CC BY
71
48
e
Оригинальная статья
О.В. Радикова, И.С. Кропотова, С.В. Хлгатян, Н.С. Петрова, В.М. Бержец
Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва
Исследование иммунобиологических свойств полученных водно-солевых экстрактов инсектных аллергенов
С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ НЕПРЯМОЙ ДЕГРАНУЛЯЦИИ ТУЧНЫХ КЛЕТОК (НДТК), ТЕСТА АНАФИЛАКСИИ, ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ОЦЕНИВАЛИ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЛУЧЕННЫХ БЫТОВЫХ ИНСЕКТНЫХ АЛЛЕРГЕНОВ. БЫЛИ ИСПОЛЬЗОВАНЫ СЫВОРОТКИ 20 БОЛЬНЫХ, СТРАДАЮЩИХ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ ЛЕГКОЙ И СРЕДНЕЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ, ИМЕЮЩИХ БЫТОВУЮ СЕНСИБИЛИЗАЦИЮ. СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ОБЛАДАЛИ ВСЕ ПОЛУЧЕННЫЕ ВОДНО-СОЛЕВЫЕ ЭКСТРАКТЫ НАСЕКОМЫХ (ТАРАКАН РЫЖИЙ, ТАРАКАН ЧЕРНЫЙ, ТАРАКАН АМЕРИКАНСКИЙ, ТАРАКАН ПЕПЕЛЬНЫЙ, СВЕРЧОК, МУХА, МОЛЬ, МАЛЫЙ МУЧНОЙ ХРУЩАК, РИСОВЫЙ ДОЛГОНОСИК, АМБАРНЫЙ ДОЛГОНОСИК). МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА БЫЛИ ВЫЯВЛЕНЫ БОЛЕЕ ВЫРАЖЕННЫЕ АЛЛЕРГЕННЫЕ СВОЙСТВА У ПРЕПАРАТОВ АЛЛЕРГЕНОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РЫЖЕГО И ЧЕРНОГО ТАРАКАНОВ, МУХИ И МОЛИ.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ИНСЕКТНЫЕ АЛЛЕРГЕНЫ, АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ, ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АЛЛЕРГЕННЫХ ЭКСТРАКТОВ, ^-АНТИТЕЛА.
Контактная информация:
Бержец Валентина Михайловна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией по разработке аллергенов ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Адрес: 105064, Москва,
Малый Казенный переулок, д. 5а, тел. 917-52-64
Статья поступила 17.01.2008 г., принята к печати 14.08.2008 г.
Проблема аллергии за последние десятилетия превратилась в глобальную медико-социальную проблему современности. Рост аллергических болезней объясняется такими факторами как загрязнение окружающей среды, увеличение экспозиции и спектра аллергенов, неблагоприятные социальные условия, изменение качества питания [1]. Население городов, особенно дети, значительную часть жизни проводят в помещениях. Поэтому особый интерес представляют различные организмы, обитающие в жилище человека. Эта группа насекомых входит в класс Insecta и принадлежат к разным отрядам и семействам: Blattoptera (тараканы) Culicidae (комары), Diptera (Musca domestica — домашняя мушка), Cimicidae (постельные клопы), Formicoidae (муравьи), Gryllidae (сверчки), Dermistidae (кожееды), Aphaniptera (блохи), Tineidae (моль) и др.
Аллергические реакции, вызываемые насекомыми или продуктами их жизнедеятельности, называют инсектной аллергией (лат. Insectum — насекомое) [2]. В структуре аллергопатологии инсектная аллергия составляет от 0,5 до 3,5% [3].
Аллергические реакции могут возникать при соприкосновении с насекомыми, вдыхании частиц тела насекомых или продуктов их жизнедеятельности, а также при укусах и ужалениях [4]. Необычайное разнообразие видов насекомых
O.V. Radikova, I.S. Kropotova, S.V. Hlgatyan,
N.S. Petrova, V.M. Berzhets
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serum, RAMS, Moscow
Studying immunobiological features of prepared water-salt extracts of insect allergens
THROUGH THE INDIRECT DEGRANULATION OF MAST CELLS, ANAPHYLAXIS TEST, SOLID-PHASE IMMUNE-ENZYME ANALYSIS, THE RESEARCHERS EVALUATED THE IMMUNOBIOLOGICAL FEATURES OF SERUM OF 20 PATIENTS SUFFERING FROM ATOPIC MILD AND MODERATE BRONCHIAL ASTHMA WITH DOMESTIC SENSITIZATION. ALL RECEIVED WATER-SALT EXTRACTS OF INSECTS (COCKROACH, BLACK-BEETLE, AMERICAN COCKROACH, ASH-GRAY COCKROACH, CRICKET, FLY, MOTH, MEALWORM, WEEVIL, BILLBUG) DEMONSTRATED SPECIFIC ACTIVITY. AN IMMUNE-ENZYME ANALYSIS HAS REVEALED MORE INTENSIVE ALLERGIC FEATURES OF SUBSTANCES EXTRACTED FROM BLACK-BEETLE, COCKROACH, FLY AND MOTH. KEY WORDS: INSECT ALLERGENS, ALLERGEN-SPECIFIC IMMUNOTHERAPY, IMMUNOBIOLOGICAL FEATURES OF ALLERGIC EXTRACTS, IgE-ANTI-BODIES.
-Є-
и широкий спектр способов сенсибилизации ставят задачу более подробного изучения их сенсибилизирующих свойств и влияния на здоровье человека [5].
Для диагностики аллергических заболеваний и проведения аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) в настоящее время используются водно-солевые экстракты аллергенов. Рост заболеваемости атопией, вызванной инсектными аллергенами, и отсутствие широкого спектра диагностических и лечебных средств ставит задачу создания панели инсектных препаратов аллергенов, необходимых для своевременной диагностики и специфического лечения аллергических болезней, вызванных сенсибилизацией к синантропным насекомым.
Цель настоящего исследования состояла в разработке технологии получения новых препаратов водно-солевых экстрактов инсектных аллергенов и изучении их физикохимических и иммунобиологических свойств.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Нами были приготовлены экстракты аллергенов по методу Coca из десяти следующих насекомых: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Neuphoeta cinerea), сверчок (Gryllus grillus), муха (Musca domestica), моль (Tinea pelionella), малый мучной хрущак (Tenebrio molitor), рисовый долгоносик (Sitophilus oryzae), амбарный долгоносик (Sitophilus granarius) [6].
Методом Несслера определяли количественное содержание белка в единицах белкового азота (PNU) для полученных препаратов инсектных аллергенов [6].
В опытах анафилаксии изучали сенсибилизирующие свойства полученных аллергенов. В работе использовали 70 морских свинок (3-месячных самцов-альбиносов) весом 250-300 г. Животные предварительно были разделены на 10 групп по 6 в каждой и 10 морских свинок составляли контрольную группу. Для иммунизации морских свинок использовали нарастающие дозы водно-солевого экстракта аллергена с неполным адъювантом Фрейнда. После введения на 21 день разрешающей дозы аллергена реакцию оценивали по выраженности анафилактического шока у морских свинок. Анафилактический индекс вычисляли по формуле Вейгла [7].
Специфическую активность полученных инсектных аллергенов оценивали методом непрямой дегрануляции тучных клеток (НДТК) [6]. Методом твердофазного иммуноферме-нтного анализа (ИФА) определяли специфические IgE-антитела в крови больных к спектру полученных аллергенов насекомых (пепельный таракан, черный таракан, рыжий таракан, американский таракан, сверчок, моль, домашняя муха, рисовой долгоносик, амбарный долгоносик, малый мучной хрущак) [6, 8]. Использовали сыворотки крови 20 больных, страдающих атопической бронхиальной астмой с известной бытовой сенсибилизацией (к домашней пыли и клещам домашней пыли) и состоящих на диспансерном учете у врача-аллерголога городской детской поликлиники г. Реутова. Уровень специфических IgE-антител оценивали в условных единицах и классифицировали по классам от 0 до 4-го: 0 класс — до 0,2; 1 класс —
0,201-0,4; 2 класс — 0,401-0,6; 3 класс — 0,601-0,9; 4 класс — выше 0,9 усл. ед.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Нами разработана технология получения экстрактов аллергенов из десяти следующих насекомых: таракан рыжий
(Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Neuphoeta cinerea), сверчок (Gryllus grillus), муха (Musca domestica), моль (Tinea pelionella), малый мучной хрущак (Tenebrio molitor), рисовый долгоносик (Sitophilus oryzae), амбарный долгоносик (Sitophilus granarius).
Методом Несслера в водно-солевых экстрактах аллергенов определено количественное содержание белкового азота (табл. 1). Наиболее высокое содержание белкового азота было обнаружено в препаратах из моли, рисового долгоносика и пепельного таракана.
Для выявления специфической активности полученных экстрактов использовали метод НДТК.
В тесте НДТК использовали 15 сывороток больных атопической бронхиальной астмой легкой и средней степени тяжести с сенсибилизацией к домашней пыли и клещам домашней пыли. Спонтанная дегрануляция тучных клеток не превышала 5%. В качестве контроля определяли дегрануляцию тучных клеток, обработанных полученными инсектными аллергенами. Она составила 5-7%.
Как видно из табл. 2, наиболее выраженная дегрануляция тучных клеток обнаружилась при использовании препара-
49
Таблица 1. Содержание белка в приготовленных препаратах аллергенов насекомых
Препарат инсектных аллергенов Содержание белка (PNU)
Пепельный таракан 1Q QQQ
Рыжий таракан 56QQ
Черный таракан 58QQ
Американский таракан 35QQ
Сверчок 83QQ
Малый мучной хрущак 7QQQ
Рисовый долгоносик 14 QQQ
Моль 25 QQQ
Амбарный долгоносик 14QQ
Домашняя муха 6QQQ
Таблица 2. Оценка активности препаратов аллергенов насекомых в тесте непрямой дегрануляции тучных клеток
Препарат инсектных аллергенов Дегранулированные тучные клетки (%)
Пепельный таракан 29
Рыжий таракан 45
Черный таракан 48
Американский таракан 37
Сверчок 21
Малый мучной хрущак 25
Рисовый долгоносик 4Q
Моль 32
Амбарный долгоносик 34
Домашняя муха 44
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ/ 2008/ ТОМ 5/ № 5
Таблица 3. Выраженность анафилактического шока у морских свинок в ответ на сенсибилизацию разными видами инсектных аллергенов
R
J
I-
(П
н
о
ОС
(П
а
О
Инсектный аллерген Индекс Вейгла
Пепельный таракан 1,1
Рыжий таракан 1,5
Черный таракан 1
Американский таракан 1
Сверчок 0,6
Малый мучной хрущак 1
Рисовый долгоносик 1,3
Моль 1,3
Амбарный долгоносик 1,1
Домашняя муха 1,1
тов аллергенов черного и рыжего тараканов, рисового долгоносика и мухи.
Сенсибилизирующие свойства полученных препаратов изучали методом анафилаксии на морских свинках, результаты представлены в табл. 3.
В таблице показано, что аллергены из американского таракана, сверчка, малого мучного хрущака имели сла-бовыраженные сенсибилизирующее свойства (индекс Вейгла 0,6-1), в то время как аллерген из рыжего таракана, моли и рисового долгоносика обладал выраженными сенсибилизирующими свойствами. Для всех других инсектных аллергенов индекс Вейгла колебался в пределах 1-1,3.
Методом ИФА проводили оценку уровня специфических IgE-антител в сыворотках исследуемых больных, используя полученные экстракты инсектных аллергенов. По результатам проведенного ИФА все больные имели полисенсибилизацию разной степени выраженности. Результаты, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что около 30% больных имеют сенсибилизацию к препаратам аллергенов рыжего таракана, черного
таракана и моли, а менее 8% больных — к американскому таракану, амбарному долгоносику, малому мучному хрущаку.
Помимо вышеуказанных инсектных аллергенов нами были приготовлены экспериментальные серии водно-солевых экстрактов аллергенов из клопа постельного (Cimex lectularis), муравья рыжего домового (Monomorium pharaonis), паука домового (Tegenaria derhami), комара обыкновенного (Culex pipiens). Сенсибилизирующие свойства данных препаратов изучали методом твердофазного ИФА, для чего использовали сыворотки крови 24 больных бронхиальной астмой с бытовой сенсибилизацией. Все больные имели сенсибилизацию к разным видам насекомых, но более 75% больных обладали повышенной чувствительностью к препаратам аллергена клопа и муравья.
Причиной аллергических реакций наиболее часто являются бытовые аллергены, к которым относят домашнюю пыль и клещей домашней пыли. Однако в последнее время приобретают значение и такие источники аллергенов как синантропные членистоногие, обитающие в жилище человека. К ним относятся тараканы, постельные клопы, моль, мухи, комары, муравьи и другие насекомые. Необычайное разнообразие видов насекомых и широкий спектр способов сенсибилизации ставят задачу более подробного изучения их сенсибилизирующих свойств и влияния на здоровье человека [5].
В литературе описываются случаи возникновения аллергических реакций у людей, контактировавших с тараканами, молью, мухой, сверчком, рисовым и амбарным долгоносиками, малым мучным хрущаком [4, 5, 9-12]. Установлено, что в теле взрослых особей наиболее выраженной аллергенной активностью обладают ткани головы и груди, а также секрет слюнных желез [14]. Повышенная чувствительность к синантропным членистоногим может проявляться симптомами аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, бронхиальной астмы, атопического дерматита, крапивницы, и, как правило, имеет круглогодичное течение [4, 5, 9, 11]. Нами были получены водно-солевые экстракты аллергенов из синантропных насекомых. Тестами анафилаксии, непрямой дегрануляции тучных клеток, твердофазным
50
Таблица 4. Результаты иммуноферментного анализа
Инсектный аллерген Количество больных
С класс 1 класс 2 класс 3 класс 4 класс
Таракан пепельный 19 - - 1 -
Рыжий таракан 15 - 3 2 -
Черный таракан 14 3 3 - -
Американский таракан 18 2 - - -
Сверчок 17 1 2 - -
Малый мучной хрущак 18 1 1 - -
Рисовый долгоносик 17 2 1 - -
Моль 15 1 2 2 -
Амбарный долгоносик 18 1 1 - -
Муха 17 1 2 - -
ИФА подтверждена их специфическая сенсибилизирующая активность.
Препараты аллергенов рыжего таракана и рисового долгоносика, а также домашней мухи и черного таракана вызывают наибольшую дегрануляцию тучных клеток в тесте НДТК, что указывает на высокую аллергенность приготовленных экстрактов. Более низкий процент дегранулиро-ванных тучных клеток отмечается при использовании препаратов аллергенов сверчка, малого мучного хрущака и пепельного таракана. Нами не обнаружена корреляция между содержанием белка в приготовленных препаратах инсектных аллергенов и числом дегранулированных клеток в представленном тесте НДТК, что, вероятно, свидетельствует о том, что не все белки, определяемые в экстрактах, обладают аллергенными свойствами. Результаты теста анафилаксии с полученными препаратами инсектных аллергенов из рыжего, пепельного, черного и американского тараканов, сверчка, моли, домашней мухи, малого мучного хрущака, амбарного и рисового долгоносиков свидетельствуют о том, что более выраженными сенсибилизирующими свойствами обладают аллергены рыжего таракана, моли и рисового долгоносика, а слабо-выраженными — препараты аллергенов сверчка, американского таракана и малого мучного хрущака. Обнаруженная нами специфическая активность экстрактов инсектных аллергенов отмечена и в работах других авторов [5, 11, 13, 14].
Известно, что тараканы являются не менее мощным ал-лергизирующим фактором для больных бронхиальной астмой, чем клещи домашней пыли [4, 14, 15]. Согласно литературным данным, положительные внутрикожные тесты, кожные реакции с экстрактами разных насекомых регистрируются у больных атопической бронхиаль-
ной астмой в довольно большом проценте случаев [5, 14, 15]. В лаборатории аллергодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова был проведен ИФА с сыворотками крови 20 детей, страдающих атопической бронхиальной астмой, легкой и средней степени тяжести, состоящих на диспансерном учете у врача-аллерголо-га городской детской поликлиники г. Реутова. С помощью ИФА мы определили, что около 30% обследуемых детей имеют повышенную чувствительность к препаратам аллергенов рыжего таракана, черного таракана и моли. Возможно, это связано с повсеместной распространенностью в средней полосе России данных насекомых в жилищах человека и наличием высокой степени их перекрестной чувствительности с аллергенами клещей домашней пыли и других насекомых.
Таким образом, нами была разработана технология приготовления новых препаратов инсектных аллергенов и оценены их иммунобиологические свойства; получены водно-солевые экстракты инсектных аллергенов, обладающие специфической активностью, что подтверждено нами в опытах анафилаксии, тесте непрямой дегрануляции тучных клеток, методом твердофазного ИФА. Полученные результаты позволили нам сделать следующие выводы:
1. Наибольшей сенсибилизирующей активностью обладают препараты аллергенов рыжего таракана, черного таракана и моли.
2. Приготовленные нами препараты аллергенов могут быть в дальнейшем включены в диагностическую панель инсектных аллергенов, что позволит более точно выявить у больного вид бытовой сенсибилизации и внести коррективы в схему последующей специфической иммунотерапии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ильина Н.И. Эпидемия аллергии — в чем причины? // Российский аллергологический журнал. — 2004. — № 1. — С. 37-41.
2. Краткая медицинская энциклопедия. — М.: Советская энциклопедия, 1994. — Т. 1. — С. 412.
3. Хаитов РМ., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. — М.: ВНИРО, 1995. — С. 180.
4. Федоскова Т.Г., Лусс Л.В. Аллергия к домашней пыли и внутри-жилищные инсектные аллергены // Аллергология. — 1999. — № 4. — С. 11-12.
5. Гущин И.С., Читаева В.Г. Аллергия к насекомым. — М., 2003. — С. 327.
6. Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены. — М.: Медицина, 1990. — С. 256.
7. Титова С.М. Аллергические реакции и методы реакции анафилаксии. Руководство по иммунологии / Под ред. Вязова О.В., Ходжаева Ш.Х. — М.: Медицина, 1973. — С. 369-375.
8. Федоскова Т.Г., Ильина Н.И., Лусс Л.В. Принципы диагностики аллергических заболеваний // Consilium Medicum. — 2002. — Т. 4, № 4. — С. 13-19.
9. Юхтина Н.В., Ляпунов А.В., Рылеева И.В. Инсектная аллергия у детей // Вопросы современной педиатрии. — 2003. — Т. 2, № 3. — С. 92-94.
10. Chapman M.D., Heymann PW., Sporik R.B. Monitoring allergen exposure in asthma new treatment strategiens // Allergy. — 1995. — № 50. — P 25-29.
11. Platts-Mills T.A.E., Sporik R.B., Chapman M.D., Heymann PW. The role of indoor allergens in asthma // Allergy. — 1995. — № 50 (Suppl. 22). — P. 5-12.
12. Schroekenstein D.C., Meier-Davis S., Bush R.K. Occupation sensitivity to Tenebrio molitor Linnaeus // J. Allergy Clin. Immunol. — 1990. — V. 86. — P 182-188.
13. Wahl R., Fraedrich J. Occupational allergy to housefly (Musca domestica) // Allergy. — 1997. — V. 52. — P 236-238.
14. Клиническая аллергология / Под ред. Хаитова РМ. — М., 2002. — С. 376-381.
15. Бержец В.М., Петрова Н.С., Барашкина О.Ф. и др. Роль тараканов Blatella germanica в развитии атопической бронхиальной астмы // ЖМЭИ. — 2001. — № 4. — С. 43-46.
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ/ 2008/ ТОМ 5/ № 5
