CC BY
69
126 ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
'3-1 (S0) май 2011 г.
ТРИФОНОВА Э.В., САИФУТДИНОВ Р.Г. УДК 615.03: 004.354.5
Казанская государственная медицинская академия, г. Казань МСЧ ОАО «Татнефть», г. Альметьевск, Россия
Исследование на мышах мутагенного эффекта МТБЭ
Цель: Изучить на мышах мутагенный эффект метил-терт-бутилового эфира (МТБЭ).
Материалы и методы: Мутагенное действие МТБЭ оценивалось по: 1) анализу хромосомных аберраций в клетках костного мозга; 2) тесту на мутагенность на культуре Salmonella; 3) тесту на доминантные летальные мутации на мышиных эмбрионах.
1). Анализ хромосомных аберраций в клетках костного мозга был выполнен на мышах линии CBWA массой 18-20 г Экспериментальная и контрольная группа состояли из 5 животных. МТБЭ вводился животным внутрибрюшинно (в/б) в дозе 700 мг/кг. Контрольные животные получили дистиллированную воду. Животные были забиты через 6, 24 и 48 ч после введения. За час до гибели им в/б вводился колхицин в дозе 4.8 мг/кг (производства фирмы Serva). Подготовка хромосомных препаратов: клетки костного мозга, извлеченные из бедра, помещались в раствор Хэнка (Hank) и центрифугировались в течение 7 мин. при 1000 об./мин., супернатант был слит. Клетки заливались теплым (37°C) гипотоническим раствором хлористого калия (0.075 M) и инкубировались в нем 50 мин., встряхивались, затем снова центрифугировались. Супернатант снова сливали, а клетки фиксировали реактивом Карнуа (Carnua) в смеси с абсолютированным метанолом и ледяной уксусной кислотой 3:1. Суспензия выдерживалась 30 мин. при 4°C, затем центрифугировалась. Надосадочная жидкость сливалась, клетки трижды промывались фиксативом Карнуа. Затем к клеткам добавили свежий фиксатив (0.2-0.5 мл в зависимости от объема клеток) и перенесли на планшеты, предварительно высушенные над огнем. Полученный клеточный эфир окрашивался азуром и эозином. Метафазные клетки были проанализированы на наличие хромосомных аберраций согласно рекомендациям ВОЗ. Данные были обработаны статистически по t-критерию Стьюдента.
2). Тест на мутагенность на культуре Salmonella выполнен согласно методике Ames. Мутации оценивались по фенотипическому проявлению гистидиновой прототрофии у Salmonells typhimurium на штаммах TA98, TA100 и TA1527. Штамм TA98 несет сдвиговую мутацию типа I a his d 3052. Возврат к дикому типу происходит благодаря делеции 2 пар C-G в последовательности C-G-C-G-C-G-C-G-C-G около мутантного сайта. Эта мутация в данном участке может служить для оценки способности соединений вызывать сдвиговые мутации. Типичным агентом, обладающим такой активностью, является 2-нитрофлюорен или DDDTDP. Штамм TA537 несет сдвиговую мутацию. Как известно, здесь ДНК имеет один добавочный цитозин в последовательности CCC. Типичным агентом, проявляющимся на этом штамме, является 9-аминоакридин. Штамм TA100 имеет точечную мутацию his G46, которая устраняется при действии многих мутагенов, индуцирующих смену нуклеотидных пар. Стандартными агентами, проявляющими активность на этом штамме, являются азид натрия и 2-нитрофлюоран. Указанные
штаммы исследовались на автотрофию гистидина, на наличие пластид pKM 101 у штаммов TA98 и TA100 и на наличие rfa-мутаций. Данный метод позволяет обнаружить действие как самой МТБЭ на тестовые участи ДНК, так и его метаболитов, образующихся под действием микросомальной фракции печени крыс.
Исследовали концентрации МТБЭ от 0.4 до 4000 мкг/чашку. Полуобогащенный агар расплавлялся на водяной бане при 100°C, охлаждался до 44-45°C и разливался в тестовые трубки. Туда же добавлялся исследуемый МТБЭ, свежая (суточная) бактериальная культура, фракция S9 из печени крыс, кофакторы (по 100 мкл каждого). Фракции печени крыс, индуцированные Aroclor, были получены от Labsystems (Финляндия). Эксперимент был выполнен как с полностью активированной микросомальной фракцией (ПАМФ), так и частично (не полностью) активированной фракцией (НАМФ). Агаровая среда со всеми компонентами была нанесена на минимальную агаровую среду в чашках Петри. После того, как агар застыл, чашки были помещены в термостат при 37°C. Для каждой дозы МТБЭ было сделано три пробы с ПАМФ и три пробы с НАМФ. После 48-часовой инкубации чашки были проанализированы на наличие колоний ревертантов. Среднее геометрическое число ревертантов подсчитано по формуле: X = exp (lnX1 + lnX2 + lnX3)/3, где X1, X2 и X3 — число ревертантов в 1-й, 2-й и 3-й чашке Петри соответственно.
3). Тест на доминантные летальные мутации на мышиных эмбрионах. Мыши-самцы линии (CBAxC57Bl6)F1 с низким уровнем спонтанных мутаций получили МТБЭ перорально однократно в дозе 3000 мг/кг. Экспериментальные и контрольные группы содержали по 15 животных. После введения МТБЭ 8 из 15 самцов погибло. Оставшиеся самцы участвовали в экспериментах. На третий день после ведения в клетку каждого из оставшихся в живых самцов были подсажены по 3 девственные самки. На 7-й день самок заменили новыми. На 17-й день беременности самки были умерщвлены, а эмбрионы, как живые, так и мертвые, подсчитаны. Повышенный процент гибели эмбрионов за первую неделю говорит о том, что летальные мутации несут зрелые сперматозоиды; за вторую неделю — что мутации затронули поздние сперматиды; за третью — что мутации подверглись ранние сперматиды. Процент постимплантационной гибели вычислялся по следующей формуле: A = d / (l + d), где d — число погибших, а l — число живых зародышей. Статистическая значимость различий оценивалась по критерию х2, который вычислялся как %2 = {(ab - bc) - 0.5 N2N} / {(a + b) (c + d)(a + c)(b + d)}, где a — число погибших зародышей в контроле;
b — число погибших зародышей, МТБЭ; с — число живых зародышей, контроль; d — число живых зародышей, МТБЭ.
Результаты: Анализ хромосомных аберраций в клетках костного мозга показал, что число клеток красного кровяного мозга, находящихся в стадии метафазы, было несколько
ТЕРАПИЯ
'3-1 (50) май 2011 г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА 127
увеличено у мышей, получавших МТБЭ. Однако разница не является статистически значимой, что указывает на то, что доза, составляющая почти треть от ЛД50, не оказывает мутагенного действия.
Тест Эймса на мутагенность на культуре Salmonella не выявил мутагенного действия МТБЭ в концентрациях 0.4-4000 мкг/ чашку. Тест на доминантные летальные мутации на мышиных эмбрионах не показал никакого значимого различия в уровне постимплантационной смертности между контрольными мышами и мышами, получавшими исследуемый МТБЭ. Это
указывает, что МТБЭ не вызывает летальных доминантных мутаций в зрелых клетках спермы, а также в ранних и поздних сперматидах.
Заключение: Следовательно, в дозах 700 мг/кг и 3000 мг/кг (10 и 40 терапевтических доз для человека) МТБЭ не проявляет мутагенную активность (по тесту хромосомных аберраций) и не вызывает летальных мутаций в репродуктивных клетках у мышей, т.е. не обладает мутагенным действием в исследованных тестах, а также не является потенциальным канцерогеном.
УДК 615.03: 004.354.5
ТРИФОНОВА Э.В., САЙФУТДИНОВ Р.Г.
Казанская государственная медицинская академия, г. Казань МСЧ ОАО «Татнефть», г. Альметьевск, Россия
Влияние МТБЭ на гуморальный иммунный ответ мышей
Цель: Оценить влияние метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ) на гуморальный иммунный ответ мышей.
Материалы и методы: Экспериментальные животные (мыши линии С57ВІ/6, СВА и РІ (СВАхС57В1) поступали из питомника РАМН «Рапполово», Ленинградская область. Из МТБЭ готовили 0,01%-ный водный раствор, который не оказывал направленного воздействия на число антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей. Экспериментальный эмоциональный стресс вызывали скученностью (40 мышей в клетке размером 17x25x8 см) в течение 10 дней. Контрольные животные в течение эксперимента получали ежедневно вну-трижелудочно (в/ж) дистиллированную воду, опытные — МТБЭ в дозе 70 мг/кг. Использованы следующие методы исследования влияния на иммунную систему животных: 1). Определение числа АОК в селезенке мышей на 7-й день после иммунизации оптимальной (1х108 кл) и субоптимальной (2х107 кл) дозами эритроцитов барана (ЭБ). 2). Определение титров гемагглютининов (ГА) и ЭБ проводили на 7-й и 14-й дни после иммунизации оптимальной и субоптимальной дозами антигена в 96-луночных круглодонных планшетах. Результаты учитывали макроскопически. Схемы введения МТБЭ аналогичны схемам при определении числа АОК.
Результаты: Исследование влияния МТБЭ на формирование АОК в селезенке мышей и титры ГА в сыворотке различных линий мышей, иммунизированных оптимальной и субопти-мальной дозой ЭБ показало, что при внутрибрюшинном (в/б) введении МТБЭ стимулирует примерно, в 2 раза формирование АОК в селезенке и на титр (т.е. в 2 раза) уровень ГА в сыворотке мышей линии С57ВІ/6, слабоотвечающих на ЭБ как при иммунизации оптимальной, так и субоптимальной дозой антигена. Стимуляция образования АОК у сильноотвечающих мышей РІ при иммунизации субоптимальной дозой ЭБ, вызываемая исследуемым МТБЭ в дозах 70 и 700 мг/кг, и повышение титра
ГА при введении 700 мг/кг МТБЭ свидетельствуют о наличии адьювантных свойств.
При 7-дневном в/ж введении МТБЭ в дозе 700 мг/кг отмечено увеличение числа АОК в селезенке мышей С57В1/6 при оптимальном и субоптимальном режиме иммунизации, а титры ГА возрастали лишь при введении оптимальной дозы антигена.
Представляет интерес факт дозозависимого угнетения образования АОК в селезенке мышей Р1, при введении оптимальной дозы ЭБ и снижение титра ГА в сыворотке при в /б и в/ж введении МТБЭ в дозе 700 мг/кг Это явление может быть связано с тем, что при одновременном введении значительного количества ЭБ и ксенобиотика — МТБЭ — происходит активация как цепи дыхательных ферментов, так и активности моноокси-геназ, в частности, цитохрома Р-450. Последнее обстоятельство, связанное с функциональной сопряженностью иммунной системы с метаболизмом, приводит к ускорению деградации эритроцитов в фагоцитирующих клетках, уменьшению антигенных свойств ЭБ и, как следствие, к уменьшению выраженности гуморального иммунного ответа у интактных животных, полноценных по всем физиологическим параметрам. Снижение титров ГА носит фазовый характер и к 14-му дню после иммунизации показатели опытных и контрольных групп достоверно не различаются. Таким образом, МТБЭ незначительно стимулирует развитие гуморального иммунного ответа, обладает адьювант-ными свойствами и модулирует выраженность гуморального иммунного ответа у сильноотвечающих на ЭБ линий мышей.
Выводы: МТБЭ стимулирует развитие гуморального иммунного ответа у слабоотвечающих мышей линии С57В1/6 в дозах 70 и 700 мг/кг и у сильноотвечающих мышей линии Р1(СВА*С57В1), иммунизированных субоптимальной дозой антигена. В дозах 70 и 700 мг/кг при в/б введении и в дозе 700 мг/кг при в/ж введении у мышей Р1(СВА*С57В1), иммунизированных оптимальной дозой антигена, МТБЭ подавляет развитие гуморального иммунного ответа.
ТЕРАПИЯ
