CC BY
75
Б. П. Струнин, Л. Ф. Саттарова, Л. К. Шарипова,
Н. А. Фролова, С. Ю. Гармонов, А. Ф. Исмагилова, П. А. Гуревич
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИТРИЛА
Изучены основные фармакотоксикологические свойства 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты (полит-рила) и показана возможность его применения в ветеринарии как антимикробного средства
В настоящее время в медицине и ветеринарии широко используются высоко активные антибактериальные препараты - ингибиторы ДНК-гиразы бактерий, относящиеся к классу 6-фторопроизводных 4-оксохинолинкарбоновых-3 кислот [1]. Одним из таких соединений с широким спектром антибактериального действия является 1,4-дигидро-7-пиперазил-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновая-3 кислота (норфлоксацин -1) [2]:
1) X = N4 норфлоксацин, 2) X = О политрил.
В работе [3] отмечено, что фрагмент «В» - пиперазиновый цикл или другой азотсодержащий фрагмент - обеспечивает оптимизацию фармакокинетических свойств и повышение антимикробной активности. Учитывая, что фторохинолоны прочно зарекомендовали себя как высокоэффективные химиотерапевтические лекарственные вещества (ЛВ) системного действия с широким диапазоном показаний к применению при лечении инфекционных заболеваний и гнойно-воспалительных процессов, нами была поставлена задача конструирования хинолонокарбоновой кислоты с сохранением всех фрагментов норфлок-сацина и модификацией азотсодержащего гетероцикла - заменой атома азота на кислород. Представлялось, что это приведет к сокращению числа метаболитов ЛВ.
Был синтезирован [4] аналог норфлоксацина - 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновая-3 кислота (политрил - 2). При этом учитывалось, что фрагмент морфолина входит в состав ряда ЛВ и, следовательно, можно было ожидать проявления соединением 2 биологической активности. Предположения оправдались - политрил после многочисленных испытаний допущен для лечения бактериальных инфекций у сельскохозяйственных животных, в том числе, птиц [5]. Это антибактериальное средство для орального применения обладает антимикробным действием против грамотрицатель-ных и грамположительных микроорганизмов, механизм действия которого связан с нарушением синтеза белков микроорганизмами. Выделяется препарат из организма в основном с мочой и желчью.
Целью настоящей работы являлось изучение основных фармакотоксикологических свойств субстанции политрила.
Экспериментальная биологическая часть
Экспериментальные лабораторные исследования проведены на 578 белых беспородных мышах и мышах линии СВА и С57В1 с живой массой 18-20 г; на 184 белых крысах с массой 175-220 г. Лабораторные животные содержались в одинаковых зоогигиенических условиях вивария. Кормление животных проводили согласно суточной потребности лабораторных животных [6].
Изучение острой токсичности политрила проводили по общепринятой методике [7]. Политрил вводили перорально при помощи ротожелудочного зонда. На основании данных гибели животных от применения разных доз исследуемого соединения методом интегрирования по Беренсу [8] устанавливали абсолютно смертельную дозу (Ьйюо) и максимально переносимую дозу О-йо). Значения 1_0-|б и -084, найденные по характеристической кривой, построенной на основании интегрированных данных, использованы для определения коэффициентов вариабельности смертельных доз. Дозу, вызывающую гибель половины животных 1_050, рассчитывали по формуле Кербера, среднюю ошибку 1_050 определяли по формуле Гаддэма [8].
Противоязвенную активность определяли на моделях язв, вызванных индометаци-ном и ацетилсалициловой кислотой, путём двукратного введения их в желудок крысам через зонд с учётом эффективных доз [9].
Противовоспалительная активность политрила была изучена на общепринятых моделях воспалений, вызванных 2% раствором лидокаина гидрохлорида, 10% раствором яичного белка, 2% формалином в дозах по 0,05 мл каждого флогогена [10].
Определение антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей определяли с помощью метода локального гемолиза в жидкой фазе [11]. Для иммунизации животных в качестве антигена использовали эритроциты барана, трижды отмытые физиологическим раствором. Антиген вводили внутрибрюшинно в оптимальной дозе 2х10 клеток на 20 г массы животного. Определение числа АОК в селезенке иммунизированных животных производили на 5 сутки после введения эритроцитов барана. Забой животных проводили под эфирным наркозом путем цервикальной дислокации.
Гиперчувствительность замедленного типа политрила на функциональную способность Т - эффекторов изучали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ), спровоцированной динитрофторобензолом в ацетоновом растворе. При постановке реакции сенсибилизацию мышей осуществляли нанесением 1 капли 1% раствора динит-рофторобензола на правый бок. Через 10 суток после сенсибилизации животные получали разрешающую дозу - по 1 капле 0,1%-ного раствора динитрофторобензола на каждую сторону правого уха. Через 24 часа определяли степень изменения массы пораженного уха в сравнении с контрольным. Интенсивность РГЗТ определяли как разницу в массах опытного и контрольного уха, выраженную в %. С целью более полного изучения влияния полит-рила на клеточно-опосредованные иммунные реакции дополнительно применялся метод формирования реакции ГЗТ у мышей внутривенным введением эритроцитов барана (2х106 клеток) - сенсибилизирующей дозы, и через 10 дней субплантарно в лапку (2х10 клеток) -разрешающей дозы. Спустя сутки после последнего введения, по приросту (в %) массы правой лапки нами определялась интенсивность РГЗТ.
Влияние политрила на кожу и слизистые оболочки мышей и крыс изучали путем нанесения на выстриженный участок кожи в межлопаточной области на протяжении 2-х
недель по одному разу в день по капле раствора ЛВ в вазелиновом масле. Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб [12]. Повторное местное действие изучали на крысах (самках), которым на кожу наносили соединение (по 2 капли) ежедневно, в течение трех недель. Действие политрила на слизистую оболочку глаза изучали на крысах-самцах. Для постановки пробы 1 каплю водного раствора вводили в коньюкти-вальный мешок крысе, во второй глаз (контрольный) вводили 1 каплю воды. Реакцию учитывали через 15 мин и через 24-48 часов (гиперчувствительность замедленного типа) [12].
Сенсибилизирующее действие политрила исследовали на морских свинках-альбиносах - половозрелых животных обоих полов массой тела 290-300 г. Разброс в экспериментальных группах по исходной массе не превышал ±10%. На выстриженный участок спины вводили внутрикожно изучаемое соединение в двукратных разведениях в концентрации, не вызывающей кожно-раздражающего действия. Затем вводили внутривенно по 0,5 мл 1%-ного раствора «синего Эванса». Через 30 минут животных забивали и определяли размеры синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения изучаемого соединения. Для контроля реактивности кожи на другой выстриженный участок вводили микрошприцем по 0,05 мл стерильного физиологического раствора. Разрешающие инъекции исследуемого соединения и «синего Эванса» вводили также и контрольным животным, которым в дни сенсибилизации опытных групп давали только стерильный физиологический раствор.
Влияние политрила на эффекторную способность Т-лимфоцитов в реакции трансплантационного иммунитета оценивали путём воспроизведения феномена «Трансплантант против хозяина» (РТПХ). Использовали метод количественной оценки РТПХ в регионарных узлах при локальном введении аллогенных клеток. Гибридам Р1 в правую заднюю лапку подкожно вводили клетки лимфатических узлов, взятых у мышей линии СВА (родительского генотипа). Лимфатические узлы гомогенизировали в камере Горяева, подсчитывали количество лимфоцитов, готовили раствор, содержащий в 0,5 мл 1х106 лимфоцитов. Приготовленную суспензию лимфоцитов вводили гибридам Р1 в подушечку задней лапки. Данным животным в течение 7 дней внутрь вводили политрил в дозе 5 мг/кг. Второй группе вводили оксиметилурацил (ОМУ) в дозе 50 мг/кг и третья группа служила контролем. На восьмые сутки животных забивали, определяли массу подколенных лимфатических узлов в опытной правой конечности и контрольной лапки, гомогенизировали лимфатические узлы и подсчитывали количество лимфоцитов.
Степень мутагенной активности политрила исследовали при выявлении генных мутаций индикаторных штаммов ТА1950, ТА98, ТА100 [13]. Штаммы ТА1950 и ТА100 позволяют учитывать мутации типа замены пар оснований, а ТА98 и ТА100 типа сдвига рамки считывания. Мутагенную активность изучали в условиях метаболической активации и без неё. Условия наличия или отсутствия метаболической активации создавали внесением в смесь кофакторов (НАДФ и глюкозо-6-фосфат). Для окончательного решения вопроса о степени мутагенной активности политрила использовали метод цитогенетического анализа клеток костного мозга. При этом учитывали хромосомные аберрации клеток костного мозга мышей линии С57В1. Препарат вводили в дозах 500 мг/кг однократно, а 5 и 50 мг/кг в течение 5 дней. При исследовании учитывали одиночные и парные фрагменты, хрома-тидные и хромосомные обмены. Отдельно регистрировали гены-пробелы.
Изучение эмбриотоксического действия политрила проведены на белых беспородных крысах. У самок весом 180-200 г периодически проводили цитологическое изучение вагинальных мазков для определения стадии астрального цикла. Для спаривания отбирали животных, находящихся в стадиях проэструса или эструса, предтечки и течки. Самок под-
саживали к самцам в соотношении 2:1 во вторую половину дня. На следующее утро изучали влагалищные мазки. При обнаружении в них сперматозоидов этот день считали первым днем беременности. Крысы получали препарат один раз в день с 1 по 21 день беременности. Контрольным животным вводили в те же сроки воду или крахмал. Самок забивали путем декапитации. Вскрывали брюшную полость матки, яичники помещали в чашку Петри с физиологическим раствором. В яичниках подсчитывали число желтых тел, в матке после её вскрытия - количество живых и мертвых плодов, а также места имплантации и резорбции зародышей. Плаценты и каждый плод взвешивали, измеряли кранио - каудальный размер, определяли пол и исследовали под бинокулярной лупой МБО-2. Внешний осмотр позволяет обнаружить дефекты глаз, мозга, лицевого черепа, конечностей, позвоночника, хвоста, брюшной стенки. Кроме того, 1/2 часть всех плодов исследовали с помощью мик-роанатомического метода Вильсона [14] для выявления дефектов внутренних органов и 1/2 часть - методом Доусона [15] для изучения состояния скелета. Показатель предимпланта-ционной гибели эмбрионов вычисляли как разность между количеством желтых тел и мест имплантаций, отнесенную к числу желтых тел, принятых за 100%. Показатель постим-плантационной гибели определяли как разность между числом мест имплантаций и живых плодов, отнесенную к числу мест имплантаций, принятых за 100 %.
Определение канцерогенной активности политрила проводили на аквариумных рыбках гуппи, которые были разделены на три группы: контрольную и две опытные по 40 голов в каждой. Рыбам 2 и 3 групп ежедневно со специально приготовленным кормом задавали аналогичный корм без добавки препарата. Ежедневно вели наблюдение за состоянием и активностью рыб. Существенных различий по этим показателям между контрольной и опытными группами не наблюдалось, рыбы полностью поедали задаваемый им корм.
Определение бактериостатической активности in vitro проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Бактерицидную активность изучали путем воздействия препаратов на тест объекты при комнатной температуре и дальнейшего культивирования золотистого стафилококка (штамм 209Р), кишечной палочки (штамм 1749). Бактериостатические и бактерицидные свойства определяли визуально по отсутствию роста культуры в пробирках после суточной и пятисуточной инкубации при температуре 37оС [16].
Микроскопические исследования проводились с использованием светового микроскопа ХЕКАУАЬ фирмы «САКЬ ZEISS» (Германия).
Экспериментальная химическая часть
Объектом исследования являлась субстанция политрила, синтезированная по ранее описанной нами методике [4]. С целью установления идентичности вновь синтезированного антимикробного средства предлагаемой структуре было проведено сравнение спектров ЯМР 1Н, 13С, 19F политрила (2) и норфлоксацина (1), выделенного из импортного препарата нолицин (синоним 1) и специально синтезированного. Как следует из сравнения спектральных данных политрил по своей структуре наиболее близок к норфлоксацину.
Спектр ЯМР 1Н политрила (2) /норфлоксацина(1) (ГМДС, D20, Bruker, 100 МГц), м.д.: 1,02 т/1,00 т (3Н, С13Н3); 2,6 т/2,6 с (8Н, 2N(CH2h); 2,7 т (4Н, 0(СН2Ь)/-; 3,81 к/3,80 к (2Н, NCH2); 6,43 с/6,45 с (1Н, С8Н=); 7,36 д/7,38 д (1Н, С5Н=, 3Jfh= 3,75 Гц); 7,98 с/8,00 с (1Н, С2Н); сигнал N-H протона не проявляется вследствие дейтерообмена с D20.
Спектр ЯМР 13С политрила (2)/норфлоксацина(1) (D2O, Bruker, 100 МГц), м. д.: 14,0/13,9 (С13); 49,1/49,1 (С12); 50,1/50,9 (С14); 66,6/44,9 (С15); 104,5/105,6 (С8); 112,0/111,9
(С5); 117,1/117,3 (С3); 122,4/122,7 (С10); 136,5/136,7 (С9); 144,1/144,8 (С7); 147,2/147,7 (С2); 152,7/153,1 (С6); 172,0/172,6 (С11); 175,0/175,2 (С4).
Атом фтора проявляется в спектре 19F 5 = - 48,1/- 48,2 ppm (Н20 + KF + D20).
Строение продукта 2 подтверждают данные масс-спектрометрии электронного удара (ЭУ) (TRACE MS «Finnigan MAT», энергии ионизирующих электронов 70 эВ, температура источника ионов 200°С при прямом вводе вещества). В масс-спектре 2 пик m/z 320 отвечает молекулярному иону (М+ .) молекулы со структурой 2. Первая стадия распада молекул 2 при ЭУ связана с разрывом C-С и С-0 связей в азотсодержащем насыщеннном гетероцикле. Данный процесс приводит к пику иона [M^2^O]+ m/z 276. Потеря самого гетероцикла М+' - ионом обусловливает появление в масс-спектре пика иона m/z 234. Наряду с этим процессом происходит миграция одного атома водорода к заряженному осколку с образованием иона с m/z 235. В дальнейшем последний ион теряет ОН - группу с образованием иона m/z 218. Присутствие в масс-спектре иона m/z 203, можно связать с последующим отщеплением СН 3- группы из иона m/z 218. Присутствие других осколочных ионов с малыми значениями m/z в масс-спектре ЭУ 2 вызвано, по-видимому, последовательным распадом при ЭУ отмеченных выше ионов.
Масс-спектр образца политрила, m/z (относительная интенсивность в % макс), ион: 320(0.8) [М+]*, 278(0.5), 277(3.5), 276(20.8) [М-С2Н40]+,275(0.9), 237(1.1), 236(2.1) 235(1.3), 234(2.3), 219(5.3), 218(24.9), 217 (2.4), 204(3.3), 203(19.9), 149 (11.8), 123 (13.8), 109(26.1), 107(19.9), 105(10.4), 91 (12.6), 85(27.6), 77(7.9) 69 (90.5), 57(80.1), 56(24.7), 43(100.0)^2^0]+, 41(76,9).
Результаты и их обсуждение
При изучении острой токсичности в дозах 2000-2300 мг/кг у мышей отмечалось незначительное угнетение, мыши забивались в угол, переставали двигаться, как бы «застывали» на месте. Через 2-3 часа после введения политрила животные приходили в нормальное состояние. При введении белым мышам политрила внутрь в дозах 2800-2900 мг/кг признаки отравления проявлялись через 30-40 минут. Отмечалась повышенная рефлекторная возбудимость, животные бегали по клетке. В течение судорожного периода погибло большинство мышей. Перенесшие судороги животные, как правило, выживали и в дальнейшем не погибали. Судороги чередовались с периодами покоя. Через 5-10 минут после введения политрила в желудок в дозе 5000 мг/кг животные теряли двигательную активность, а затем спустя 1 -2 минуты начинались судороги. В последующем животные принимали боковое положение, часть которых, не выходя из этого состояния, погибала от остановки дыхания. При вскрытии грудной клетки мы не смогли отметить каких-либо признаков сердечного автоматизма, который не удавалось вызвать механическим раздражением сердечной мышцы пинцетом. По-видимому, наиболее вероятной причиной гибели опытных животных, при введении им летальных доз политрила является остановка сердца. Подобные изменения были обнаружены и при введении токсических доз политрила крысам. Коэффициент вариабельности для белых мышей при пероральном применении составил
1,15, для крыс 1,12. Среднесмертельная доза политрила для белых мышей составила 2575,0±91,1 мг/кг, для крыс 3066,6±46,б мг/кг. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что политрил относится к 4 классу опасности (малотоксичные вещества).
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что до настоящего времени остаются недостаточно изученными антиульцерогенные свойства производных фторохи-нолонового ряда [1]. Нами установлено, что при индукции язв индометацином политрил в
значительной мере предохраняет слизистую оболочку желудка. При применении политри-ла наблюдалось минимальное количество изъязвлений. При его введении в дозе 5 мг/кг противоязвенная активность составила 6,95, превысив таковую у животных, получавших фуразолидон, на 74,9%. В контрольной группе животных отмечались язвенные поражения в различных отделах желудка. Слизистая оболочка желудка была отечной, гиперемиро-ванной, с множественными редкоточечными эрозиями и крупными язвами. При моделировании «ацетилсалициловых» язв у крыс было установлено, что политрил в дозе 5 мг/кг обладает выраженной антиульцерогенной активностью. Так, при его применении индекс изъязвления уменьшился с 16,17±0,32 (контроль) до 2,9±0,3. Противоязвенная активность составила 6,30. Таким образом, политрил в дозе 5 мг/кг защищает слизистую оболочку желудка, не тормозя секреции кислоты.
Механизм противовоспалительного действия многих препаратов включает торможение циклооксигеназы, биосинтез простагландинов и тромбоксанов. Следствием угнетения синтеза простагландинов является повреждение желудочно-кишечного тракта, задержка натрия и воды, повышение давления и бронхоспазм. В проведенных экспериментах не отмечены побочные эффекты при длительном применении политрила в дозах от 3 до 6 мг/кг. Как показали исследования на моделях воспалений, вызванных формалином, каррагенином, ли-докаином и яичным белком политрил в дозах 2 - 6 мг/кг достоверно задерживает развитие воспалительного отека по сравнению с контролем. Так, политрил в дозе 5 мг/кг достоверно угнетает развитие отека при лидокаиновом воспалении на 27%, при белковом - на 29,4%, а при каррагениновом - на 38,7% по сравнению с вольтареном. Таким образом, политрил в дозе 5 мг/кг обладает наиболее выраженным антифлогистическим действием по сравнению с вольтареном и не отмечены побочные эффекты при длительном его применении в различных дозах.
Изучение возможности модуляции антителогенеза политрилом проводилось на белых неинбридных мышах, которых иммунизировали внутрибрюшинным введением оптимальной дозы 2 108 эритроцитов барана. Как видно из данных табл. 1, политрил в различных дозах в течение 7 дней на фоне иммунизации приводил к достоверному увеличению
Таблица 1 - Влияние политрила на образование антителообразующих клеток
Соединение Доза, мг/кг Количество животных Число АОК 106 пле-ноцитов Р по сравнению с контролем
Политрил 2 8 6000,0±192,0 <0,001
Политрил 3 8 6200,0±223,0 0,001
Политрил 4 8 7249,3±337,0 0,001
Политрил 5 8 7360,3±315,0 0,001
Политрил 6 8 7250,4±296,0 0,001
ОМУ 25 8 1390,5±99,0 0,001
Байтрил 8 8 1285,0±101,0 0,001
Контроль - 8 710,5±66,0 -
количества антителообразующих клеток (АОК). Причём максимальная активность проявилась при дозе 5 мг/кг (в 10,4 раза больше по сравнению с контрольным значением и в 5,3 раза активнее оксиметилурацила, байтрила, которые рекомендованы в качестве ростостимулирующих средств для телят и цыплят).
Нами исследована эффективность политрила при гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), моделированной методом «лапки». Супрессия клеточного звена иммунитета, судя по реакции ГЗТ к динитрофторобензолу и к эритроцитам барана, по-видимому, связана с противовоспалительным действием изучаемого препарата. Изучалось влияние политрила на формирование ГЗТ к эритроцитам барана на мышах линии С57ВL и СВА в сравнении с действием оксиметилурацила. Политрил вводили внутрь в течение 7 дней до сенсибилизации. При этом отмечалась тенденция к угнетению реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей линии СВА аналогично оксиметилурацилу, как при профилактическом, так и при лечебном введении (табл. 2). Таким образом, политрил обладает иммунотропными свойствами, основным вектором этого эффекта является иммуностимулирующее действие первичного звена иммунитета. Максимального иммунотропного эффекта можно ожидать в дозе 5 мг/кг, и дальнейшее увеличение дозы политрила не приводит к дальнейшей стимуляции иммунной системы.
Таблица 2 - Влияние политрила на реакцию гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана у мышей линии СВА
Наименование соединения Доза мг/кг Количество животных Средний процент увеличения лапки Р
I серия - профилактическое действие
Политрил 5 8 12,3±1,2 <0,05
Политрил б 8 12,3±1,2 0,05
Оксиметилурацил 25 8 13,9±1,3 0,05
Байтрил 8 8 17,9±2,1 0,05
Контроль - 8 18,б±1,9 -
II серия - лечебное действие
Политрил 5 8 13,1±1,2 0,05
Политрил б 8 13,1±1,2 0,05
Оксиметилурацил 25 8 15,2±1,5 0,05
Байтрил 8 8 17,9±2,1 0,05
Контроль - 8 19,0±1,б -
Оценка возможного раздражающего или повреждающего действия на кожу и развитие контактного неаллергического дерматита для политрила показала следующее. Однократная аппликация 5%-ного раствора политрила на кожу мышей не вызвала гиперемию. При изучении повторного местного раздражающего действия на месте аппликации полит-рила наблюдалась эритема. Через три недели под влиянием политрила, кроме эритемы, отмечена сухость кожи. У животных после нанесения изучаемого соединения на слизистую оболочку глаза, обнаружено незначительное покраснение конъюнктивы, удерживающееся в течение 20 минут. Через 30 минут признаки раздражения слизистой оболочки конъюнктивы глаза отсутствовали у всех животных. Таким образом, местное раздражающее действие политрила на кожу и слизистые оболочки глаз при однократном и повторном воздействии выражено слабо.
У морских свинок, которым внутрикожно вводился политрил, после добавления красителя «синего Эванса» диаметр пятна в подкожной клетчатке был в два раза меньше, чем у контрольных. Это указывает на наличие десенсибилизирующих свойств у политрила.
Оценку действия политрила на эффекторную способность Т-лимфоцитов в реакции трансплантационного иммунитета осуществляли воспроизведением феномена «трансплантант против хозяина» (РТПХ) на белых беспородных крысах. Эта реакция происходит за счет включения двух субпопуляций лимфоцитов, предшественников Т-эффекторов РТПХ и Т-амплификаторов. Как результат реакции - происходит накопление зрелых Т-клеток. Увеличение количества клеток в лимфоидных органах, селезенке или лимфатических узлах происходит не только вследствие пролиферации введенных лимфоцитов, но и в результате размножения собственных клеток реципиента [17]. Анализ результатов показывает, что политрил (доза 5 мг/кг) положительно влияет на эффекторную способность Т-лимфоцитов в реакции трансплантационного иммунитета, на что указывает значительно больший средний индекс ретракции (5,40±0,54) по сравнению с оксиметилурацилом (4,87±0,40, доза 50 мг/кг).
При испытании политрила с помощью теста Salmonella/микросомы на разных штаммах ТА98, ТА1950, ТА100 во всех случаях были получены отрицательные результаты, демонстрирующие отсутствие мутагенных свойств. При сравнении числа ревертантов контрольных и опытных данных в каждом варианте не выявлено статистически достоверных различий между ними. Данные, характеризующие индукцию клеток с хромосомными абберациями, показывают, что при однократном введении политрила в дозе 500 мг/кг, а также в дозе 5 и 50 мг/кг в течение 5 дней не обнаружено достоверного увеличения хромосомных аббераций при разных экспозициях. Качественный спектр хромосомных нарушений в контрольных и опытных группах включали гены и одиночные фрагменты. Общие результаты цитогенетических исследований представлены тем, что в течение 5 дней статистически достоверных различий между контрольными и опытными данными установлены не были. Это указывает на отсутствие повреждающего влияния испытуемого соединения на хромосомы мышей линии С57В!.
В опытах по исследованию эмбриотоксического действия политрила на крысах установлено отсутствие эмбриотропного действия. Результаты исследований эмбриотокси-ческого действия исследуемых соединений на крысах представлены в таблице 3, из которых видно, что политрил не влияет на число желтых тел в яичнике, мест имплантации и резорбции в матке.
Основные показатели, характеризующие эмбриотропное действие препарата - пре-димплантационная смертность зигот, постимплантационная гибель эмбрионов и общая эмбриональная смертность у опытных животных, получавших препарат в исследуемых до-
Таблица 3 - Влияние политрила на эмбриогенез крыс
Наименование «Политрил», мг/кг Контроль
показателей 5 25 50
Число желтых тел беременности 13,7 ± 0,40 13,8 ± 0,75 14,5 ± 0,23 14,4 ± 0,42
Число мест имплантации 13,2 ± 0,35 13,2 ± 0,54 14,2 ± 0,20 13,0 ± 0,20
Число мест резорбций 0,4 ± 0,16 0,2 ± 0,14 0,3 ± 0,19 0,2 ± 0,18
Число живых плодов 12,7 ± 0,44 13,0 ± 0,62 12,8 ± 0,12 12,5 ± 0,28
Масса плода, мг 2185 ± 18,72 2344 ± 19,60 2180 ± 25,28 2175 ± 26,43
Длина плода, мм 28,7 ± 0,65 22,5 ± 0,38 31,5 ± 0,40 32,4 ± 0,34
Масса планцеты, мг 465 ± 12,24 480 ± 7,36 482 ± 17,29 479 ± 16, 42
Размер плаценты, мм 12,6 ± 0,35 13,0 ± 0,35 13,2 ± 0,35 11,9 ± 0,27
Плодо-планцентный коэффициент 0,20 0,21 0,23 0,22
Смертность предим-плантац.,% 4,9 ± 1,85 5,0 ± 0,81 3,2 ± 1,36 2,9 ± 1,29
Смертность постим-плантац.,% 3,0 ± 1,45 0,7 ± 0,82 2,8 ± 1,27 2,9 ± 1,28
Смертность общая эм-брион.,% 7,9 ± 2,39 5,7 ±1,95 6,1 ± 2,18 5,7 ± 1,90
Количество самок/самцов в помете 55,3/44,7 43,0/57,0 51,1/48,9 57,2/42,8
зах были в близких пределах с контрольными (Р<0,05). При микроскопическом наружном осмотре плодов и их плацент в опытных и контрольных группах изменений не обнаружено. При анатомическом исследовании внутренних органов и костной системы плодов дефектов развития не выявлено, что указывает на отсутствие эмбриотоксического действия. Различия в массе плодов, их длине, массе плацент, их диаметре и плодоплацентарных коэффициентах были не достоверны (Р>0,05). Длина участков окостенения в закладках исследуемых костей и позвонков в опытных и контрольных группах отличалась незначительно (Р<0,05). Соотношение числа самок и самцов в помете от самок, получавших испытуемый препарат, не отличалось от контроля. Установлено, что роды у опытных самок, получавших политрил, наступали, как правило, на 23-24 дни беременности. В те же сроки наступали роды и у контрольных самок. Численность помета у самок, получавших препарат, была такой же, как и в контроле. Крысята рождались живые, без внешних аномалий. Длина и масса опытных крысят мало отличались от контроля на протяжении всего периода исследований. Как в опытных группах, так и в контроле шерстный покров у крысят появлялся на 3-5 день, ушные раковины открывались на 4-5 день, резцы прорезывались на 8-9, открывание глаз происходило на 16-18 день.
Канцерогенная активность политрила исследована на аквариумных рыбках гуппи. В течение 8 недель эксперимента в контрольной группе умерло 6 голов рыб, во второй опытной - 3 головы, в третьей - 7 голов. Таким образом, сохранность поголовья за первые 8 недель эксперимента по группам составила 63,0%, 92,5% и 82,5% соответственно. В течение оставшегося срока наблюдения с 9 до 20 недель существенных различий между группами по сохранности поголовья рыб также не зарегистрировали. В контроле умерло 5 голов, во второй опытной группе - 5 голов, в третьей - 6 голов. Таким образом, сохранность рыб за период эксперимента и период последующего наблюдения за ними составила 72,5%, 80,0% и 67,5% соответственно. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии отрицательного влияния политрила на сохранность рыб. Отход рыб гуппи не был связан с каким - либо заболеванием, а происходил, по-видимому, в результате установления иерархических отношений во вновь образованном сообществе.
Все умершие рыбы подвергались тщательному осмотру, их препарировали с последующим гистологическим исследованием гепатопанкреаса с целью обнаружения очагов опухолевого роста. В конце 4,8 и 20 недель эксперимента по 10 голов рыб в каждой группе (5 самцов и 5 самок) помещали в раствор эфира, затем проводили вскрытие, с последующей макро - и микроскопией внутренних органов. Полученные результаты представлены в табл. 4. При патологоанатомическом вскрытии и макроскопическом исследовании рыбок гуппи установлено, что каких - либо патологических изменений в пищеводе, кишечнике и щитовидной железе не обнаружено. При исследовании гепатопанкреаса регистрировали крупно - и мелкокапельную жировую дистрофию почечной ткани и гораздо реже точечные некрозы, у которых центральная зона заполнена эозинофильной массой детрита, а в периферической части обнаруживается прослойка регенерирующие гепатоцитов. Как видно из данных, представленных в таблице 4, наибольшее число патологических изменений в печени - 4% от поголовья наблюдали в первой контрольной группе, во 2 опытных группах процент патологии составил 2,8 и 3,2% соответственно. Гепатоцеллюлярная карцинома была зарегистрирована лишь у одной особи из контрольной группы. Опухоль состояла из атипичных полиморфных клеток и была отграничена от окружающей ткани капсулой.
Полученные данные свидетельствуют о том, что патологические изменения печени рыб гуппи являются спонтанными. Индуцирование опухолевого роста под действием изучаемого препарата не происходило. В группах, где рыбы в составе корма получали полит-рил, патологические изменения в гепатопанкреасе были на 1,2 и 0,8% ниже, чем в контроле, а очагов опухолевого роста зарегистрировано не было. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии канцерогенной активности политрила.
Политрил обладает выраженной антибактериальной активностью. Антибактериальная активность политрила была проверена для музейных штаммов, а также полевых штаммов бактерий, изолированных от больных животных. Значения минимальных подавляющих концентраций политрила для полевых штаммов бактерий приведены в табл. 5. Как видно, политрил обладает значительной активностью по отношению к различным видам бактерий, в т.ч. к синегнойной палочке. Наиболее чувствительным микроорганизмом к тестируемому веществу оказался стафилококк, рост которого ингибировался при концентрации 0,19 мкг/мл.
Политрил был проверен на наличие у него химиотерапевтического действия на модели экспериментальной эшерихиозной септицемии. Результаты эксперимента отражены в табл. 6. Видно, что политрил обладает превентивными свойствами при заражении животных патогенной культурой кишечной палочки. В опытной группе гибели животных не зарегистрировано, в отличие от контрольной, где пало 6 мышей.
Таблица 4 - Результаты испытания канцерогенной активности политрила на рыбках гуппи
Периоды опыта, недели Группы Исследовано голов Патологические изменения в печени
Жировая дистрофия Точечный некроз Опухоли
1 10 1 - -
4 2 10 3 1 -
3 10 1 - -
1 1б 2 1 -
8 2 13 1 - -
3 17 2 - -
1 14 4 1 1
20 2 17 1 1 -
3 13 3 2 -
1 40 7 2 1
Итого: 2 40 5 2 -
3 40 б 2
Таблица 5 - Минимальная подавляющая концентрация (МПК) политрила для полевых штаммов бактерий
Штамм МПК препарата, мкг/мл
E.coli 510 < 0,19
S.aureus 509 0,39
P.aeruginosa 157 3,13
S.dublin 504 0,78
Таблица 6 - Превентивная активность политрила при колисепсисе (E.coli 510) у белых мышей
Группа Доза препарата Количество животных Пало Выжило
Опытная 5 мг/гол 12 - 12
Контрольная 0,4 мл дистиллированной воды 12 8 4
Таким образом, политрил обладает ярко выраженным антибактериальным действием, что делает его перспективным для использования в качестве антибактериального химиотерапевтического средства в ветеринарии и медицине.
Литература
1. Падейская Е.Н. Фторхинолоны ПЕ.Н. Падейская, В.П. Яковлев.- М.:«Биоинформ», 1995. 208 с.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Ч. I, Ч. II. М.: Новая волна, 1996. Ч. I. 731 с.; Ч. II. 685 с.
3. Падейская Е.Н. Антимикробная активность и механизм действия офлоксацина /Е.Н. Падейская, В.П. Яковлев //Антибиотики и химиотерапия. 1996. №9. С. 13-23.
4. Фассахова Л.Ф. Синтез, строение и биологическая активность 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1 -этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты (Политрила) /Л. Ф. Фассахова, Б.П. Струнин, Н.А. Фролова, П.А. Гуревич //Вестник Казанского технол. ун-та. 2006. № 2. С. 208-210.
5. Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных. - Рег. № ПВР-2-4.5/01547 от 6.02.2006 и № ПВР-2-4.5/01548 от 6.02.2006.
6. Ковалевский К.Л. Лабораторное животноводство. М.: Медецина, 1986. 324 с.
7. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина, 1970. 245 с.
8. Беленький М.П. Основные приемы статистической обработки результатов наблюдений в области физиологии. М.: «Медицина», 1963. 126с.
9. Аничков С.В. Фармакотерапия язвенной болезни /С.В. Аничков, И.С. Заводская. Л.: Медгиз, 1965. С. 30-51.
10. Тринус Ф.П. Нестероидные противовоспалительные средства /Ф.П. Тринус, Н.Ф. Мохорт, Б.М. Клебанов. Киев, 1975 С. 204-231.
11. Cunningham A.J., Crenberg A. Further unprovement in the plague, techigue for detecting single antybody forming cell //Immunology. 1987. V.2. P. 99-600.
12. Любимов Б.И. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств /Б.И. Любимов, М.И. Миронова. М., 1988. С. 3-18.
13. Ames B.N. Distinctive adjuvanticiti of analogs micobacterias water-soluble components //Cell. Im. 1973. Vol. 21. P. 243-246.
14. Wilson J. Embriological consideration in teratology methods administering agents and detecting malformations in experimental animals //Technigues. Univ. Chicago Press. 1965. P. 231-262.
15. Dawson A.B. Note on the staining of the sceletion cleared specimes with alizarin reds //Stain Tecnol. 1926. №1. P. 123-128.
16. Методы эксперементальной химиотерапии / Под ред. Г.Н. Першина. М.: Медецина, 1971. 426с.
17. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге /А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск: Наука, 1981. С. 256.
© Б. П. Струнин - д-р техн. наук, проф. каф. оборудования пищевых производств КГТУ; Л. Ф. Саттарова - соиск. каф. органической химии КГТУ; Л. К. Шарипова - Башкирский государственный аграрный университет (БГАУ); Н. А. Фролова - студ. КГТУ; С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. инженерной экологии КГТУ; А. Ф. Исмагилова - д-р биол. наук, проф. БГАУ; П. А. Гуревич - д-р хм. наук, проф. каф. органической химии КГТУ.
