CC BY
70
УДК 579.66:547.94
Л. Я. Калимуллина1, Н. И. Петухова1, О. В. Семенова1, Д.Г Ханнанова1, Ф. З. Галин2, В. В. Зорин1
Исследование микробиологической трансформации бетулина в эмульсиях
1 Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 43-19-35; е-та¡1: bio@rusoil.net 2Институт органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук 450054, Уфа, пр. Октября, 71, факс: (3472)35-52-88, е-таИ: galin@anrb.ru
Исследована трансформация бетулина в эмульсиях с помощью клеток микроорганизмов, выращенных на среде с углеводородом (тетрадека-ном) в качестве источника углерода. Показана способность водных суспензий микроорганизмов — трансформаторов бетулина эмульгировать хлороформ (1:1) с включением клеток в дисперсионную фазу. Обнаружено, что клетки, иммобилизованные в таких эмульсиях, проявляют невысокую трансформирующую активность с бетулином, растворенным в хлороформе (конверсия менее 20%). Более высокая активность для штамма Н-43 была выявлена при использовании в качестве растворителя метилэ-тилкетона (конверсия 38%).
Ключевые слова: микроорганизмы, биотрансформация, бетулин, эмульгирующая активность, биокатализ в эмульсиях, противораковая активность.
Продукты микробиологической трансформации бетулина, 3р-гидрокси-20(29)-лупа-ен-28-ола, (бетулиновая и бетулоновая кислоты, а также их гидроксилированные и секо-производные) обладают высокой противоопухолевой активностью 1-3, что обуславливает интерес к получению этих соединений биокаталитическими методами.
Вместе с тем, плохая растворимость три-терпеноидов в воде создает серьезную проблему для их трансформации с помощью биокатализаторов, как правило, более эффективно работающих в водных растворах. Несмотря на то, что показана принципиальная возможность трансформации бетулина в чистом органическом растворителе (хлороформе) с помощью клеток нескольких микроорганизмов, в большинстве случаев этот подход неприемлем в связи с высокой токсичностью для ферментов микроорганизмов органических растворителей, в которых растворяется бетулин 4. В тоже время в простых двухфазных системах буфер -хлороформ многие из найденных микроорганизмов осуществляют политрансформацию бе-тулина 4'5.
В последние годы в литературе появляются сведения о преимуществе ферментативного катализа в обращенных эмульсиях (вода в масле) с применением природных и синтетических эмульгаторов 6-8 перед катализом в простых двухфазных системах. Имеются также сообщения о возможности (перспективности, эффективности) использования клеток микроорганизмов, включенных в состав (прямых и обратных) эмульсий для трансформации липофильных соединений 9-12. При этом особое внимание заслуживает возможность использования для эмульгирования потенциала самого клеточного катализатора, поскольку известно, что многие микроорганизмы могут самостоятельно синтезировать вещества (эмульгаторы), образующие (стабилизирующие) прямые или обратные эмульсии 13. Более того, клетки микроорганизмов, обладающие гидрофобной поверхностью, могут непосредственно участвовать в образовании эмульсий 14.
В настоящей работе с целью интенсификации биотрансформации тритерпеноидов микроорганизмами была исследована эмульгирующая активность микроорганизмов, для которых ранее была выявлена способность осуществлять политрансформацию бетулина с образованием нескольких продуктов в буфере, содержащем 3% хлороформа 5.
В результате исследования эмульгирующей активности биомассы, выращенной на ага-ризованной среде с тетрадеканом, были выявлены штаммы, образующие прямые эмульсии хлороформа в воде при соотношении фаз 1:1 с индексом эмульгации более 50% (табл. 1). При этом наблюдалось полное эмульгирование органической фазы.
Было установлено также, что клетки большинства их этих микроорганизмов отличаются высокой гидрофобностью 14 15 и почти полностью включаются в эмульсию (более 90%).
Дата поступления 20.02.06
При микроскопировании препаратов эмульсий было обнаружено, что клетки микроорганизмов в эмульсиях частично распределяются внутри дисперсной водной фазы, а частично локализованы на поверхности диспергированной органической фазы. На микрофотографии эмульсии, стабилизированной биомассой штамма НХП-44, можно видеть адгезию бактериальных клеток на капле хлороформа, а также образование клеточных агрегатов (рис. 1).
Таблица 1
Индекс эмульгирующей активности (Е48) и степень включения клеток в эмульсию (Н)
при эмульгировании хлороформа Условия эмульгирования: сырая биомасса -50 мг; 0.1 М фосфатный буфер рН 7.0 - 1 мл; хлороформ - 1 мл; встряхивание - 2 мин
Штамм Е48, % Н, %
НС-331 71 97.3
НХП-44 59 99.6
НС-111-2 68 97.2
НС-Р1 65 97.9
НС-1322 65 98.8
НС-Р4 71 98.2
НС-Н11 68 97.3
БН-19 57 68.4
НС-В11 57 100
НС-П-13 75 97.8
УЗ-2б 52 96.5
НС-105 64 82.8
НС-Р5 76 97.2
НС-133/1 75 98.0
НС-3012 64 99.5
НС-1224 67 97.4
БН-6 51 67.7
БН-14 73 80.4
Н-43 74 96.8
НС-Ш-13 73 97.4
Ме-2-52 59 72.0
Было обнаружено, что емкость эмульсий, полученных на основе 1 мл суспензии клеток в буфера и 1 мл хлороформа, позволяет иммобилизовать и более 50 мг (сырой вес) биомассы исследуемых микроорганизмов. Так, при использовании для образования эмульсии суспензии клеток содержащей 200 мг/мл биомассы удается включить около 170 мг массы штамма НХП-44 (по сырому весу). Полученные результаты позволяют надеяться на возможность интенсификации процессов биотрансформации нерастворимых в водной среде природных соединений (к каковым относится бетулин) в диспергированном органическом растворителе (хлороформе), в котором растворяется бетулин, под действием микроорганизмов, иммобилизованных на поверхности органической фазы.
Однако при инкубировании клеток микроорганизмов, иммобилизованных в эмульсиях хлороформа в воде, в присутствии бетулина ощутимая конверсия этого соединения (более 5%) была обнаружена только в случае 7 штаммов (рис. 2).
18 16 14
\0
12 Н 10
& 8 и х о
И 4
6
Рис. 1. Микрофотография эмульсии хлороформа в воде, стабилизированной биомассой штамма НХП-44. Фазово-контрастная микроскопия, препарат «раздавленная капля»
2 0
Рис. 2. Трансформация бетулина клетками микроорганизмов в эмульсиях. Условия трансформации: стационарная эмульсия, биомасса — 50 мг/мл
Согласно имеющимся в литературе данным окислительная активность клеток микроорганизмов, включенных в эмульсию, зависит от их жизнеспособности 11. В связи с этим было предположено, что низкая конверсия бе-тулина в исследуемых эмульсиях может быть обусловлена токсическим действием хлороформа на исследуемые биокатализаторы.
С целью поиска менее токсичной органической фазы была исследована эмульгирующая активность клеток одного из наиболее активных штаммов
Н-43 в системах с различными полярными органическими растворителями бетулина, несмешивающимися с водой (бутанолом, мети-лэтилкетоном, циклогексаноном и циклопента-ноном). Кроме того, были протестированы смешанные растворители бетулина на основе смешивающихся с водой органических соединений (ацетона, этанола, изопропанола или диметилсульфоксида) и неполярного гидрофобного декана.
В результате исследования обнаружено, что суспензия клеток штамма Н-43 в буфере образует эмульсии со всеми тестируемыми растворителями (табл. 2).
Таблица 2
Конверсия бетулина, индекс эмульгирующей активности (Е48), степень включения клеток в эмульсию (Н) при эмульгировании различных органических растворителей, содержащих бетулин, суспензией клеток штамма Н-43 в буфере. Условия: стационарная эмульсия, биомасса - 50 мг/мл, концентрация бетулина -0.5 г/л, 0.1 М фосфатный буфер рН 7.0
Субстрат для эмульгирования ^ % Н, % Конверсия бетулина, %
Бутанол-1 69 95.8 5
Метилэтилкетон 68 96.0 38
Циклопентанон 70 94.7 15
Циклогексанон 73 94.7 10
Этилацетат 72 96.5 7
Этилацетоацетат 72 95.1 5
Декан-изопропанол 69 93.2 -
Декан-этанол 69 93.2 -
Декан-ацетон 69 93.2 -
Декан-ДМСО 69 93.2 -
Однако в процессе образовании эмульсий на основе смешанных органических растворителей, содержащих бетулин, наблюдается быстрая диффузия водорастворимого компонента в водную фазу, что снижает растворимость тритерпеноида в органической фазе и приводит к его кристаллизации. Это переводит субстрат в твердую форму, труднодоступную для биокатализаторов.
При трансформации бетулина клетками штамма Н-43, иммобилизованными в эмульсиях на основе индивидуальных растворителей, было обнаружено, что наиболее активно конвертируется субстрат в органических кетонах. Наилучшие результаты были получены для штамма Н-43 при использовании в качестве органической фазы метилэтилкетона. В этих условиях в течение суток превращается около 38% субстрата.
Полученные результаты показывают принципиальную возможность интенсификации биотрансформации бетулина клетками микроорганизмов в эмульсиях.
Экспериментальная часть
Микроорганизмы выращивали на твердой минеральной среде (рН 7.0-7.2) следующего состава (г/л): Na2HPO4-12H2O - 1.0; KH2PO4 - 0.6; MgSO4-7H2O; - 0.2; (NH4)2SO4 - 1.0; (NH4)2Mo04-2H20 - 0.002; FeSO4-7H2O -0.001; MnSO4-7H2O - 0.001; дрожжевой авто-лизат - 2г/л; пептон - 0.6 г/л; декан - 0.5%; агар-агар - 15. В качестве единственного источника углерода и энергии в питательную среду добавляли 1% тетрадекана.
Микроорганизмы культивировали в термостате в течение 3 сут. при 28-30 °С.
При определении эмульгирующей активности в качестве субстрата для эмульгирования использовали хлороформ. Суспензию клеток смешивали с эмульгируемым субстратом в соотношении 1:1 и встряхивали в течение 2 мин для образования эмульсии. Измерение индекса эмульгирования (Е48) определяли через 48 ч как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке и выражали в процентах.
Включение клеток в эмульсионный слой анализировали по разнице оптической плотности исходной суспензии микроорганизмов и остаточного водного слоя. Концентрацию биомассы микроорганизмов оценивали измерением оптической плотности клеточных суспензий на спектрофотометре «Specol-221» с нефело-метрической приставкой при l = 520 нм.
Трансформацию бетулина проводили в эмульсии в стационарных условиях при температуре 28 оС. Концентрация клеток в реакционной смеси составляла 50 мг сырой биомассы/мл; концентрация субстрата - 0.5 мг/мл.
Анализ процесса трансформации выполняли методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil» АФ-Ф-УФ, используя систему растворителей хлороформ-метанол в соотношении 38:1 (v/v). Пятна проявляли опрыскиванием свежеприготовленным раствором n-анисового альдегида: 100 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл анисового альдегида. Пропитанную реактивом пластинку нагревали при 90-110 оС в течение 3-5 мин.
Оценку уровня тритерпеноидов в экстрактах осуществляли путем сравнения площади и
интенсивности окраски пятен исследуемых
продуктов и стандартных образцов известной
концентрации 16.
Литература
1. Kouzi S.A., Chatterjee P., Pezzuto J.M., Hamann M.T. // J. Nat. Prod.- 2000.- Vol. 63, № 12.-P. 1653.
2. Chatterjee P., Kouzi S.A., Pezzuto J.M., Hamann M.T. // Appl. Environ. Microbiol.- 2000.-Vol.66, № 9.- P. 3850.
3. Akihiza T., Takamine Y., Yoshizumi K; Tokuda H., Kimura Yu., Ukiya M., Nakahara T., Yokochi T., Ichiishi E., Nishino H. // J. Nat. Prod.- 2002.- Vol. 65.- P.278.
4. Митрофанов Д.В. Разработка биокаталитических методовполучения бетулиновой кислоты из бетулина: Автореф. дис. канд. техн. наук. Казань, 2005.- 20 с.
5. Калимуллина Л.Я., Петухова Н.И., Флехтер О.Б., Галин Ф.З., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.- 2004.- Т.11, №1.- С. 48-51.
6. Tamatis H.S, Xenakis A., Kolisis F.N.// Biotechnol. Adv.- 1999.- Vol.17.- P. 293-318.
7. Rosche B., Breuer M., Hauer B., Rogers P.L. / / J. Biotechnol.- 2005.- Vol. 115.- P. 91-99.
8. Prichanout S., Leak D.J., Stuckey D.C. // Enzyme Microb. Technol.- 2000.- Vol. 27.-P. 134-142.
9. Prichanout S., Leak D.J., Stuckey D.C. // Colloids and Surfaces. A: Physicochemical and Engineering Aspects.- 2000.- Vol. 166.-P. 177-186.
10. Smolders A.J.J., Pinheiro H.M., Noronha P., Cabral J.M.S. // Biotech. Bioeng.- 1991.- Vol. 38.- P. 1210-1217.
11. Carla C.C.R. de Carvalho, M. Manuela R. da Fonseca. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic.-2002.- Vol. 19-20.- P. 389-398.
12. Fadnavis N. W., Prabhakar Reddy N., Bhalerao U. T. // J. Org. Chem.- 1978.- Vol. 43.-P. 3218-3221.
13. Елисеев C.A., Кучер P.B. Поверхностно-активные вещества и биотехнология.- Киев: Наукова думка, 1991.- 60 с.
14. Dorobantu L.S., Yeung A.K.C., Front Ju.M., Gray M.R. // Appl. Environ. Microbiol.-2004.- Vol. 70, №10. - P. 6333-6336.
15. Serebryakova E.V., Darmov I.V., Medvedev N.P., Alekseev S.M., Rybak S.I. // Microbiology.- 2002.- Vol.71, №2.- P. 202-204.
16. Ахрем A.A., Кузнецова А.И. Тонкослойная хроматография.- М.: Наука, 1965.- 176 с.
