CC BY
45
10. Barrett, Marilyn L. Proprietary alpha-amylase inhibitor from white bean (Phaseolus vulgaris): A review of clinical studies on weight loss and glycemic control/ Marilyn L. Barrett, Jay K. Udani//Noutrition Journal. - 2011. - P. 10-24.
11. Screening for antidiabetic activity and phytochemical constituents of common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds./A.L. Ocho - Anin Atchibri [et al.] // Journal of Medicinal Plants Research. - 2010. - Vol. 4(17). - P. 1757-1761.
12. Wu G. Amino acids: metabolism, functions and nutrition / G. Wu //Amino acids. - 2009. - T. 37. - №. 1. - C. 1-17.
УДК 615.322:582.998.16
© В.Н. Бубенчикова, И.В. Степнова, Е.А. Воробьева, 2016
В.Н. Бубенчикова, И.В. Степнова, Е.А. Воробьева ИЗУЧЕНИЕ ВЕЩЕСТВ ПЕРВИЧНОГО БИОСИНТЕЗА ТРАВЫ ГОРЛЮХИ ЯСТРЕБИНКОВОЙ (PICRIS HIERACIOIDES L.)
ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Курск
Горлюха ястребинковая (Picris hieracioides L.) - двулетнее или многолетнее травянистое растение, широко произрастающее в Средней полосе России. В народной медицине виды горлюхи используются в качестве потогонного, мягчительного и легкого слабительного средства.
Целью исследования явилось изучение веществ первичного биосинтеза травы горлюхи ястребинковой полисахаридов и аминокислот. Качественный моносахаридный состав полисахаридных комплексов был изучен методом хроматографии на бумаге после гидролиза кислотой серной. Качественный и количественный состав аминокислот был установлен с применением жидкостного хроматографа (ААА-400).
Комплекс полисахаридов травы горлюхи ястребинковой представлен водорастворимыми полисахаридами (10,20%), пектиновыми веществами (8,26%), гемицеллюлозой А (25,97%) и гемицеллюлозой Б (6,84%). Качественный моносахарид-ный состав полисахаридных комплексов включает галактозу, фруктозу, ксилозу, рамнозу, арабинозу, глюкозу, глюкуроно-вую и галактуроновую кислоты. Аминокислотный состав представлен 16 аминокислотами, включая 7 незаменимых. Доминирующими являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты.
Ключевые слова: горлюха ястребинковая, вещества первичного биосинтеза, аминокислотный состав, полисахариды.
V.N. Bubenchikova, I.V. Stepnova, E.A. Vorobyova THE STUDY OF SUBSTANCES OF PRIMARY BIOSYNTHESIS OF HAWKWEED OXTONGUE (PICRIS HIERACIOIDES L.)
Hawkweed oxtongue (Picris hieracioides L.) is a biennial or perennial plant, widely growing in the midland of Russia. In folk medicine it is used as a sudorific, demulcent and laxative agent.
The aim of work was investigation of substances of primary biosynthesis of Hawkweed oxtongue herb. The qualitative monosaccharide composition of polysaccharide complexes was estimated by the method of paper chromatography after sulfuric acid hydrolysis. The qualitative and quantitative composition of aminoacides was studied by the method of liquid chromatography (AAA-400).
The polysaccharide complex is represented by water-soluble polysaccharides (10,20%), pectin substances (8,96%), hemicellu-loses A (25,97%), hemicelluloses B (6,84%).
Qualitative monosaccharide composition of polysaccharides consists of glucose, galactose, fructose, arabinose, rhamnose, xylose, galacturonic and glucuronic acids. Amino-acid composition is represented by 16 amino acides, including 7 essential. The dominant amino acids were glutamic and aspartic acid.
Key words: Picris hieracioides L., substances of primary biosynthesis, amino-acid composition, polysaccharides.
Горлюха ястребинковая - двулетнее или многолетнее травянистое растение, широко произрастающее в Средней полосе России. В черноземной полосе встречается повсеместно, севернее - значительно реже [1].
Растение произрастает на лугах, в степях, на опушках леса, полянах, в сорных местах, среди зарослей кустарников [1].
В народной медицине виды горлюхи используются в качестве потогонного, мягчительного и легкого слабительного средства. Измельченные листья горлюхи ястребинковой в виде припарок прикладывают к плотным воспалительным очагам (фурункулам, карбункулам, ушибам) для их размягчения и рассасывания [2]. В экспериментальных исследованиях установлено наличие антиоксидант-ной, противовоспалительной, антибактериальной и цитотоксической активности у вод-
но-спиртовых экстрактов наземной части горлюхи ястребинковой [3].
Однако в научной медицине трава гор-люхи не находит применения. Одним из ограничений ее применения в научной медицине является недостаточная изученность химического состава. В настоящее время в надземной и подземной частях горлюхи ястребинковой найдены сесквитерпеновые лактоны, а в листьях идентифицирован Р-ситостерин [3]. Другие классы биологически активных веществ в траве и подземных органах горлюхи ястребинковой не изучались.
Целью нашего исследования явилось изучение веществ первичного биосинтеза травы горлюхи ястребинковой. Материал и методы Объектом исследования служила трава горлюхи ястребинковой, заготовленная в
2015 г. в фазу цветения на территории Курской области.
Для выделения полисахаридного комплекса воздушно-сухое измельченное сырье предварительно обрабатывали 70% спиртом этиловым для удаления полифенольных соединений. Затем высушенный шрот экстрагировали водой в соотношении 1:20 при нагревании до 95° С в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Повторное извлечение полисахаридов проводили водой дважды в соотношении 1:10. Растительный материал отделяли центрифугированием, и объединенные экстракты упаривали до 1/5 первоначального объема. Полисахариды осаждали тройным объемом 96% спирта этилового при комнатной температуре. Выпавший плотный осадок полисахаридов отделяли, очищали промыванием 70% спиртом этиловым и ацетоном. Полученные водорастворимые полисахаридные комплексы лиофильно высушивали [4,5].
Из шрота, оставшегося после получения водорастворимых полисахаридов, выделяли пектиновые вещества экстракцией смесью 0,5% растворов кислоты щавелевой и оксала-та аммония (1:1) в соотношении 1:20 при температуре 80-85° С в течение 2 часов. Повторное извлечение проводили дважды в соотношении 1:10. Объединенные извлечения концентрировали и осаждали пятикратным объемом 96% спирта этилового. Полученные осадки отфильтровывали, промывали спиртом этиловым, высушивали и взвешивали [4,5].
Шрот, оставшийся после выделения пектиновых веществ, заливали пятикратным объемом 10 % водного раствора натрия гид-роксида и оставляли при комнатной температуре на 12 часов. Затем отфильтровывали, к полученному фильтрату прибавляли два объема кислоты уксусной. Образовавшийся осадок отфильтровывали. На фильтре получался осадок гемицеллюлозы А в виде зеленовато-коричневой массы. К оставшемуся фильтрату для осаждения гемицеллюлозы Б добавляли двукратный объем 96% спирта этилового. Полученный осадок отфильтровывали, промывали спиртом и высушивали [4,5].
Для установления моносахаридного состава водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, гемицеллюлозы А и Б проводили их гидролиз кислотой серной (1 моль/л). Навески веществ (0,05 г) помещали в ампулу емкостью 5-10 мл, прибавляли 2,5 мл раствора кислоты серной, запаивали ампулы и выдерживали при температуре 100-105° С в течение 6 часов для водорастворимых полисахаридов, 24 часа для пектиновых веществ и 48 часов для
гемицеллюлоз А и Б. Гидролизат нейтрализо-вывали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной реакции, отфильтровывали и осаждали 96% спиртом этиловым. Образовавшийся осадок обрабатывали катио-нитом КУ - 2 до кислой реакции. Разделение и идентификацию нейтральных моносахаридов проводили методом нисходящей хроматографии на бумаге в системе растворителей н-бутанол - пиридин - вода (6:4:3) параллельно со стандартными образцами сахаров. Кислые моносахара разделяли в системе этилацетат -кислота муравьиная - вода - кислота уксусная (18:1:4:3). Хроматограммы проявляли анилин-фталатом при температуре 100° С в течение 1015 минут [4,5].
Качественный анализ аминокислот проводили в водном извлечении с помощью нин-гидриновой реакции и хроматографии в тонком слое сорбента [5]. Для этого 5,0 г воздушно-сухого измельченного сырья заливали 50 мл воды очищенной и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Извлечение фильтровали, сырье заливали снова 50 мл воды и операцию повторяли. Водные извлечения, полученные после трехкратной экстракции, объединяли, упаривали под вакуумом до 25 мл и использовали для проведения качественной реакции и хроматографического анализа. При качественном анализе смешивали равные объемы исследуемого извлечения и 0,1% свежеприготовленного раствора нингидрина и осторожно нагревали.
Хроматографический анализ проводили в тонком слое сорбента с использованием хроматографических пластинок «Sorbfil» и системы растворителей 96% спирт этиловый -концентрированный аммиак (16:4,5) параллельно с достоверными образцами аминокислот. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали 0,2% спиртовым раствором нингидрина и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105°С в течение нескольких минут [5].
Определение суммарного аминокислотного состава проводили на аминокислотном анализаторе - автоматизированном жидкостном хроматографе (ААА 400). Точную навеску сырья (0,2 г) вносили в колбу со шлифом, прибавляли 20 мл раствора 6 М кислоты хлористоводородной, плотно закрывали и термо-статировали при температуре 110°С в течение 23 часов. По окончании гидролиза колбу охлаждали до комнатной температуры, фильтровали кислое извлечение и при использовании роторного испарителя выпаривали досу-
ха. К сухому остатку добавляли 5 мл воды очищенной и процедуру повторяли дважды для удаления остатков кислоты хлористоводородной.
К выпаренному досуха остатку приливали 50 мл загрузочного буфера (рН - 2,2), который готовили следующим образом: в мерную колбу на 1 литр вносили отвешенные 14 г лимонной кислоты, 11,5 г хлорида натрия, 0,1 г азида натрия, 5 мл тиодигликоля, очищенной водой объем доводили до метки. В подготовленную ионообменную колонку вносили полученный и отфильтрованный раствор.
Проведение аминокислотного анализа осуществляли при следующих условиях: поток буферных растворов 0,3 мл/мин, скорость потока нингидринового реактива 0,2 мл/мин, детектирование проводили в УФ-областях при 440 и 570 нм, температура термостата реактора 121°С [6].
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований из травы горлюхи ястребинковой впервые были выделены полисахариды. Выход водорастворимого полисахаридного комплекса составил 10,25%. Он представляет собой аморфный порошок серо-коричневого цвета,
В составе выделенных пектиновых веществ преобладающей является галактуроно-вая кислота, кроме того, в них обнаружены и нейтральные моносахариды - галактоза, ара-биноза, ксилоза и рамноза.
В гидролизате гемицеллюлоз А и Б обнаружены ксилоза, галактоза, глюкоза, рамно-за. По величине пятен и интенсивности их окраски преобладающим моносахаридом является ксилоза, что указывает на наличие полисахаридов типа ксиланов.
Результаты качественного анализа аминокислот позволили установить их наличие в траве горлюхи ястребинковой. При хромато-графическом анализе аминокислоты проявлялись в виде красно-фиолетовых пятен.
Аминокислотный состав травы горлюхи ястребинковой представлен 16 аминокислотами (табл. 2). Среди идентифицированных аминокислот 7 являются незаменимыми.
Наибольшее количественное содержание отмечено для аспарагиновой (1,44%) и глутаминовой кислот (1,36%).
без запаха, хорошо растворим в воде, с образованием опалесцирующего раствора, практически не растворим в органических растворителях, дает положительные реакции осаждения со спиртом, ацетоном и реакцию Феллин-га после кислотного гидролиза, а также образует оранжевое окрашивание с раствором основного свинца ацетата и зеленоватый осадок с раствором меди сульфата.
Выход пектиновых веществ составил 8,26% от массы воздушно-сухого сырья. Пектиновые вещества представляют собой порошок светло-бежевого цвета, хорошо растворимый в воде с образованием вязкого раствора (рН 3-4). Водные растворы пектиновых веществ осаждаются 1% раствором алюминия сульфата с образованием пектинов. Выход гемицеллюлозы А составил 25,97%, а геми-целлюлозы Б - 6,84% от массы воздушно-сухого сырья.
Методом хроматографии на бумаге параллельно с достоверными образцами сахаров в исследуемом водорастворимом полисаха-ридном комплексе идентифицировали галактозу, фруктозу, ксилозу, рамнозу и глюкуро-новую кислоту с преобладанием галактозы и фруктозы (табл. 1).
Таблица 1
Таблица 2
Содержание связанных аминокислот
в траве горлюхи ястребинковой_
Наименование Содержание в пересчете на абсо-
аминокислоты лютно сухое сырье, мг/100 мг
Аспарагиновая кислота 1,44
Треонин* 0,50
Серин 0,48
Глутаминовая кислота 1,36
Пролеин 1,26
Глицин 0,52
Алании 0,55
Валин* 0,64
Метионин* 0,05
Изолейцин* 0,51
Лейцин* 0,80
Тирозин 0,25
Фенилаланин* 0,52
Гистидин 0,40
Лизин* 0,63
Аргинин 0,63
* Незаменимые аминокислоты.
Выводы
1. В траве горлюхи ястребинковой изучены вещества первичного биосинтеза -полисахаридные комплексы и аминокислоты.
Моносахаридный состав выделенных полисахаридных комплексов из травы горлюхи ястребинковой
Наименование полисахаридного комплекса Моносахаридный состав
Водорастворимый полисахаридный комплекс Галактоза, фруктоза, ксилоза, рамноза, глюкуроновая кислота
Пектиновые вещества Галактуроновая кислота, галактоза, арабиноза, ксилоза, рамноза
Гемицеллюлоза А Ксилоза, галактоза, глюкоза, рамноза
Гемицеллюлоза Б Ксилоза, галактоза, глюкоза, рамноза
2. Полисахариды выделены по фракциям: водорастворимый полисахаридный комплекс - 10,20%, пектиновые вещества - 8,26%, гемицеллюлоза А - 25,97%, гемицеллюлоза Б -6,84%. Изучен их моносахаридный состав.
3. В траве горлюхи ястребинковой идентифицировано 16 аминокислот, среди которых 7 незаменимых. Доминирующими аминокислотами травы горлюхи ястребинковой являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты.
Сведения об авторах статьи:
Бубенчикова Валентина Николаевна - д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой фармакогнозии и ботаники ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. Адрес: 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3. E-mail: [email protected]. Степнова Ирина Владимировна - генеральный директор испытательного центра «Фармоборона». Адрес: 141074, Московская обл., г. Королев, ул. Гагарина, 46а. E-mail: [email protected].
Воробьева Екатерина Александровна - студентка 4 курса ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. Адрес: 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.
ЛИТЕРАТУРА
1. Иллюстрированный определитель растений Средней России. - Т. 3: Покрытосеменные (двудомные: раздельнолепестные) / И.А. Губанов, К.В. Киселева, В.С. Новиков, В.Н. Тихомиров. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. - 520 с.
2. Дикорастущие полезные растения России / под ред. А.Л Буданцева, С.П. Лесиовской. - СПб., 2001. - 663 с.
3. Растительные ресурсы России: дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. - Т. 5. Семейство Asteraceae (Compositae). Часть 2 роды Echinops - Youngia / отв. ред. А.Л. Буданцева. - СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2013. - 312. с.
4. Бубенчиков, Р.А. Исследование полисахаридного комплекса травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Р.А. Бубенчиков, Т.А. Позднякова // Научные ведомости БелГУ. - 2012. - Вып. 20/1, № 22 (141). - С. 140-141.
5. Бубенчикова, В.Н. Аминокислотный, жирно-кислотный и полисахаридный состав травы тимьяна Палласа (Thymus рallasianus L.) / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Старчак // Химия растительного сырья. - 2014. - N° 3. - С. 191-194.
6. Олешко, Г.И. Разработка унифицированной методики количественного определения суммы свободных аминокислот в лекарственном растительном сырье и экстракционных препаратах / Г.И. Олешко, Е.В. Зорина, М.Д. Решетникова // Фармация. -2011. - № 3. - С. 14-17.
УДК 615.322.07:[582.678.2:581.45]
© Коллектив авторов, 2016
Э.Х. Галиахметова, Н.В. Кудашкина, С.В. Чуйкин, Е.Г. Егорова ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕНСИТОМЕТРИИ В КАЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ ФЛАВОНОИДОВ ЛИСТЬЕВ ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО
ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа
В статье рассмотрены вопросы изучения качественного состава флавоноидов листьев лимонника китайского, выращенного в условиях Республики Башкортостан. В последнее время наряду с общепринятыми методами (спектрофотомерия, высокоэффективная жидкостная хроматография) в практику широко внедряется метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии, или хроматоденситометрии, который позволяет качественно и количественно оценить содержание действующих веществ в изучаемых объектах. Нами подобраны оптимальные условия денситометрического исследования изучаемого сырья: соотношение сырье - экстрагент и концентрация этилового спирта для получения извлечения, система растворителей, марка хроматографических пластинок, время насыщения хроматографической камеры.
Наилучшее разделение пятен наблюдалось при использовании извлечения, полученного экстракцией 70% этиловым спиртом в соотношении 1:5, системы растворителей этилацетат - метанол - вода (77:15:8). По площади и высоте пиков денситограммы было установлено, что доминирующим веществом является кверцетин.
Ключевые слова: листья лимонника китайского, флавоноиды, хроматографический анализ, денситометрия.
E.Kh. Galiakhmetova, N.V. Kudashkina, S.V. Chuikin, E.G. Egorova THE USE OF DENSITOMETRY IN THE QUALITATIVE ANALYSIS OF FLAVONOIDS OF SCHISANDRA CHINENSIS LEAVES
The article considers the issues of studying the qualitative composition of flavonoids of the leaves of schisandra chinensis grown in the Republic of Bashkortostan. In recent years, along with the conventional methods (spectrophotometry, high performance liquid chromatography) in practice is widely implemented method of high performance thin layer chromatography or chro-matogramme, which allows to quantitatively assess the content of active substances in the studied objects. We have determined the optimum conditions for the densitometry of the studied materials: the concentration of ethanol, ratio of raw material and extractant, the solvent system, chromatographic grade records, the time of saturation of the chromatographic chamber.
The best separation was observed when using 70% of ethanol, ratio of raw material and extractant 1:5, solvent system ethyl ace-tate-methanol-water (77:15:8). Area and height of the peaks showed that the dominant ingredient is quercetin.
Key words: leaves of Schisandra chinese, flavonoids, chromatographic analysis densitometry.
В последние годы лимонник китайский вызывает интерес многих ученых. Ведутся многочисленные исследования по изучению химического состава различных органов этого
растения. В литературных источниках преимущественно иностранных авторов большое внимание уделяется расширению фармакологических свойств лимонника китайского бла-
