова1, Н.А.Михайлова1
ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СЕРИЙ ВАКЦИНЫ «СТАФИЛОВАК-2»
1НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, Москва, 2Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, 3Уфимский филиал НПО «Микроген»
Цель. Изучение экспериментально производственных серий «Стафиловак-2» по накоплению специфических IgG и безопасности. Материалы и методы. Опытные производственные образцы стафилококковой вакцины изучены по накоплению специфических IgG в сыворотках иммунизированных мышей линии BALB/c в ИФА. Безопасность вакцины оценивали в тестах острой и хронической токсичности, включающих патоморфо-логические и гистологические, гематологические и биохимические исследования, изучение влияния на центральную нервную систему. Результаты. Отмечено статистически значимое (в 2,6 — 3,0 раза) увеличение уровня IgG в сыворотках иммунизированных животных по сравнению с контролем. В экспериментах изучения острой и хронической токсичности ни на одном сроке наблюдения прирост в массе тела и массе внутренних органов не отличался от данных, полученных у контрольных животных. Ни по одному из изученных методов оценки безопасности изучаемые серии вакцин не показали отличий от контроля. Заключение. Рекомендуемая для подкожного введения человеку доза 200 мкг является экспериментально обоснованной и может служить основанием для проведения клинического исследования стафилококковой вакцины на людях.
Журн. микробиол., 2014, № 5, С. 86—90
Ключевые слова: вакцина «Стафиловак-2», сыворотки, острая и хроническая токсичность
L.S.Cherkasova1, N.G.Plekhanova2, O.E.Tarasova1, E.A.Astashkina1, N.V.Melnikov3, I.M.Gruber1, N.B.Egorova1, N.A.Mikhailova1
IMMUNOGENIC PROPERTIES OF EXPERIMENTAL PRODUCTION SERIES OF STAPHYLOVAC-2 VACCINE
1Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, 2\blgograd Institute of Plague Control, 3Ufa Branch of Scientific Production Association «Microgen», Russia
Aim. Study experimental production series of Staphylovac-2 by accumulation of specific IgG and safety. Materials and methods. Experimental production samples of staphylococci vaccines were studied by the accumulation of specific IgG in sera of immunized BALB/c line mice in EIA. Safety was evaluated in tests of acute and chronic toxicity including pathomorphology and histologic, hematologic and biochemical studies, studies of the effect on central nervous system.
Results. A statistically significant (2.6 — 3.0 times) increase of IgG levels in sera of immunized mice compared with control was noted. In the experiments studying acute and chronic toxicity the increase in body mass and mass of internal organs differed from data obtained from control animals at no observation periods. None of the studied methods of safety evaluation showed differences of the studied vaccine series from the control. Conclusion. The recommended dose for subcutaneous administration into human of 200 ^g is experimentally justified and could be the basis for carrying out clinical studies of staphylococci vaccines in humans.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 5, P. 86—90
Key words: Staphylovac-2 vaccine, sera, acute and chronic toxicity
В настоящее время в практике здравоохранения для профилактики и лечения стафилококковой инфекции отсутствуют эффективные коммерческие иммунопре-параты [3]. Еще в 90-е годы прошлого столетия была разработана сухая бесклеточная стафилококковая вакцина «Стафиловак-1», представляющая собой протективный комплекс антигенов клеточной стенки стафилококков, которая была разрешена к применению в 1996 г. при комплексной терапии хронических стафилококковых инфекций [2]. В последующем был расширен штаммовый состав продуцентов антигенного комплекса и разработан современный способ получения препарата, включающий реакторное культивирование вакцинных штаммов Staphylococcus aureus и мембранные методы выделения и очистки. В рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности РФ на период до 2020 г. и дальнейшую перспективу» был выполнен комплекс доклинических исследований модифицированной вакцины «Стафиловак-2», включающий приготовление экспериментально производственных серий стафилококковой вакцины. Цель работы — изучение безопасности и иммуно-генных свойств новых экспериментально производственных серий вакцины «Стафиловак-2».
Проведено исследование опытно производственных образцов «Стафиловак-2» серий У1, У2 и У3, изготовленных в Уфимском филиале НПО «Микроген» Минздрава России, предназначенных для проведения доклинических исследований. Серии были отконтролированы после получения и установлено их соответствие нормативным требованиям качества. В качестве препарата сравнения использованы экспериментальные серии №№ 49 и 51, соответствующие нормативным требованиям. В работе использованы мыши линии BALB/с массой 12 — 14 г (самцы) и 18 — 20 г, морские свинки (самки и самцы) массой 240 — 260 г. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили по разработанным схемам им-мунизаций — трехкратной (1 подкожная + 2 внутрибрюшинных) и шестикратной (3 подкожных +3 внутрибрюшинных) с интервалом 7 дней по 0,5 мг препарата [2]. В качестве иммунизирующих препаратов использовали вакцины серий У2 и 51 (препарат сравнения). Сыворотки изучали с помощью непрямого твердофазного метода ИФА на плоскодонных планшетах с сорбцией антигена 0,1 мкг/лунка [1]. Процесс сорбции проводили последовательно в двух температурных режимах: 2 часа при температуре 37°С, а далее 12 часов — при 8°C. Перед внесением сывороток ячейки планшетов трехкратно промывали 0,02М фосфатно-солевым буфером (рН 7,4), содержащим Твин-20. Объем вносимой сыворотки в рабочем разведении — 100 мкл в лунку, время инкубации при 20 — 22°С — 1 час. После инкубации содержимое лунок вытряхивали, а несвязавшиеся антитела удаляли отмывочным буферным расвором трехкратно, затем ячейки заполняли раствором конъюгата (100 мкл/лунка) — антитела диагностические против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (Медгамал, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи). В предварительных экспериментах были подобраны
рабочие разведения сывороток крови мышей — 1:100 и конъюгата — 1:200, позволяющие выявить наибольшие отличия от сывороток интактных животных. После удаления раствора несвязавшийся конъюгат тщательно отмывали трехкратно тем же буферным раствором. Проявление ферментативной активности пероксидазы в связавшемся конъюгате проводили с использованием субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (НПО «Био Тест Системы») в объеме 100 мкл/лунка. Время инкубации при 20 — 22°С — 15 мин. Реакцию останавливали внесением в лунку планшета по 50 мкл 0,2М раствора серной кислоты. Оптическую плотность определяли на ИФА-ридере («Mark», Япония) при длине волны 450 нм. Результаты оценивали по разнице оптической плотности сывороток иммунизированных животных и фона.
Изучение безопасности опытно промышленной серии «Стафиловак-2» предпринято в рамках общей программы изучения безопасности препарата на стадии доклинического исследования в соответствии с требованиями Федерального закона от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», согласно Правилам лабораторной практики в РФ (Приказ Минздрава РФ № 708н от 23.08.2010 г.). Изучение острой токсичности проводили на двух видах животных: мыши (самки и самцы) массой 18 — 20 г линии BALB/с и морских свинках (самки и самцы) массой от 250 до 350 г. Серии вакцины мышам вводили двумя методами — внутрибрюшинно и подкожно (метод, рекомендуемый для человека) в дозах (40, 200, 1000, 5000 мкг) в объеме 0,5 мл. Контрольным животным вводили 0,9% раствор натрия хлорида. Морским свинкам опытный образец стафилококковой вакцины вводили только подкожно в дозе 200 мкг (доза, рекомендуемая для человека) в объеме 0,5 мл. Наблюдение за животными (регистрация возможной гибели, масса животных, наличие возможных клинических симптомов интоксикации) проводили в течение 14 суток после введения препарата. Для патоморфологического и гистологического исследования использованы мыши через 24 ч, 4 — 7 — 14 суток после подкожного введения 200 мкг препарата. Изучение хронической токсичности проводили на мышах (самки и самцы) массой 18 — 20 г. Вакцины вводили подкожно ежедневно в течение 20 дней в эквивалентной дозе (ЭД), предлагаемой для человека при пересчете на 1 кг массы тела: 0,5 мкг (10 ЭД) и 5 мкг (100 ЭД). Наблюдение за животными проводили в течение периода введения препарата и последующих 14 суток. Гематологические (определение уровня гемоглобина, количества эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов со счетом лейкоцитарной формулы) и биохимические исследования (определение общего белка, глюкозы, мочевины, холестерина, билирубина, креатинина) проводили на 21 и 35 дни наблюдения. Для патоморфологического исследования животных подвергали эвтаназии на следующие сутки после последнего введения препарата и в день окончания наблюдения. Изучение влияния «Стафиловак-2» на центральную нервную систему проводили на мышах в тесте ориентировочной реакции и в судорожной пробе с тиосемикарбозидом за 1 сутки до введения препарата и на следующий день после ежедневного 20-дневного введения препарата в дозах 10 и 100 ЭД. Реакцию мышей в «норковом рефлексе» оценивали по числу совершаемых заглядываний в отверстия площадки в течение 2 мин, «стойки» ориентировочного рефлекса подсчитывали в течение 2 мин наблюдения. При постановке судорожной пробы с тиосемикарбозидом его вводили в объеме 0,2 мл (35 мг/кг) через 24 ч после введения препаратов. Результат оценивали по времени гибели каждого животного. Патоморфологические исследования осуществляли с использованием стандартных методов, в том числе с приготовлением гистологических препаратов. Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Biostat D, Statistica ver. 7.0.
Одним из показателей, свидетельствующих о влиянии «Стафиловак-2» на систему адаптивного иммунитета, является уровень специфических IgG в сыворотках иммунизированных мышей, который определяли в ИФА.
При определении в ИФА выявлено статистически значимое (в 2,6 — 3,0 раза) увеличение уровня IgG в сыворотках иммунизированных животных по сравнению с
контролем. При этом различий, связанных со схемой иммунизации, не отмечено (при 6-кратной серией 51 по сравнению с 3-кратной наблюдается незначимое увеличение оптической плотности — р=0,414). При трехкратной и шестикратной иммунизации вакциной У2-ДОП, соответственно, 0,580±0,03 и 0,568±0,03. Для определения в ИФА титра специфических IgG в сыворотках иммунизированных мышей сыворотки разводили двукратно от разведения 1:50 до 1:6400. Полученные результаты подтвердили однотипность иммунного ответа, полученного при 3- и 6-кратных иммунизациях образцом вакцины (серия У2) и экспериментальной серией вакцины (серия 51). Титр сывороток, определяемый как ДОП <0,2 >0,1, составлял для иммунных сывороток 1:400 — 1:800 при 1:100 — 1:200 для сывороток интактных мышей.
Результаты изучения острой токсичности, полученные при определении средней массы тела и прироста массы тела мышей после внутрибрюшинного введения вакцины серии У2, показали отсутствие статистически значимых различий между животными, получавшими тестируемый препарат, и контрольными животными вне зависимости от исследуемых доз и пола животных. Такие же исследования проведены с использованием серии № 49, и получены аналогичные результаты. При подкожном введении опытного образца вакцины также не было выявлено различий между вакцинированными и интактными животными. Проведенное исследование показало отсутствие макро- и микроскопических патоморфологических изменений в органах (печень, почки, надпочечники, сердце, легкое, тимус, селезенка) как у мышей, так и у морских свинок. При оценке местного действия определено, что изучаемая вакцина серии У2 не обладала выраженным воспалительным эффектом: при подкожном введении морским свинкам ее действие не отличалось от уровня воспалительной реакции у животных контрольной группы.
При изучении хронической токсичности во всех группах наблюдали увеличение массы тела животных. Прирост массы животных, которым вводили препараты «Стафиловак-2», ни в одном сроке наблюдения достоверно не отличался от прироста массы контрольных животных. В результате патоморфологического исследования не отмечено снижения массы внутренних органов, образования воспалительных изменений в месте введения, гибели животных, что свидетельствует об отсутствии токсического действия препарата на системы и органы лабораторных животных или снижения их активности и физиологических функций.
Проведение гематологических (определение уровня гемоглобина, количества эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов со счетом лейкоцитарной формулы) и биохимических исследований (определение общего белка, глюкозы, мочевины, холестерина, билирубина, креатинина) при многократном введении двух серий вакцины мышам в дозах 10 ЭД и 100 ЭД не выявило различий с контрольными животными. Достоверных различий в ориентировочных реакциях между дозами «Стафиловак-2» (10 и 100 ЭД) и контролем не выявлено. «Норковый рефлекс»: до введения вакцины 11,3 — 10,7 — 10,7; на 21 сутки — 9,4 —9,8 — 9,9 соответственно. «Стойка»: до введения вакцины 12,9 — 12,5 — 12,6, на 21 сутки — 12,8 —11,8 — 11,9 соответственно. При постановке судорожной пробы с тиосемикарбозидом полученные результаты свидетельствовали о том, что введение «Стафиловак-2» не оказывает влияния на продолжительность жизни мышей.
Таким образом, при исследовании влияния «Стафиловак-2» на активацию адаптивного иммунитета было показано увеличение (в 2,6 — 3,0 раза) специфических IgG в сыворотках крови мышей в ИФА при иммунизации опытно производственной и экспериментальной сериями вакцин. При изучении токсичности «Стафиловак-2» выявлено отсутствие таковой: максимальная из испытанных доз для мышей (5 000 мкг) превышала дозу, рекомендуемую для человека (200 мкг) в 25 раз, не вызывая гибели животных, снижения массы их тела и симптомов интоксикации. Для морских свинок при подкожном введении хорошо переносится доза 200 мкг. При исследовании хронической токсичности с использованием 100 эквивалентных доз для человека не
обнаружено патоморфологических изменений во внутренних органах мышей, гематологических показателях, влияния на процессы торможения и возбуждения центральной нервной системы. Следовательно, рекомендуемая для подкожного введения человеку доза 200 мкг является экспериментально обоснованной. Полученные результаты показали, что экспериментально производственные серии вакцины «Стафиловак-2» иммуногенны и безопасны и могут быть рекомендованы для проведения клинического исследования вакцины на людях.
Л ИТЕРАТУРА
1. Антитела. Методы. Под ред. Д. Кэтти. М., Мир, 1991.
2. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Грубер И.М. Экспериментальная и клинико-иммунологическая оценка бесклеточной стафилококковой вакцины «Стафиловак». Журн. микробиол. 2008, 6: 102-108.
3. Otto M. Novel targeted immunotherapy approaches for staphylococcal infection. Expert Opin. Biol. Ther. 2010, 10 (7): 1049-1059.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Грубер Ирина Мироновна, д.м.н., проф., 105064, Москва, М.Казенный пер.,5а, р.т. (495)916-20-47
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
В.А.Гриценко1, Т.В.Бирюкова2, А.А.Вялкова2, Ю.Б.Иванов1
ВИДОВАЯ СТРУКТУРА И ХАРАКТЕРИСТИКА БИОПРОФИЛЯ СТАФИЛОКОККОВ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ ОРЕНБУРГА
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2Оренбургская государственная медицинская академия
Цель. Анализ таксономической структуры и биопрофиля стафилококков — возбудителей кожных и глазных форм перинатальной инфекционно-воспалительной патологии (ИВП) у новорожденных Оренбурга. Материалы и методы. Проведено бактериологическое исследование у 308 новорожденных с клиническими признаками кожных и глазных форм перинатальной ИВП с выделением из очагов поражения микроорганизмов и их видовой (родовой) идентификацией общепринятыми методами. У выделенных штаммов стафилококков определяли наличие гемолитической, антилизоцимной активности, способность к образованию биопленок, устойчивость к антимикробным катионным пептидам лейкоцитов (интерцид) и тромбоцитов (тромбодефенсины) человека, чувствительность к антибиотикам. Результаты. Установлено, что стафилококки доминировали в структуре возбудителей кожных и глазных форм перинатальной ИВП (76,2%), а среди них приоритетное место занимали коагулазотрицательные стафилококки (82,4+3,4%). Стафилококки обладали выраженным патогенным потенциалом и часто обладали антибиотикорезистент-ностью. Заключение. Перинатальная ИВП рассматривается как вариант эндогенной бактериальной инфекции. Обосновывается необходимость проведения микробиологического мониторинга для разработки эффективных подходов к терапии и профилактике перинатальной ИВП.
Журн. микробиол., 2014, № 5, С. 90—95
Ключевые слова: перинатальная инфекционно-воспалительная патология, Staphylococcus aureus, коагулазоотрицательные стафилококки, патогенный потенциал, антибиотико-резистентность
