CC BY
15УДК 615.917'558.1.07
Ф.А.Цимбал, М.В.Цимбал, С.Н.Субботина, Н.В.Гончаров, Л.М.Глашкина
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОРОГА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕТОДА ПУПИЛЛОМЕТРИИ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ
СОЕДИНЕНИЯМИ
ФГУП«Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» Федерального медико-биологического агентства, С.-Петербург, Россия
В опытах на лабораторных животных при различных способах введения ФОС исследована диагностическая и прогностическая значимость метода пупиллометрии. При инсталляции различных ФОС в конъюнктивальный мешок кроликов показана высокая степень чувствительности метода. Активность холинэстеразы при попадании в организм равного количества токсиканта не изменяется.
Ключевые слова: фосфорорганические отравляющие вещества, диизопропилфторфосфат, нейротоксиканты, фос-факол, армин, пупиллометр, пупиллограмма, пупиллометрический комплекс, миоз.
Введение. Фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ) являются представителями большой группы фосфорорганических соединений (ФОС), которые получили широкое применение в различных областях народного хозяйства.
Известно, что к группе отравляющих веществ нервно-паралитического действия относятся высокотоксичные органические соединения из класса эфиров кислот фосфора. Основные представители ФОВ — зарин, зоман, V-газы, входящие в арсенал химического оружия как за рубежом, так и в Российской армии, подлежат уничтожению.
Зрачок является наиболее удобным и доступным индикатором для исследований функционального состояния центральной и периферической нервной систем, включая функцию вегетативной нервной системы, т. к. в иннервации регулирующего мышечного аппарата зрачка принимает участие оба ее отдела, симпатический и парасимпатический. Воздействие токсических веществ на кору, гипоталамус, ствол мозга, периферические, симпатические и парасимпатические волокна приводит к появлению самых различных нарушений в состоянии зрачков [3, 4].
Метод пупиллометрии (ППМ) позволяет по реакции зрачков на световой стимул оценить реактивность и состояние цереброспинальных вегетативных центров, отражающих состояние нервной системы и некоторых внутренних органов при воздействии на организм ряда высокотоксичных веществ.
Принцип метода пупиллометрии состоит в регистрации зрачковой реакции, проявляющейся в виде кратковременного сужения зрачка и возврата его к исходному состоянию при воздействии световой вспышки, а также анали-
зе пупиллографической кривой (пупиллограм-мы), которая отражает зависимость изменения диаметра зрачка от времени, в течение которого производится регистрация (как правило, 3 секунды).
Оценка параметров зрачковой реакции, обладающих достаточным постоянством в норме, становится весьма актуальной при воздействии на организм токсических веществ, особенно обладающих нейротоксическим действием. При воздействии нейротоксикантов происходит смещение баланса процессов торможения и возбуждения как внутри системы-«мишени» (холинэр-гической — в случае воздействия ФОС), так и в других тесно взаимодействующих с ней нейро-медиаторных системах мозга, что в первую очередь будет сказываться на состоянии зрачка [5]. Известно, что при ингаляционном поражении у людей через несколько минут после пребывания в атмосфере, содержащей даже ничтожные концентрации паров ФОВ, развивается один из наиболее типичных и специфических мускари-ноподобных симптомов отравления этими ядами — миоз (сужение зрачка), причем миоз может быть неодинаковым (анизокория) и зависеть от количества яда, попавшего в организм. Такого же рода изменения характерны и при воздействии ФОС на организм человека [2, 5].
Таким образом, зрачок является одним из первых чувствительных индикаторов нарушения функционального состояния ЦНС и ВНС, вызванного нейротоксикантами.
Однако вопрос о чувствительности метода пупиллометрии представляется недостаточно изученным.
Целью работы является определение порога чувствительности метода пупиллометрии в токсикологическом эксперименте для оценки степени интоксикации по изменению параметров
зрачковой реакции при различных путях поступления токсиканта.
Материалы и методы исследования. В качестве объекта исследования были выбраны кролики самцы породы Шиншилла в возрасте от 4-х месяцев до 1,5 лет массой от 2,5 до 4,5 кг.
Использование кроликов в токсикологическом эксперименте для исследования функции зрачка обусловлено тем, что глаз кролика по строению, размерам и форме наиболее похож на глаз человека [6]. Имеющиеся различия в характере зрачковой реакции (слабая реакция на импульсную засветку) были нивелированы с помощью специально разработанной методики подачи светового стимула.
В качестве необратимых ингибиторов холин-эстеразы использовали фосфакол, ДФФ и армин. Маточные раствор токсикантов в разведении 1:100 приготавливали на диметилсульфоксиде (ДМСО). Затем из маточных растворов в две стадии готовили рабочие растворы в разведениях от 1:10000 до 1:1000000. При приготовлении рабочих растворов из маточного раствора для инстилля-ции в конъюнктивальный мешок в качестве растворителя использовали дистиллированную воду. Инстилляции производили с помощью микропипетки в объеме двух капель по 30 мкл. В табл. 1 приведено расчетное количество токсикантов, содержащихся в указанном объеме.
Для регистрации зрачковых реакций лабораторных животных, в частности кроликов, в эксперименте использовали автоматизированный монокулярный пупиллометрический комплекс для лабораторных животных (АБПМК-Ж), разработанный в НИИ ГПЭЧ для проведения исследований по зрачковой реакции на световой стимул воздействия различных ксенобиотиков (в том числе БОВ). Регистрацию пупиллограмм проводили в соответствии с руководством по эксплуатации АБПМК-Ж. Кролики были предварительно приучены к фиксации в ложемен-
те (станке, куда они помещались во время исследования) и находились в спокойном состоянии. Для статистической обработки данных использовали пакет программ 8ТАТ18Т1СА 6.0. Были задействованы блоки «Описательная статистика», «Корреляционный анализ», «Регрессионный анализ», а также графические средства указанного пакета. Первичная информация (пупиллограммы) обрабатывали пакетом программ, разработанным и апробированным в НИИ ГПЭЧ.
Выявление воздействия, ввиду вариации только одного фактора — количества токсиканта, производили по следующему критерию: если при проведении токсикологического эксперимента наблюдалось достоверное изменение хотя бы одного из параметров пупиллометрии (то есть отклонение от групповых или индивидуальных норм более чем на 2а), то это трактовалось как проявление воздействия токсиканта на зрачковую реакцию.
Для сопоставления чувствительности методов оценки степени интоксикации ФОС параллельно использовали метод Эллмана, позволяющий определить активность холинэстеразы в сыворотке и эритроцитах.
Результаты и обсуждение. Поскольку в доступной литературе отсутствует информация относительно норм параметров зрачковой реакции для кроликов, то на этапе подготовки к токсикологическому эксперименту были определены указанные нормы. Объем выборки, на которой нарабатывали исходные данные для определения норм, составлял 96 кроликов разных половозрастных групп.
Нормы параметров зрачковой реакции для кроликов породы Шиншилла представлены в табл. 2, из которой видно, что вертикальный диаметр зрачка кролика в норме в возрасте от 4 до 6 месяцев соответствует 6,36 мм, а в возрасте с 7 до 24 месяцев — 7,03 мм. Значимых отличий
Таблица 1
Расчетное количество токсикантов, содержащихся в 60 мкл рабочих растворов
при различных разведениях
Разведение 1:10000 1:33000 1:100000 1:330000 1:500000 1:1000000
Масса вещества, мг 610-3 1,810-3 6-10-4 1,810-4 1,2-10-4 6-10-5
Масса ДФФ, моль 3,310-8 9,8 10-9 3,3-10-9 9,8-10-10 6,5-10-10 3,3-10-10
Масса фосфакола, моль 2,1-10-8 6,410-9 2,1-10-9 6,4-10-10 4,2-10-10 2,1-10-10
Таблица 2
Нормы показателей пупиллометрии у кроликов породы Шиншилла
Возраст, мес. Масса тела, г Параметр пупиллометрии
Дн, мм Дк, мм Vc, мм/ с Vp, мм/с Ac, мм Tc, с Tp, с Тл, с
4-6 3300+100 6,36+0,13 5,98+0,12 0,89+0,13 0,13+0,05 0,61+0,09 0,68+0,02 1,81+0,02 0,51+0,01
7-24 4600+100 7,03+0,05 6,66+0,05 0,99+0,06 0,17+0,01 0,63+0,04 0,64+0,01 1,84+0,01 0,50+0,01
параметров зрачковой реакции в зависимости от указанного возраста не наблюдается.
Различий пупиллометрических показателей в зависимости от пола у кроликов не обнаружено.
В эксперименте были исследовано влияние токсикантов на зрачковую реакцию при введение растворов токсикантов подкожно (в области холки), внутривенно (в краевую вену уха) и при инстилляции в конъюнктиву.
При введении кроликам ДФФ подкожно в дозах 0,1 и 0,25 мг/кг эффекта миоза и клинической картины отравления не наблюдалось. Отмечалось снижение активности холинэстеразы плазмы крови на 25—30%, в эритроцитах на 15% через 45 мин после воздействия. При подкожном введении ДФФ в дозе 0,5 мг/кг отмечались незначительные изменения в сторону увеличения диаметра зрачка через 30 мин. Клиническая картина интоксикации характеризовалась умеренными непродолжительными фибрилляциями мышц спины. Активность холинэстера-зы плазмы крови понижалась на 57%, в эритроцитах — на 70% через 45 мин после воздействия.
При внутривенном введении в дозе 0,08 мг/кг сужение зрачка было незначительным и составляло 19% от начального диаметра. Активность холинэстеразы плазмы крови практически не изменялась.
Наиболее значимые результаты по изменению зрачковой реакции кроликов на световой стимул были получены при инстилляции в конъюнктивальный мешок фосфакола в различных разведениях.
При разведении фосфакола 1:10000, т. е. при поступлении вещества в количестве 6-10-3 мг миоз развивался через 7—8 мин, зрачок достигал точечного размера или смыкался в щель. Полное восстановление наступало лишь через 3-е суток.
При инстилляции раствора 1:33000 зрачок уменьшался на 50% в среднем через 24 мин по-
Рис. Динамика изменения диаметра зрачка во времени при инстилляции фосфакола в конъюнктивальный мешок в различных разведениях (масса вещества, мг)
сле воздействия и полностью восстанавливался через сутки. При инстилляции раствора в разведении 1:100000 отмечалось уменьшение зрачка на 16% через 30 мин с полным восстановлением через сутки. В разведениях в 1:330000 и 1:500000 достоверных изменений не наблюдалось.
Таким образом, фосфакол при подкожном и внутривенном введениях в указанных дозах не вызывает достоверного уменьшения диаметра зрачка, в то время как при местном воздействии в разведениях 1:33000 и 1:100000 фиксируется миоз. Следует отметить, что развитие миотиче-ского эффекта носило немонотонный характер, т. е. имело место уменьшение диаметра зрачка с последующим его увеличением и дальнейшим сужением до минимального размера. Диаметр зрачка не восстанавливался после засветки. Активность холинэстеразы при инстилляции фос-факола в конъюнктиву не изменялась.
На рис. представлена динамика изменения диаметра зрачка во времени при инстилляции фосфакола в конъюнктивальный мешок в различных разведениях (масса вещества, мг). Заштрихованной областью обозначены границы изменения диаметра зрачка в пределах допустимой нормы. Эта область представляет диапазон вариации начального диаметра зрачка, в пределах которого изменения указанного параметра следует считать фоном. «Выход» размера диаметра зрачка за пределы заштрихованной области является достоверным отклонением (p < 0,05). Из рисунка видно, что изменения начального диаметра зрачка при воздействии фосфако-ла в количестве 1,8-10-4 мг происходят в пределах нормы (кривая 2). Однако динамика изменения диаметра зрачка во времени показывает, что такое количество вещества является порогом, за пределами которого изменение параметра пу-пиллометрии становится достоверным.
Аналогичные результаты были получены при исследовании воздействия других фосфороорга-нических соединений, таких как ДФФ и армин.
Заключение. Таким образом, порогом чувствительности метода при попадании ФОВ на слизистую глаз (например, из атмосферного воздуха) следует считать количество токсиканта на уровне 10-9 М. Отметим, что активность холин-эстеразы при попадании в организм такого количества токсиканта не изменяется.
Метод пупиллометрии целесообразно применять в качестве наиболее тонкого и чувствительного индикатора начальных признаков интоксикации ФОС. Характерно, что при больших дозах ценность пупиллометрии как диагностического инструмента уменьшается. Так, например, при подкожном введении в дозах, близких к DL50, вместо миоза наблюдается мидриаз. Но при та-
ких дозах применение чувствительного метода диагностики и не требуется, так как имеет место отчетливая клиническая картина интоксикации ФОС.
Поскольку пупиллометрия является неин-вазивным методом, обладает высокой пропускной способностью, то применение пупиллометрии для проведение экспресс-диагностики интоксикации ФОВ, а также для проведения до- и послесменных обследований персонала, контактирующего с ФОВ, является весьма перспективным.
Список литературы
1. Вельховер Е.С., Ананин В.Ф. Пупиллодиагно-стика. - М.: Изд-во УДА, 1991. - 212 с.
2. Сборник инструктивно-методических документов по проблеме уничтожения химического
оружия. Ч II. Фосфорорганические отравляющие вещества. — М.: ФУ «Медбиоэкстрем» МЗ РФ, 2001. — С. 96-103.
3. Голиков С.Н. Руководство по токсикологии отравляющих веществ. — М.: Медицина, 1978. — 125 с.
4. Куценко С.А. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита. — СПб.: Фолиант, 2004. — 527с.
5. Зеленевский Н.В. Кролик. — СПб.: Агропро-миздат, 2002. — 448 с.
6. Ellman G.L., Courtney D.K., Andres V.Jr. at al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol., 1961. — V. 7. — P. 88-95.
Материал поступил в редакцию 03.07.06.
F.A.Tsimbal, M.V.Tsimbal, S.N.Subbotina, N.V.Goncharov, L.M.Glashkina
INVESTIGATION OF THE SENSITIVITY THRESHOLD OF THE PUPILLOMETRY METHOD AT POISONING BY ORGANOPHOSPHORUOS COMPOUNDS
Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, Federal Medical and biological Agency,
St.Petersburg
Diagnostic and prognostic significance of the pupillometry method was investigated in experiments on experimental animals using different ways of intake of organophosphorous compounds. A high sensitivity of the method was shown at the instillation of different kinds of organophosphorous compounds in the conjunctival sac of rabbits, but the activity of holinesterase did not al;ter when the same amount of toxicant was taken up by the organism.
УДК [615.282:546.212]:[543.544.3:542.61]
Н.Л.Корягина, Е.И.Савельева, Н.В.Гончаров, Н.С.Хлебникова, А.С.Радилов
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ИОНИЗАЦИОННО-ПЛАМЕННЫМ И МАСС-СЕЛЕКТИВНЫМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФТОРАЦЕТАТА НАТРИЯ В ВОДЕ И БИОМЕДИЦИНСКИХ ПРОБАХ
НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека, пос. Кузьмоловский, Ленинградская обл.
Предложен новый метод анализа высокотоксичного соединения — фторацетата натрия, методами газовой хроматографии с ионизационно-пламенным и масс-селективным детектированием в биологических пробах и воде. Метод основан на упаривании пробы досуха, этилировании сухого остатка этиловым спиртом в присутствии серной кислоты. Селективное определение фторацетата натрия в воде возможно с чувствительностью 0,001 мкг/мл, предел обнаружения в плазме крови и гомогенатах тканей, соответственно 0,01 мкг/мл и 0,01 мкг/г
Ключевые слова: фторацетат натрия, парофазный анализ, твердофазная микроэкстракция, газовая хроматография, биомедицинские пробы.
Введение. Во многих странах в целях регуляции численности популяций некоторых грызунов и хищных птиц используется фторацетат натрия. Фторацетат натрия (ФАН), также дру-
гие соли фторуксусной кислоты (ФК), хорошо растворимы в воде, не имеют вкуса и запаха, являются сильнодействующими метаболическими ядами, вызывающими гибель животных в ре-
