CC BY
16
[РЕПАРАТЫ
ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОДНО-СОЛЕВЫХ ЭКСТРАКТОВ ИНСЕКТНЫХ АЛЛЕРГЕНОВ
Бержец В.М., Радикова О.В., Кропотова И.С., Хлгатян С.В.
Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, Москва
В статье представлены данные об аллергии к внутрижилищным насекомым. Аллергические реакции имеют полиморфный характер и развиваются при различных контактах с насекомыми: при соприкосновении с ними, вдыхании частиц тела насекомых или продуктов их жизнедеятельности, укусах или ужаливаниях насекомыми. Разработана технология получения новых препаратов водно-солевых экстрактов инсектных аллергенов и изучены их физико-химические и иммунобиологические свойства. Тестами анафилаксии, непрямой дегрануля-ции тучных клеток, твердофазным ИФА подтверждена специфическая сенсибилизирующая активность приготовленных препаратов, с помощью электрофореза изучен структурный состав экстрактов инсектных аллергенов.
Ключевые слова: инсектные аллергены, анафилаксия, иммуноферментный анализ ч_'
По данным многочисленных исследований распространенность аллергических заболеваний во всем мире постоянно увеличивается [5, 8, 13, 15]. Недооценка симптомов аллергических заболеваний и поздняя диагностика приводит к прогрессиро-ванию болезни, утяжелению его течения, ухудшению прогноза и инвалидизации населения. В ряде случаев формирование аллергических заболеваний происходит в условиях внутрижилищной среды. Этиологическая роль внутрижилищных аллергенов (Ал) в возникновении аллергических болезней очень важная. Наибольшую роль в этом играет домашняя пыль, которая является многофакторной по составу. Источниками Ал в составе домашней пыли могут быть и частицы насекомых, и продукты их жизнедеятельности. Синан-тропные виды насекомых широко распространены в окружающей среде человека, являясь не только показателем санитарного неблагополучия жилья и переносчиками возбудителей инфекций, но и продуцентами аллергенов [3]. Аллергические реакции, вызываемые насекомыми или продуктами их жизнедеятельности, называют инсектной аллергией (лат. шБесЮт — насекомое) [7].
Ал служат составные части яда или слюны насекомых, волоски или чешуйки, белки тела, которые могут попадать в организм при ужаливании, укусе, вдыхании, контакте с кожей, через рот с пищей [2, 6, 10].
Аллергические реакции, вызванные насекомыми, относятся к реагиновому типу, обусловленному присутствием в сыворотке крови больных специфических антител — реагинов, относящихся к 1д Е [1, 16].
Насекомые могут вызывать разнообразные по тяжести и клиническим проявлениям патологические ре-
акции — от легкого раздражения кожи до смертельного анафилактического шока [12, 14]. Аллергия к сина-нтропным членистоногим может протекать бессимптомно, в виде скрытой сенсибилизации и выявляться только при проведении специального аллергологичес-кого обследования. Более выраженная аллергическая реакция ксинантропным членистоногим проявляется в виде локальных кожных изменений, аллергического кератоконъюктивита, аллергического ринита, бронхиальной астмы [1,6, 10].
В настоящее время единственным патогенетическим методом лечения, позволяющим уменьшить гиперчувствительность организма к инсектным Ал, является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ). Для диагностики аллергических заболеваний и проведения АСИТ используются водно-солевые экстракты Ал. Быстрый рост заболеваемости атопией, вызванной ин-сектными Ал, ставит задачу расширения спектра диагностических и лечебных форм для создания панели препаратов инсектных Ал.
Материалы и методы
Нами были приготовлены экстракты Ал из 11 следующих насекомых: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Neuphoeta cinerea), муха комнатная (Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimex lectularis), муравей рыжый домовый (Monomorium pharaonis), паук домовый (Tegenaria derhami), кожеед (Attagenus Smirnovi Zhan), комар обыкновенный (Culex pipiens).
(Ц
2008 г.
Для получения препаратов использовали общепринятый для неинфекционных Ал метод водно-солевой экстракции активных компонентов сырья по A.Coca [11]. Получено и исследовано четыре серии препаратов А насекомых.
В препаратах инсектных Ал методом Несслера определяли количественное содержание белка в единицах белкового азота (PNU) [11]. При изучении специфической активности все препараты были уравнены в единицах белкового азота.
Изучение полученных препаратов инсектных Ал проводили в соответствии с требованиями Комитета МИБП Минздрава РФ и требованиями ВОЗ.
Изучение фракционного состава препаратов инсектных Ал проводили с помощью электрофореза в полиак-риламидном геле (ПААГ) методом Laemmli, используя вертикальную электрофорезную камеру.
Сенсибилизирующие свойства Ал изучали в опытах анафилаксии. В работе использовали 70 морских свинок (3-месячные самцы) весом 250-300 г. Животные были разделены на 10 групп по 6 в каждой и 10 морских свинок составляли контрольную группу. Для иммунизации морских свинок использовали нарастающие дозы водно-солевого экстракта Ал с неполным адъювантом Фрейн-да. В состав неполного адъюванта Фрейнда входили ар-лацел и вазелин в соотношении 2:3. Морских свинок сенсибилизировали дважды. Первую инъекцию проводили 50% экстрактами Ал (10 000 PNU) в неполном адъ-юванте Фрейнда подкожно в подушечки передних и задних лапок по 0,1 мл в каждую точку. Вторую — препаратами Ал с концентрацией белкового азота 10 000 PNU подкожно по 1,0 мл. Разрешающую дозу Ал вводили на 21 дн. после последней инъекции внутривенно.
Реакцию оценивали по выраженности анафилактического шока. Анафилактический индекс вычисляли по формуле Вейгла [9].
Специфическую активность инсектных Ал оценивали методом непрямой дегрануляции тучных клеток (НДТК) [11].
Методом твердофазного ИФА на полистероловых разборных планшетах фирмы «Полимер» (Россия) определяли специфические IgE-AT в крови больных к спектру полученных Ал насекомых. Полуколичественное содержание специфических IgE-AT оценивали в соответствии с оптической плотностью стандартов (стандарт «Полигност», Санкт-Петербург) в классах реакции ИФА [4].
Исследовали сыворотки крови 80 больных, страдающих атопической бронхиальной астмой легкой и средней степени тяжести с известной бытовой сенсибилизацией (к домашней пыли и клещам домашней пыли). В качестве контроля использовали сыворотки крови 20 больных поллинозом, у которых ранее не была выявлена бытовая сенсибилизация и не регистрировались симптомы инсектной аллергии.
Антигенность полученных экстрактов изучали, используя метод иммуноблота с определением Ig G-AT.
Результаты и обсуждение_
Используя метод водно-солевой экстракции A.Coca с последующей стерилизующей фильтрацией получена панель 11 препаратов инсектных Ал из вышеуказанных насекомых.
Все препараты обладали стабильными физико-химическими свойствами, были безвредны и стерильны.
Содержание белка в препаратах колебалось от 5800 до 10 800 PNU в зависимости от вида насекомого. Наиболее высокое содержание белка отмечено в препаратах Ал пепельного таракана, моли, кожееда, муравья.
Для выявления специфической активности — аллер-генности, антигенности, иммуногенности — полученных экстрактов использовали следующие методы: модель активной системной анафилаксии на морских свинках, непрямую дегрануляцию тучных клеток (НДТК), твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблот.
В опытах анафилаксии у большинства сенсибилизированных животных на внутривенные введения препаратов инсектных Ал отмечали положительные реакции. Результаты теста анафилаксии свидетельствуют о том, что более выраженной иммуногенной активностью обладают Ал рыжего таракана, моли, муравья и клопа (индекс 1,3-1,5), а слабовыраженной — препараты Ал паука и комара (индекс 0,8). Препараты Ал из американского таракана, пепельного, черного тараканов, мухи, кожееда имели средние промежуточные значения (индекс 1-1,1). Полученные данные подтверждают специфичность приготовленных препаратов инсектных Ал.
В тесте НДТК наибольшую дегрануляцию тучных клеток (44-48%) вызывали препараты Ал рыжего и черного тараканов, комнатной мухи и муравья, что указывает на высокую аллергенность приготовленных экстрактов. Более низкий процент дегрануляции тучных клеток (18-30%) отмечен при использовании препаратов аллергенов паука, пепельного таракана, кожееда. Полученные в данном тесте положительные результаты в целом говорят о высокой специфичности приготовленных препаратов инсектных Ал и наличии у них аллергенных свойств.
По результатам ИФА все больные имели полисенсибилизацию разной степени выраженности, но около 40% больных обладали повышенной чувствительностью к препаратам Ал рыжего таракана, черного таракана, американского и пепельного тараканов, 30% больных сенсибилизированы к Ал муравья, мухи и клопа, около 20% больных — к Ал комара, паука, моли, к Ал кожееда сенсибилизировано наименьшее число больных — 11%. В большей части сывороток уровни аллергенспецифичес-ких 1д Е-АТ регистрировались в 1 -2 классах реакции ИФА и очень мало сывороток содержали 1д Е-АТ, соответствующие уровню 4 класса реакции. Возможно, это связано с отсутствием прямых контактов с внутрижилищными насекомыми у большинства обследуемых больных, а также с длительной противовоспалительной (противо-астматической) терапией данной группы больных, которая могла оказать влияние на результаты теста.
В группе контроля только в двух из 20 исследуемых сывороток были обнаружены 1д Е-АТ к некоторым препаратам инсектных Ал, соответствующие 1-му классу реакции. В остальных образцах специфические 1д Е-АТ не были выявлены. Это объясняется тем, что больные контрольной группы страдали поллинозом, имели только пыльцевую сенсибилизацию и отрицали связь обострений основного заболевания с контактом с насекомыми.
Антигенность полученных экстрактов изучали, используя иммуноблот с определением 1дО-АТ. Результа-
Е)
ПРЕПАРАТЫ
ты иммуноблота оценивали по интенсивности окрашивания нитроцеллюлозной мембраны с помощью программы 1тадеОиап1. Выявлено, что девять из десяти сывороток имели положительную реакцию с разными препаратами инсектных Ал. Одна из десяти сывороток не прореагировала ни с одним из препаратов аллергенов (в том числе и с пыльцевым Ал).
Наиболее сильное окрашивание мембраны наблюдали в реакциях с препаратами Ал рыжего, черного, американского тараканов, мухи и муравья, показатели абсолютных значений превысили контроль в 2,5 раза и выше. Низкую реактивность в отношении 1дО-АТ отмечали у препаратов Ал, полученных из кожееда, клопа, паука.
Результаты электрофореза показали, что приготовленные препараты Ал из разных насекомых являются гетерогенными препаратами, состоящими из смеси различных белков, отличающихся по электрофорети-ческой подвижности.
Большая часть выделенных фракций инсектных Ал находится в диапазоне Мм от 45-60 кД и 20-30 кД. Эти фракции — общие для различных инсектных Ал обуславливают перекрестные реакции между разными видами насекомых и могут быть названы «паналлергена-ми». «Концепция паналлергии» заключается в том, что лица, чувствительные к одному виду членистоногих, могут иметь аллергическую реакцию к другим видам, что обусловлено наличием перекрестно-реагирующих Ал. Полученные результаты согласуются с данными литературы и подтверждают теорию «паналлергии» [2, 6].
При изучении аллергенных и иммуногенных свойств препаратов инсектных Ал установлено, что наибольшей активностью обладают препараты рыжего и черного тараканов, моли и муравья. Не обнаружено корреляции между содержанием белка в препаратах инсектных Ал и результатами проведенных опытов, что может свидетельствовать о том, что не все белки, определяемые в экстрактах, обладают аллергенными свойствами. Выявлено, что препараты из рыжего и черного тараканов обладают высокой специфической активностью, что подтверждено в тесте анафилаксии, НДТК, ИФА и им-муноблотом. Препараты аллергенов муравья и клопа также проявили высокие аллергенные и иммуногенные свойства, однако препарат Ал клопа оказался низкоантигенным при исследовании иммуноблотом.
Полученные результаты свидетельствуют о возможности дальнейшей разработки и последующего внедрения в медицинскую практику препаратов Ал насекомых для диагностики инсектной аллергии.
Выводы_
1. Разработана технология приготовления новых препаратов инсектных Ал и оценены их иммунобиологические свойства.
2. Получены водно-солевые экстракты инсектных Ал, обладающие специфической активностью, что подтверждено в опытах анафилаксии, тесте непрямой дегрануляции тучных клеток, методом твердофазного ИФА.
3. По результатам исследования наибольшей сенсибилизирующей активностью обладают препараты Ал рыжего таракана, черного таракана, моли и муравья.
4. Приготовленные препараты Ал в перспективе могут быть включены в диагностическую панель препаратов инсектных Ал, что позволит более точно выявлять у больного вид бытовой сенсибилизации и вносить коррективы в схему последующей специфической иммунотерапии.
Литература
1. Артомасова А.В.//Инсектная аллергия. В кн. Пыцкий В.И., Адрианова Н.В., Артомасова A.B. Аллергическое воспаление. — М., Медицина. — 1999. — С.162-187.
2. Гущин И.С., Читаева В.Г.//Аллергия к насекомым. — М., Фармарус-Принт. — 2003. — 327 с.
3. Жирова С.Н., Гервазиева В.Б.//Микробиология. — 2000. — № 3 — С. 66-69.
4. Жирова С.Н., Чикина Е.Ю., Гервазиева В.Б.// ЖМЭИ. — 2003. — № 6. — С. 63-65.
5. Ильина Н.И.//Российский аллергологический журнал. — 2004. — № 1. — С. 37-41.
6. Клиническая аллергология под ред. Хаитова P.M. — М., МедПресс-Информ. — 2002. — С. 6
7. Краткая медицинская энциклопедия. — Москва. — 1994.—T. 1.-С. 412.
8. МачарадзеД.Ш., Шанидзе М.А., Джишкариани И.Р, Беридзе В.Д., Чихладзе М.В., Сепиашвили РИ.//Астма. — 2005. — Т 6. — № 1 -2. — С. 11 -15.
9. Титова С.М.//«Аллергические реакции и методы реакции анафилаксии». Руководство по иммунологии. Под ред. ВязоваО.В.,ХоджаеваШ.Х. — М., Медицина. — 1973.-С. 369-375.
10. Федоскова Т.Г., Лусс Л.В.//Аллергология. — 1999. — № 4.— С. 11-12.
11. Фрадкин В.А.//Диагностические и лечебные аллергены. — М., Медицина. — 1990. — 256 с.
12. Bjoernsdottir U.S., Olafsson Е., Gislason D., Sigurethardottir S.T.//Laeknabladid. — 2003. —V. 89(12). — P. 933-940.
13. Chapman M.D., Heymann P.W., Sporik R.B.// Allergy. — 1995. —V. 50 (Suppl. 25). — P. 29-33.
14. Moffitt J.E.//South Med. J. — 2003. —V. 96(11). -P. 1073-1079.
15. Platts-Mills T.A.E., Sporik R.B., Chapman M.D., Heymann PW.//Allergy. — 1995. —V. 50 (Suppl. 22). — P 5-12.
16. Thomas A.E., Platts-Mills T.A.E.//Am. J. Respir. Crit. Care Medic.— 2001.—V. 164. — №8. —P. 1-55.
