CC BY
13
ПРЕПАРАТЫ
ГРАНУЛИРОВАННАЯ ЛЕЧЕБНАЯ ФОРМА АЛЛЕРГЕНА ИЗ КЛЕЩЕЙ РОДА ОЕЙМАТОРНАвОЮЕв
Вержец В.М„ Коренева Е.А* Петрова Н.С,Хлгатян С А, Емельянова О.Ю.
Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, Москва
В статье представлен способ приготовления гранулированной лечебной формы аллергена (Аг) из клещей Оегта^рИадо/^еБ Тагтае. Изложено доклиническое изучение физико-химических и иммунобиологических свойств экспериментального препарата. Показано, что разработанный Аг отвечает современным требованиям к лечебным формам Аг: он стабилен, безвреден, нетоксичен, проявляет специфическую активность и иммуногенные свойства и обладает сниженной аллергенностью.
Ключевые слова: клещевые аллергены, сублингвальная аллергенспецифическая иммунотерапия
Современные исследования по созданию новых лечебных форм Аг направлены на получение препаратов со сниженной аллергенностью и сохранением высоких иммуногенных свойств. Оптимизация аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) достигается также совершенствованием режима, схем и способов введения Аг в организм человека. Последнее время повышен интерес к использованию неинъекционных способов АСИТ. Выделяют интраназальный, суб-лингвальный, оральный, ингаляционный, а также комбинированные методы [2, 6]. Вышеуказанные способы АСИТ в значительной степени различаются по лечебному эффекту, удобству и безопасности применения. ВОЗ для широкой клинической практики у взрослых пациентов рекомендует только сублингвальный способ АСИТ [8]. К достоинствам метода можно отнести удобный режим и безболезненность лечения, минимизацию побочных реакций, исключение возможности инфицирования. Показана высокая эффективность сублинг-вального способа АСИТ для больных с пыльцевой и клещевой сенсибилизацией [2, 5].
При сублингвальном и оральном введении стандартные водно-солевые растворы Аг эффективны в дозах, в десятки раз превышающих дозы инъекционной АСИТ. Снизить аллергенное воздействие и сохранить терапевтический эффект позволяет использование специально приготовленных лечебных форм Аг. Разработано достаточно много видов подобных препаратов, но большинство из них предназначено для орального использования [6, 7]. Учитывая потребность в более широком использовании сублингвального метода АСИТ, нами было проведено исследование по получению специальной лечебной формы Аг для проведения АСИТ сублингвальным способом. Аг из клещей Оегта^-рЬ|адо1с1е8 Таппае (О. Таппае) выбран нами как один из наиболее распространенных бытовых сенсибилизирующих агентов.
Целью нашего исследования явилась разработка технологии приготовления лечебной формы Аг из клещей С. farinae, предназначенной для проведения АСИТ сублингвальным способом.
Материалы и методы
Для изготовления препарата был использован стандартный безфенольный водно-солевой экстракт Аг из клещей D. farinae. По своим свойствам он соответствует требованиям ФСП 42-3926-00, содержание белкового азота составляет 5000 PNU/мл. В качестве носителя аллергеного субстрата в экспериментальном препарате использована сахарная крупка, по химическому составу представляющая сахарозу, производства ОАО «Щелковский витаминный завод» (ТУ 64-5-61-88). Для проведения лабораторных тестов сформирован «банк» сывороток (Св) больных с сенсибилизацией к D. farinae. Он включает 22 Св, пять из которых — Св больных с моносенсибилизацией к D. farinae. В большинстве Св присутствуют антитела к домашней пыли и клещам D. pteronyssinus. Для проведения тестов in vitro отобраны Св с уровнем общего IgE не ниже 150 кЕ/л, специфического IgE к D. farinae 2-4 класса. Специфическую активность экспериментального препарата изучали в тесте непрямой дегрануляции тучных клеток (НДТК) и методом ИФА [1, 4]. Уровень общего IgE определяли методом ИФА с использованием наборов Laboratorien GMBH фирмы Dr. Fooke (Германия). Содержание ал-лергенспецифических IgE- и 1дС4-антител в Св крови измеряли методом твердофазного ИФА. Для выявления комплексов антиген/антитело использовали конъ-югаты моноклональных антител анти-lgE и анти-1дй4 человека («Полигност», Санкт-Петербург) и диагностические антитела против lgG(H+L) морских свинок («Медгамал», Москва), меченные пероксидазой хрена. Для выявления сорбции белка Аг из клещей D. farinae на
€
2008 г.
носителе применяли микроточечный иммуноблот (им-мунодот) [3]. В качестве конъюгатов использовали козьи антитела против иммуноглобулинов человека, специфические к Fcy-фрагментам, меченные щелочной фосфатазой (Jackson Immunoresearch, Weat Grove, PA). Безвредность препарата изучали на 20 белых мышах, хроническую токсичность — на 15 морских свинках. Иммуногенную активность изучали на иммунизированных морских свинках. Для патоморфологического исследования использовали биоптаты поджелудочной железы, сердца, легкого, печени, почек, селезенки животных. Все вышеописанные эксперименты проводились спустя 1,5 года после выпуска препарата.
Результаты и обсуждение_
На основе стандартного водно-солевого раствора Аг из клещей D. farinae разработана технология приготовления гранулированной лечебной формы в виде комплекта из восьми последовательных десятичных разведений Д1-Д8, нанесенных на сахарную крупку. На способ получения гранулированной формы получен патент № 2216353, зарегистрированный 20 ноября 2003 г. в Государственном реестре изобретений Российской Федерации.
Технологическая схема производства Аг включает следующие этапы: водно-солевую экстракцию раствора Аг из культуры клещей без использования фенола; центрифугирование аллергенного экстракта; стерилизующую фильтрацию маточного раствора Аг а из клещей D. farinae. Далее проводится последовательное десятичное разведение маточного раствора на 45%-м
растворе этанола и получение разведений с содержанием аллергенного субстрата с 101 по 108; нанесение полученных разведений на сахарную крупку, предварительно пропитанную этанолом; высушивание сахарной крупки с лекарственным субстратом до полного испарения этанола.
Гранулированная форма Аг из клещей О. farinae представляет собой набор из 8 отдельных порций однородных гранул правильной шаровидной формы белого цвета, без запаха, сладкого вкуса. Количество гранул в 1 г — 28-32 шт. Растворимость в слюне и в воде — не более 5 мин. Определение содержания белкового азота в гранулированной форме проведено расчетным путем, исходя из содержания белкового азота в водно-солевом Аг.
Для качественного определения наличия белка в экспериментальном препарате был использован микроточечный иммуноблот. Специфическая активность неинфекционных Аг напрямую зависит от содержания гликопротеидных комплексов с антителосвязывающей способностью. Следовательно, определяя методом иммунодота специфическую активность того или иного образца, можно оценить в нем уровень аллергенспеци-фичного белка и сравнить различные виды образцов по этому показателю. Сравнительная оценка специфической 1дЕ-связывающей активности гранулированной формы и стандартного Аг из клещей О. farinae проведена с использованием Св больных с моносенсибилизацией к 0.1аг\пае (специфический 1дЕ — 4 класса). Полученные данные обработаны денситометрически, что позволило по интенсивности окраски пятна каждого образца на нитроцеллюлозной мембране судить о со-
о О
3 4
о •
5 1
•
6
•
2
Рис. 1.
Схема микроточечного иммуноблота:
1 гранулированная форма Аг из клеща О. farinae (расчетная концентрация белка 1 мкг/мл);
2 стандартный водно-солевой раствор Аг из клеща О. farinae (расчетная концентрация белка — 1 мкг/мл);
3 разводящая жидкость с ТВИН-80;
4 цельный Аг кукурузы (7500 РШ/мл; 468,75 мкг/мл);
5 чистая сахарная крупка (20 гранул на 1 мл);
6 цельный Аг из клеща О. faг/>?ae (5000 Р1Ч11/1 мл; 312,5 мкг/мл).
Рис. 2.
Результаты сравнительного анализа показателей 1дС4-связывающей аллергенспецифической активности экспериментального препарата и стандартного водно-солевого аллергена из клеща О. farinae:
Д1-Д8 — разведения гранулированной формы аллергена О. farinae;
10 1-108 — разведения стандартного водно-солевого аллергена О. /аг/'пае.
[
БИО
ПРЕПАРАТЫ
Влияние гранулированной формы и водно-солевого аллергена из клеща О. farinae на дегрануляцию тучных клеток
Таблица
Форма Аг Содержание белка, мкг/мл Дегрануляция, %
Св больных, сенсибилизированных к Аг из клеща D. farinae, п = 10 Св больных, сенсибилизированных к пыльце злаков (контроль), п = 10
Гранулированная форма Д1 0,33 5,2± 1,0 3,8+0,6
1,0 8±0,15 4,2+0,9
Водно-солевой раствор 0,33 4,9±0,8 3,1+0,5
1,0 16±0,2 3,9±1,0
Чистая сахарная крупка - 2,6±0,6 2,8±0,6
держании в них белковых комплексов антиген-антитело (в условных единицах). Из рис. 1 видно, что пятна 1 и 2 (гранулированная форма и водно-солевой Аг из клещей О. farinae с расчетной концентрацией белка 1 мкг/мл) по интенсивности окраски не отличаются. Интенсивность окраски 4-го пятна (цельный Аг кукурузы) в 1,5-2 раза ниже интенсивности 1-го и 2-го пятен, что обусловлено отсутствием специфической реакции антиген-антитело. Можно сделать вывод, что в гранулированной форме Аг из клещей О. farinae действительно присутствуют специфически активные белковые структуры в том же количестве, что и в водно-солевом Аг.
Методами НДТК и ИФА был проведен сравнительный анализ аллергенных свойств (специфической активности в отношении 1дЕ) гранулированной формы Аг из клещей О. farinae и стандартного водно-солевого раствора Аг. Установлено, что гранулированная форма и водно-солевой раствор Аг в концентрациях ~0,33 мкг/мл вызывают дегрануляцию тучных клеток на спонтанном уровне (соответственно, 5,2% и 4,9%). При повышении концентрации белка в исследуемых препаратах до ~1 мкг/мл процент дегрануляции повысился незначительно и составил для гранулированной формы — 8%, для водно-солевого раствора Аг — 16% (таблица).
В реакции НДТК экспериментальный препарат был использован в максимальной концентрации, проявив при этом низкую аллергенную активность. Следовательно, можно ожидать снижение показателей аллер-генности и на высоких разведениях гранулированной формы (Д2-Д8). Данное утверждение доказано методом ИФА. Во всех разведениях гранулированная форма Аг из клещей О. ¿аппае вызывает связывание специфических 1дЕ-антител на уровне 0-1 класса, что не превышает показателей реакции ИФА с неспецифической Св. Специфическая активность в отношении 1дЭ4 изучена методом ИФА. При взаимодействии гранулированной формы Аг из клещей О. farinae со специфическими Св уровень связывания специфических 1д04-антител в 2,8-3,5 раза выше, чем в реакции с неспецифическими сыворотками (р < 0,01). При равном содержании аллергенного субстрата, по специфической активности гранулированная форма не уступает водно-солевому раствору Аг из клещей (рис. 2).
Безвредность, токсичность, а также иммуногенная активность гранулированной формы Аг из клещей
О. farinae были изучены на лабораторных животных. Испытание на безвредность показало, что употребление в пищу в течение 5 дн. препарата в дозе, равной максимальной лечебной для взрослого человека, не нанесло животным вреда и не нарушило их жизнедеятельность.
Для исследования хронической токсичности гранулированной формы Аг из клещей О. /аг/пае, а также его иммуногенных свойств проведена иммунизация морских свинок по следующей схеме: основная группа получала препарат ежедневно перорально по 7 гранул с разведения Д8 по Д1, каждое разведение в течение 7 дн. Контрольная группа животных по аналогичной схеме получала чистую сахарную крупку. Продолжительность курса составила 60 дн.
Внешних признаков нарастающей интоксикации (потери массы тела, адинамии, появления парезов и параличей, гибели животного) ни в основной, ни в контрольной группах отмечено не было. Макроскопический осмотр внутренних органов животных не выявил признаков токсического поражения (жировой дистрофии печени, диапедезных кровоизлияний и инфарктов внутренних органов, язвенных поражений желудочно-кишечного тракта и т.п.). Микроскопическое исследование биоптатов органов лабораторных животных также не выявило признаков дистрофии, микроинфарктов и токсического перерождения тканей. Образцы тканей органов животных основной группы отличает лимфоид-но-клеточная инфильтрация с примесью плазматических клеток. Отмечено также небольшое расширение сосудов микроциркуляторного русла с миграцией клеток лимфоидного ряда в периваскулярные отделы. Подобные изменения в органах и тканях описаны в литературе как характерные признаки активации иммунной системы при проведении АСИТ [2].
Изучение иммуногенных свойств гранулированной формы ал из клещей О. farinae проведено методом ИФА с использованием Св крови иммунизированных морских свинок. В Св животных, иммунизированных экспериментальным препаратом, по декременту оптической плотности отмечено статистически достоверное повышение уровня специфических 1дО-антител в сравнении с контрольной группой (р < 0,01). Следовательно, экспериментальный препарат обладает имму-ногенной активностью при введении в организм подопытных животных.
