CC BY
116. Золотова Т. В., Панченко С. Н. Экспериментальная сенсоневральная тугоухость ототоксического генеза у животных: апоптический путь гибели клеток спирального органа // Вестн. оторинолар. - 2010. -№4. - С. 29-32.
7. Зенков Н. К., Ланкин В. З., Менщикова Е. Б. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты. М.: Медицина, 2001. 343 с.
8. Ланкин З. В., Тихадзе А. К., Беленков Ю. Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях: пособие для врачей. М.: Медицина, 2001. 78 с.
9. Райская-Качесова О. Н. Значение кальциевого обмена в патогенезе хронической тугоухости: автореф. дис.... канд. мед. наук. СПб, 2003. 24 с.
10. Рожинская Л. Я. Системный остеопороз. М.: Издатель Мокеев, 2000. 196 с.
11. Ханамирян Р. М. Патогенез и профилактика медикаментозного ототоксикоза: автореф. дис.... канд. мед. наук. СПб, 1985. 24 с.
12. Henry P. D. Atherogenesis calcium and Calcium antagonists // Am. J. Cardiol. - 1990. -№ 66. - P. 31-61.
13. Rafflenbeul W. Anti-atherosclerotic properties of nifedipine. Benefit of early intervention to prevent. Cardio Vascular complications // Cardiology. - 1997. -№ 88(suppl.). - P. 52-54.
Дубинская Наталья Викторовна - врач-оториноларинголог детского ЛОР отделения МЛПУЗ ГБ№1 им. Н. А. Семашко. 344000, г. Ростов-на-Дону, пр. Ворошиловский, 105. Моб. тел. +7-903-402-58-26, E-mail: [email protected]
УДК: 616. 28-089. 843
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕПАРАТА СТЕКЛОИОНОМЕРНОГО ЦЕМЕНТА НА КУЛЬТУРЕ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА С. А. Еремин
INVESTIGATION OF THE DRUG GLASS-IONOMER CEMENT ON THE CULTURES OF HUMAN DERMAL FIBROBLASTS S. A. Eremin
ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт уха, горла, носа и речи Минздравсоцразвития России»
(Директор - Засл. врач РФ, проф. Ю. К. Янов)
Институт экспериментальной медицины и биотехнологий ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава»
(Директор института - проф. Л. Т. Волова
ректор университета - лауреат Гос. премии РФ, дважды лауреат премии Правительства РФ, засл. деят. науки РФ, академик РАМН Г. П. Котельников)
Выполнена оценка биологической совместимости препарата стеклоиономерного цемента на культуре фибробластов человека in vitro. Изучено состояние клеток и их структур в течение первых суток после контакта препарата с клетками и по истечении 7 дней от начала эксперимента. В качестве группы сравнения (контрольная группа) выбрана культура дермальнъа фибробластов человека, помещённая в аналогичную среду, не содержащую стеклоиономерного цемента.
Выявлено, что препарат не оказывает значимого влияния на рост и качественный состав культуры клеток как непосредственно после нанесения, так и в ближайший период.
Ключевые слова: стеклоиономерный цемент, фибробласты, культура клеток, in vitro, отохирургия.
Библиография: 18 источников
The evaluation of biocompatibility of the drug glass-ionomer cement on the culture of human fibroblasts in vitro. The state of the cells and their structures during the first days after exposure to the drug with the cells and after 7 days from the start of the experiment. As a comparison group (control group) were selected culture of human dermal fibroblasts, placed in a similar medium containing no glass-ionomer cement.
Revealed that the drug has no significant effect on the growth and quality of cell cultures both immediately after deposition and in the near term.
Keywords: glass ionomer cement, fibroblasts, cell culture, in vitro, otosurgery.
Bibliography: 18 resources.
В настоящее время медицина располагает большим количеством синтетических материалов, используемых в различных её отраслях как для применения в виде протезирования отдельных структур (протезы сосудов, клапанов сердца, костей, суставов), так и для временного использования (рассасывающиеся биоклеи, противоспаечные гели и др.). Это разнообразие материалов создаёт проблему их рационального выбора, решая которую врач должен руководствоваться не только экономическими и физическими характеристиками препаратов, но и наиболее важным критерием - оценкой биологической совместимости в ближайшем и отдалённом периодах.
Интерес для отохирургов представляют препараты стеклоиономерного цемента. Они активно используются в стоматологической практике с начала 70-х годов прошлого столетия [16, 18], однако распространение в оториноларингологии получили значительно позже. Так, за рубежом применять их при операциях на ухе впервые стали в начале 90-х годов ХХ века [1], а распространения в России они не получили до сих пор. По применению стеклоио-номеров в стоматологической практике накоплено много лабораторных и клинических исследований [3, 5, 11, 12, 18], но они касаются преимущественно интеграции цементов в сплошном костном массиве. Число предлагаемых для отохирургии препаратов стеклоиономерного цемента значительно уступает широте выбора их же в стоматологии, а процесс приготовления препарата, готового к использованию в оториноларингологической практике, стандартизирован и автоматизирован. Это обуславливается значительной разницей в требованиях к биосовместимости препаратов в стоматологии и при операциях на ухе.
Важной особенностью применения в отохирургии является обязательный контакт стеклоиономерного цемента не только с костным массивом, но и с мягкими тканями [6, 8, 13]. Необходимость зачастую оставить препарат в «закрытой» полости среднего уха [4, 10], ограниченной в размерах, требует максимальной биосовместимости цемента с тканями организма во избежание фиброзирующих процессов [6], приводящих к дальнейшей потере слуха и усложняющих последующие хирургические вмешательства, если они окажутся необходимы.
Близость нахождения чувствительных структур (улитка, преддверие, полукружные каналы) и нервных волокон так же требует максимальной инертности препарата в окружающей среде, сведению реакций окружающих тканей к минимуму. Отмечены случаи, когда после хирургического вмешательства с применением стеклоиономерного цемента в послеоперационном периоде наблюдались негативные реакции со стороны нервных волокон [7] и мозговых оболочек [14, 15]. Предположительной причиной авторы считают токсическое воздействие препарата в момент его застывания и после, в течение некоторого времени. Однако, имеются наблюдения о том, что протезы, изготовленные из стеклоиономерного цемента, контактирующие с мягкими тканями спустя длительный срок после застывания не оказывают явного токсического влияния, в том числе могут использоваться для закрытия дефектов костей черепа [5]. Всё это требует от препарата стеклоиономерного цемента тщательности подбора ингредиентов, их соотношений и хорошей смешиваемости с минимальным количеством образующихся побочных продуктов и нежелательных (непредусмотренных) реакций.
Проведённые ранее опыты in vitro для изучения токсичности сертифицированных для отологической практики стеклоиономерных цементов использовали в качестве материала для наблюдения культуры клеток животных [2, 9]. Значительное внимание уделялось наиболее рациональному времени «выдержки» до контакта препарата с мягкими тканями непосредственно после его нанесения [15], (во время наибольшей токсичности) на костный массив. Опыты по исследованию реакций окружающих тканей на цемент в отдалённом периоде, проведённые на животных, показали хорошую «приживаемость» материала в большинстве случаев, однако оценка реакции окружающих тканей неоднозначна[14].
Представленные в литературе данные клинического применения стеклоиономерных цементов в отохирургии показали хорошие результаты при использовании материала в небольших количествах [1], тогда как облитерация им крупных полостей сопряжена с высоким риском экструзии в отдалённом периоде [13]. По данным некоторых авторов применение стеклоиономерного цемента позволяет добиться в некоторых случаях более высоких результатов восстановления слуха при реконструктивных операциях уха по сравнению с другими методами [17]. Поэтому актуальность их применения остаётся высокой. Но недостаток лабораторных исследований реакции тканей в раннем периоде, использование культур клеток животных, а не человека, оставляют «белые пятна» в проблеме биосовместимости препаратов стеклоиономерного цемента, используемых в отохирургии.
Цель исследования
Изучить биологическую совместимость препарата стеклоиономерного цемента, специально разработанного для применения в отохирургии, на культуре фибробластов человека in vitro.
Материалы и методы
В качестве стеклоиономерного цемента нами был выбран один из последних препаратов, разработанных специально для применения в отохирургии - Serenocem. Он представлен в виде капсулы с разделёнными полиэтиленовой мембраной ёмкостями, в которых находятся компоненты для смешивания - стеклоиономерный порошок и полиакриловая кислота. Капсула находится в стерильной упаковке. Стерилизация препарата проведена в заводских условиях гамма-лучами.
Для оценки биосовместимости препарата использована культура клеток дермальных фибробластов 4-7 пассажей. Первичную культуру дермальных фибробластов выращивали по стандартной методике первичных эксплантатов из кожи. Донор был соматически здоров, обследован на ВИЧ, RW, гепатит В, С. Результаты анализов отрицательные. Образцы хранились при температуре +4°С в среде МЕМ в лаборатории культивирования клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ. Клетки культивировали в стандартных условиях в СО2-инкубаторе при температуре 37°С при постоянной влажности и 5% СО1 в среде МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
Ход эксперимента
Экспериментальное исследование биосовместимости стеклоиономерного цемента на культуре дермальных фибробластов человека проведено в лаборатории культуры клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ. В стерильных условиях произведено вскрытие двойной стерильной упаковки капсулы препарата SerenoCem. Согласно инструкции компоненты препарата объединены. Капсула с препаратом помещена в специальный миксер для приготовления стеклоиономерного цемента. Перемешивание препарата согласно заданной программе в течение 10 секунд. Затем капсула подготовлена к использованию (удалены блокирующие элементы) и помещена в специализированный аппликатор. Аппликатором подготовленный стеклоиономерный цемент нанесён на стерильное предметное стекло равными частями размерами 1х0,3х0,3см. Нанесённый препарат выдержан на воздухе в стерильной колбе 5 минут до полного отвердевания, затем помещён в стерильную ёмкость (чашка Петри).
Исследование биосовместимости осуществляли методом прямого контакта препарата с культурой дермальных фибробластов человека в культуральных чашках Петри диаметром 3,5см в оптимальных условиях культивирования клеток. Все работы с культурой проводили в ламинарном боксе БАВп-01 «Ламинар-С». Клетки снимали со дна культурального флакона стандартным способом и переносили в культуральные чашки с образцами стеклоиономерного цемента. Контрольной группой служили чашки Петри с культурой соответствующих клеток без образцов стеклоиономерного цемента, которые пассировали и наблюдали одновременно с экспериментальными. При посеве доза во всех случаях составляла 20 тысяч клеток/см1 (2 x104). Нативные культуры изучали, фотографировали и морфометрировали с помощью инвертированного микроскопа при увеличении 63 и 100.
При изучении реакции клеток на препарат по истечении первых суток после помещения исследуемого материала в культуральную среду выполнено сравнение с контрольной
группой клеток. Адгезия клеток к поверхности культуральной чашки и стеклоиономерному цементу хорошая. Дермальные фибробласты исследуемой группы имели вытянутую форму, 2-4 отростка, гомогенную цитоплазму. Границы клеток четкие, ядра овальной формы с гладкой оболочкой, часто расположены несколько эксцентрично, содержат 1-2 ядрышка, хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно (рис. 1). Отростки клеток имеют гладкие ровные контуры, значительную длину и анастомозируют с отростками соседних клеток. В фиб-робластах при окраске «гематоксилин + судан IV» нейтральный жир не обнаруживается, что соответствует норме. Аналогичная картина наблюдалась и в среде контрольной группы.
Рис. 1. Первые сутки эксперимента, фибробласты в непосредственной близости от помещенного образца.
Нативная культура. Увеличение 100.
Отличительной особенностью основной группы стало появление в растворе дополнительных включений, располагающихся равномерно по поверхности клеточного слоя и образующих поверхностную плёнку в непосредственной близости от препарата, затрудняющую визуализацию клеточных структур. Какого-либо видимого воздействия на фибробласты включения не оказывали (рис. 1).
На седьмые сутки эксперимента при осмотре основной группы дермальные фибробласты вытянутой формы с 2-4 отростками. Границы клеток четкие, ядра овальной формы с гладкой оболочкой, расположение ядер в клетках различно, преобладает незначительно эксцентрическое расположение, содержащих 1-2 ядрышка, хроматин расположен диффузно. Клетки имеют гладкие ровные контуры, отростки значительной длины, хорошо анастамози-рующие между собой, формируют сеточку из тонких волокон, что свидетельствует о формировании фибробластами внеклеточного матрикса. Различий между клетками в непосредственной близости от исследуемого материала и по периферии на максимальном удалении нет (рис. 2).
Рис. 2. Седьмые сутки эксперимента, фибробласты в непосредственной близости от помещенного образца. Нативная культура. Увеличение 100.
При окраске «гематоксилин + судан IV» на 7 сутки ядра различного размера, в цитоплазме имеются капли нейтрального жира. Цитоплазма клеток оксифильна, вакуолизирована (рис. 3). В контрольной группе жировых включений в клетках нет (рис. 4). Появление капель жира в цитоплазме говорит о незначительном цитотоксическом действии исследуемого материала.
Рис. 3. Седьмые сутки эксперимента. Основная группа. Капли нейтрального жира в вакуолизированной цитоплазме. Увеличение 400.
Рис. 4. Седьмые сутки эксперимента. Контрольная группа. Нативная культура фибробластов человека, 4 пассаж, монослой. Увеличение 400.
Соотношение клеток и клеточных структур, характер роста и жизнеспособность, а так же их организация в исследуемой группе соответствуют таким же параметрам клеток в контрольной группе (рис. 5).
Рис. 5. Седьмые сутки эксперимента. Контрольная группа. Нативная культура фибробластов человека, 4 пассаж, монослой. Увеличение 100.
Замеченные ранее включения, расположенные равномерно по поверхности препарата,
организуются в конгломераты (рис. 2). Не замечено видимых влияний включений на состояние культуры в целом, либо клеток фибробластов в отдельности.
Выводы:
В исследовании in vitro стеклоиономерный цемент SerenoCem не оказывает существенного неблагоприятного влияния на рост и качественный состав культуры дермальных фибробластов человека в течение первых суток и в ближайший период, до 7 суток после нанесения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Babighian G., Use of a Glass Ionomer Cement in Otological Surgery. A preliminary report // Journal of Laryngology and Otology, (1992) 106: 954-959.
2. Biocompatibility of glass ionomer cements / P Sasanaluckit [et al.] // Biomaterials 1993, 14(12): 906-916.
3. Brook I., Craig G., Lamb D., In vitro interaction between primary bone organ cultures, glass-ionomer cements and
hydroxyapatite, tricalcium phosphate ceramics // Biomaterials 1991, 12(2): 179-186.
4. Clark M. P, Bottrill I., SerenoCem -glass ionomeric granules: a 3-year follow-up assessment of their effectiveness in mastoid obliteration // Clinical Otolaryngology 2007, 32(4): 287-90.
5. Cole I., Dan N., Anker A., Bone replacement in head and neck surgery: a biocompatible alternative // Australian and New Zealand Journal of Surgery. 1996, 66(7): 469-472.
6. Geyer G., Helms J., Reconstructive measures in the middle ear and mastoid using a biocompatible cement. Preliminary clinical experience // Clinical Implant Materials: advances in Biomaterials 1990, 9, 529-535.
7. Granstrn;m G., Holmquist J., Tjellstrn;m A., Facial nerve paralysis following repair of the external ear canal with ionomeric cement // Ear Nose and Throat Journal 2000, 79(7), 495-498.
8. ^usler R., Cochlear implantation without mastoidectomy: the pericanal electrode insertion technique // Acta Otolaryngology 2002, 122(7): 715-9.
9. In vitro Characteristics of a Glass Ionomer Cement / C. L. Driscoll [et al.] // Skull Base Surgery, 1998, 8(4): 175-80.
10. Incudostapedial rebridging ossiculoplasty with bone cement / T. Baglam [et al.] // Otolaryngology - Head and Neck Surgery 2009, 141(2): 243-246.
11. Jonck L. M., Grobbelaar C. J., Ionos bone cement (glass ionomer): an experimental and clinical evaluation in joint replacement // Clinical Materials 1990, 6: 323-359.
12. Jonck L. M., Grobbelaar C. J., Strating H., The biocompatibility of glass ionomer cement in joint replacement: bulk testing // Clinical Materials 1989, 4: 85-107.
13. Kupperman D., Rinze A., Tange R. A., Ionomeric Cement in the Human Middle Ear Cavity: Long-Term Results of 23 Cases // The Laryngoscope 2001, Volume 111, Issue 2, pages 306-309.
14. Kupperman D., Tange R. A., Long-term results of glass ionomer cement, Ionocem, in the middle ear of the rat // Acta Otorhinolaryngol Belg. 1997, 51(1): 27-30.
15. Lbbben B, Geyer G. Toxicity of glass ionomer cemen. Laryngorhinootologie. 2001, 80(4): 214-22.
16. Ramsden R., Herdman R., Lye R., lonomeric bone cement in neuro-otological surgery // The Journal of Laryngology & Otology 1992, 106: 949-953.
17. Type 2 ossiculoplasty: prognostic determination of hearing results by middle ear risk index / S. A. Felek [et al.] // American Journal of Otolaryngology 2010 Sep-Oct;31(5): 325-31. Epub 2009 Jun 10.
18. Wilson A., Kent B., The glass-ionomer cement, a new translucent dental filling material // Journal of Applied Chemistry and Biotechnology 1972, 21: 313.
Ерёмин Сергей Алексеевич - очный аспирант Санкт-Петербургского НИИ ЛОР. 190113 Санкт-Петербург,
ул. Бронницкая, д. 9. Тел.: 8-812-316-25-01, e-mail: [email protected]
