Исследование полисахаридов травы стальника полевого Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.32:547.458

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ТРАВЫ СТАЛЬНИКА ПОЛЕВОГО

© 2007 г. Н.А. Давитавян, А.М. Сампиев

The purpose of work was allocation and research polysaccharide from a herb Ononis arvensis L. It is established, that the contents water-soluble polysaccharide makes 6,6 % in which the quantity of restoring sugars occupies 19,38 %; the contents of pecti-naceous substances reaches 8,6 % from shares of restoring sugars of 29,76 %; the contents gemycellulosa A and В makes 2,1 % and 4,1 % accordingly, presence of restoring sugars in them is within the limits of 19,97 % and 28,71 %. The structure polysaccharide a complex is submitted by glucose, galactose, rhamnose, arabinose, xylose, galactuonic and glucuronic acids.

Многовековый опыт народной медицины служит источником открытия новых перспективных лекарственных средств. Таким источником, взятым из народной медицины, явился стальник полевой. В качестве лекарственного средства используют корень этого растения, фармакологическое действие которого обеспечивают изофлавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины и тритерпеновый спирт оноцерин [1]. Есть основания считать, что не только корень, но и трава стальника могла бы использоваться в медицинской практике. Способствовать практическому внедрению травы стальника в официальную медицину, наряду с фармакологическими исследованиями, будет изучение всего разнообразия содержащихся в ней природных соединений. Трава стальника полевого, помимо комплекса фенольных веществ, содержит и полисахариды, которые являются, с точки зрения фитохимического исследования, недостаточно изученной группой [2]. Поэтому целесообразно изучить данную группу соединений в отношении водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, гемицел-люлозы А и гемицеллюлозы В.

Цель настоящей работы - выделение и исследование полисахаридного комплекса из травы стальника полевого.

Объект исследования - высушенная и измельченная трава стальника полевого (Ononis arvensis L.), заготовленная в Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской области.

Методы исследования. Сумму водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюло-зу А и В из травы стальника выделяли по приведенной схеме.

Измельченное сырье исчерпывающе экстрагировали сначала хлороформом для обезжиривания, а затем 70%-м спиртом этиловым с целью удаления пигментных, фенольных и легкоокисляющихся веществ. Шрот высушивали до удаления запаха растворителей и подвергали трехкратной экстракции водой при температуре 90-95 °С в течение 1 ч при постоянном перемешивании (соотношение сырья и экстрагента при первой и второй экстракции 1:20, при третьей - 1:10). Объединенное и отфильтрованное извлечение упаривали под

вакуумом с помощью роторного испарителя до 1/5 первоначального объема при температуре 45-50 °С.

Сумму водорастворимых полисахаридов получали осаждением путем добавления четырехкратного по отношению к объему упаренного извлечения 96%-го спирта этилового; осадок отфильтровывали, многократно промывали спиртом этиловым, затем высушивали при комнатной температуре и взвешивали. Полученная сумма полисахаридов представляла собой порошок светло-коричневого цвета.

Сумму пектиновых веществ выделяли следующим образом: шрот сырья после выделения водорастворимых полисахаридов трехкратно экстрагировали смесью 0,5 % растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония (1:1) при температуре 90 °С в течение 3 ч (соотношение шрота и экстрагента при первом контакте 1:20, при втором и третьем - 1:10). Полученное извлечение концентрировали до 1/5 первоначального объема при температуре 45-50 °С с помощью роторного испарителя; к сгущенному извлечению прибавляли трехкратное количество 96%-го этилового спирта, осадок отделяли фильтрованием, промывали спиртом этиловым, высушивали при комнатной температуре и взвешивали. Сумма пектиновых веществ после измельчения представляла собой порошок бежевого цвета.

Далее проводили выделение гемицеллюлозы А и В. Остаток сырья после выделения пектиновых веществ экстрагировали пятикратным объемом 10%-го раствора натрия гидроксида при температуре 20 0С, перемешивая на магнитной мешалке в течение 12 ч, добавляли к щелочному фильтрату двукратный объем (по отношению к сырью) ледяной уксусной кислоты для осаждения гемицеллюлозы А. В фильтрате (после отделения гемицеллюлозы А) двукратным объемом 96%-го спирта этилового осаждали гемицеллюлозу В. Раствор декантировали, осадок несколько раз промывали порциями 96%-го спирта этилового, высушивали в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы и взвешивали. Гемицеллюлозы А и В из травы стальника после измельчения представляли собой порошки темно-коричневого цвета.

Для определения мономерного состава полисаха-ридных комплексов проводили их гидролиз серной кислотой [3, 4].

Навески полисахаридных комплексов (0,05 г) помещали в ампулы емкостью 5-10 мл, прибавляли 2,5 мл раствора серной кислоты (1 моль/л), запаивали ампулы и проводили гидролиз при температуре 100-105 оС в течение 6 ч для водорастворимых полисахаридов, 24 ч - для пектиновых веществ, 48 ч -для гемицеллюлозы А и В. Содержимое ампул переносили в стаканчики, промывали ампулы 5 мл воды, нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной реакции. Растворы фильтровали, фильтры промывали водой до объема фильтратов 10 мл. К полученным растворам прибавляли 3 объема 96%-го этилового спирта, тщательно перемешивали и образовавшиеся осадки отфильтровывали через 1-2 ч. Фильтраты упаривали на кипящей водяной бане до получения объема около 0,5 мл (раствор А). Осадки бариевых солей уроновых кислот снимали с фильтров, растворяли в 2,5 мл воды, прибавляли катионит КУ-2 (Н+) до рН 3-4 по универсальному индикатору. Растворы фильтровали, упаривали до получения около 0,5 мл раствора (раствор Б).

Растворы А, содержащие нейтральные моносахариды, хроматографировали нисходящим способом в системе: н.бутанол-пиридин-вода (6:4:3) в течение 17-18 ч с образцами нейтральных моносахаридов, а растворы Б, содержащие кислые моносахариды, -восходящим способом в системе: этилацетат -уксусная кислота - муравьиная кислота - вода (18:3:1:4) в течение 5-6 ч с образцами гексауроно-вых кислот на бумаге ЕЫ-1. Хроматограммы высушивали на воздухе 1 ч, обрабатывали раствором анилингидрофталата и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105 оС. Через 10-15 мин наблюдали наличие красноватых и красновато-коричневых пятен. По величине и интенсивности окраски проводили сравнительную оценку содержания моносахаров в исследуемых фракциях.

Для количественного определения восстанавливающих сахаров в составе полисахаридных фракций был использован метод, основанный на их реакции с пикриновой кислотой в щелочной среде [5, 6].

0,05 г (точная навеска) полисахаридного комплекса помещали в ампулу, прибавляли 2,5 мл разведенной соляной кислоты, ампулу запаивали и нагревали при температуре 100±5 °С в течение 2 ч, по окончании гидролиза содержимое ампулы переносили в стакан и нейтрализовали по бумаге Конго: сначала 30%-м раствором гидроксида натрия, затем раствором разведенной соляной кислоты, и наконец 10%-м раствором гидроксида натрия.

Раствор фильтровали через плотный фильтр, переносили количественно в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили объем раствора водой до метки (раствор А). В колбу вместимостью 50 мл помещали 1,0 мл 1%-го раствора пикриновой кислоты, 3,0 мл 20%-го раствора карбоната натрия и 1 мл раствора А (рисунок).

Колбу с содержимым погружали в кипящую водяную баню на 10 мин, затем охлаждали до комнатной температуры. Содержимое количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили водой до метки. Измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 460 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали смесь, состоящую из 1,0 мл 1%-го раствора пикриновой кислоты, 3,0 мл 20%-го раствора карбоната натрия и

1.0 мл воды, которую нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 мин и доводили объем раствора водой до 25 мл. Параллельно проводили определение оптической плотности 1 мл раствора стандартного образца глюкозы.

Содержание восстанавливающих сахаров в поли-сахаридном комплексе, % в пересчете на глюкозу, вычисляли по формуле

Б1 • 0,0056 -10 -100

Х _-

А • т -1 '

где Б - оптическая плотность испытуемого раствора; Б0 - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы; 0,0056 - концентрация глюкозы в 1 мл раствора стандартного образца, г; т - навеска полисахарида, г.

Расчет содержания полисахаридных фракций проводили из шести определений в пересчете на абсолютно сухое сырье.

Результаты исследования и их обсуждение. Результаты исследований отдельных полисахаридных фракций приведены в таблице.

Как видно из данных таблицы, содержание водорастворимого полисахаридного комплекса составляет 6,6 %. Количество восстанавливающих сахаров занимает 19,38 %; содержание пектиновых веществ достигает 8,6 % с долей восстанавливающих сахаров 29,76 %; содержание гемицеллюлоз А и В составляет

2.1 и 4,1 % соответственно, наличие же восстанавливающих сахаров в них находится в пределах 19,97 и 28,71 %.

Вывод. Из травы стальника полевого выделены и изучены водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества, гемицеллюлоза А и В. Установлено, что их состав представлен глюкозой, галактозой, рамнозой, арабинозой, ксилозой, глюкуроновой и галактуроновой кислотами. Основными по содержанию нейтральными сахарами в составе водорастворимых полисахаридов были галактоза и арабиноза, в составе пектиновых веществ - галактоза, в составе гемицеллюлозы А и В - ксилоза. Преобладающими по содержанию кислыми сахарами являлась галакту-роновая кислота в составе пектиновых веществ.

Полученные данные фитохимического анализа травы стальника полевого в отношении полисахаридов в совокупности с уже установленным ранее составом других биологически активных веществ, данными фармакологических исследований и опыта народной медицины позволяет отнести ее к перспективному источнику новых лекарственных средств растительного происхождения.

С

Воздушно-сухое сырье

Хлороформное извлечение

Спиртовое извлечение

Сумма водорастворимых полисахаридов

Шрот

Шрот

1 г

Осадок

г

Промывка 96%-м этанолом, сушка

1 г

Прибавление ледяной уксусной кислоты

Осаждение 96%-м этанолом, промывка осадка 96%-м этанолом, сушка

:ц~-

( Гемицеллю-лоза В

f Сумма пектиновых ве-V ществ

Шрот

Объединенное извлечение

Фильтрат

Исчерпывающая экстракция хлороформом, сушка

Исчерпывающая экстракция 70%-м спиртом этиловым, сушка

Экстракция горячей водой

Шрот Экстракция смесью щавелевой кислоты и оксала-та аммония

1

г

Промывка 96%-м этанолом, сушка

1

г

Экстракция 10%-м раствором натрия гидроксида

Фильтрова- ^ ние J

Осадок, промывка 96%-м этанолом, сушка

Е

Гемицеллю-лоза А )

Схема выделения фракций полисахаридов из травы стальника

Количественное содержание и мономерный состав отдельных полисахаридных фракций травы стальника полевого

Показатель Водорастворимые полисахариды Пектины Гемицеллюлоза А Гемицеллюлоза В

Количественное

содержание фракции в сырье, % 6,6 8,6 2,1 4,1

Мономерный Глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза, рамноза, глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота Глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза, Арабиноза, ксилоза, Глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза,

состав рамноза, глюкуроновая галактуроновая галактуроновая

кислота кислота кислота

Количественное

содержание восстанавливающих 19,38 29,76 19,97 28,71

сахаров,%

Литература

1. Давитавян Н.А., Сампиев А.М. // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы 8 Междунар. съезда. 21-23 июня 2004 г., Миккели, Финляндия. СПб., 2004. С. 424-426.

2. Тулайкин А.И., Березина В.С., Гончаров М.Ю. // Растит. ресурсы. 2004. № 4. С. 73-79.

3. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (моносахариды). М., 1977.

4. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (Полисахариды). М., 1978.

5. Бубенчикова В.Н., Кондратова Ю.А, Гончаров Н.Ф. // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы 7 Междунар. съезда. 3-5 июля 2003 г., Санкт-Петербург-Пушкин. СПб., 2003. С. 515-517.

6. Сампиев А.М., Никифорова Е.Б. // Кубанский науч. мед. вестн. 2006. № 1-2. С. 96-99.

Кубанский государственный медицинский университет, г. Краснодар_24 ноября 2006 г.