CC BY
44
УДК 576.856.25:591.41.421
С.Е. Ткачев, H.H. Ливанова, С.Г.Ливанов
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА СИБИРСКОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТИПА, ВЫЯВЛЕННОГО В КЛЕЩАХ IXODES PERSULCATUS НА СЕВЕРНОМ УРАЛЕ В 2006 ГОДУ
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск
Целью данной работы являлось выявление и молекулярно-генетический анализ фрагментов геномов вируса клещевого энцефалита в образцах клещей I. persulcatus, собранных на Урале близ северной границы их обитания в 2006 г. Методами обратной транскрипции с последующими двухраундовой ПЦР с праймерами, соответствующими высококонсервативным участкам фрагментов генов Е и NS1 ВКЭ, и секвенированием было выявлено 4 последовательности фрагментов генома ВКЭ (номера в базах данных GenBank EF405880-EF405883), обладающих высоким уровнем сходства (от 93 до 97% гомологии) с штаммами Заусаев (образец Урал2006-9) и Васильченко (образцы Урал2006-31, Урал2006-95 и Урал2006-97). Однако стопроцентной гомологии ни с одной из последовательностей геномов флавивирусов, находящихся в ртастоящее время в базах данных GenBank, не выявлено.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, молекулярно-генетический анализ, Северный Урал
Известно, что клещи рода Ixodes переносят множество вирусных, бактериальных и протозой-ных инфекционных агентов. Одним из опасных патогенов человека является вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), очаги которого находятся на обширной территории южной части лесной зоны внетропической Евразии от Атлантического до Тихого океанов. На территории России расположена основная по протяженности и площади часть ареала возбудителя КЭ, страна занимает первое место в мире по числу случаев заболевания, причем один из самых высоких показателей заболеваемости характерен для юга лесной зоны Сибири и Дальнего Востока.
Вследствие своего географического положения Урал интересен в плане изучения генетического разнообразия ВКЭ. Также следует отметить, что основная масса исследований в России выполнена в регионах, где условия обитания I. persulcatus близки к оптимальным [1, 2, 3], в то время как исследования ВКЭ на северном пределе устойчивого обитания таежных клещей, насколько нам известно, не проводились.
Для ВКЭ известны 3 генетических типа: дальневосточный, сибирский и западноевропейский. Деление вируса на генетические типы с привязкой к географическому месту выделения изоля-тов и штаммов ВКЭ является условным, так как в различных регионах встречаются различные ге-
нетические типы ВКЭ, причем в одном и том же регионе возможно выявление нескольких генотипов вируса. Так, например, в западносибирском регионе описаны штаммы вируса, относящиеся как к сибирскому, так и к дальневосточному генетическим типам, которые могут обусловливать весь спектр клинических проявлений, включая очаговые формы с летальным исходом [4, 5, 6]. Внутри сибирского генетического типа выделяют как минимум две подгруппы (подтипа) вируса клещевого энцефалита, отличающиеся по маркерным аминокислотам гистидину (Н) (прото-типный штамм Заусаев [5]) или глутамину (([)) (прототипный штамм Васильченко [7]) в позиции 234 аминокислотной последовательности белка Е ВКЭ [8].
Большинство исследований генетического разнообразия ВКЭ проводится с использованием штаммов ВКЭ, полученных методом биопробы. Этот метод позволяет получать большее количество вирусного генетического материала, но при пассировании на лабораторных животных возможны генетические изменения различных участков геномов исследуемых штаммов флавивирусов [9, 10]. Поэтому важным является проведение молекулярно-генетических исследований фрагментов геномов ВКЭ, выделенных из природных образцов без предварительного культивирования.
Таким образом, целью данной работы являлось выявление и молекулярно-генетический анализ фрагментов геномов вируса клещевого энцефалита в образцах клещей I. pei~sulcatus, собранных на Урале близ северной границы их обитания в 2006 г.
Материалы и методы Сбор материала
Материал собран с 14 по 28 мая 2006 г. в Североуральском районе Свердловской области между 59° 30' - 60° 00' в.д. и 60° 00' - 60° 30' с.ш. (окрестности с. Всеволодо-Благодатское). Выбранный ключевой участок находится на восточном макросклоне Урала в пределах Североуральской физико-географической провинции [11]. Амплитуда высот составляет 200-1500 м над уровнем моря. Вертикальная смена растительности четко выражена и представлена горно-тундровым, подгольцовым и лесным поясами, при явном преобладании по площади последнего. Голодные имаго Ixodes persulcatus отловлены с растительности во время проведения учетов на флаг. Координаты ключевого участка - 59° 38-60° 00' в.д. и 60° 30' - 60° 92' с.ш., амплитуда высот — 163-312 м над уровнем моря. Большую часть участка покрывают вторичные разновозрастные березово-сосновые и сосново-березовые леса, местами влажные, искусственные посадки сосны и лиственницы по вырубкам и значительно реже спелые елово-пихтовые леса. Живых голодных имаго до исследования хранили в камерах дифференцированной влажности при +4 °С.
Выделение суммарных нуклеиновых кислот Выделение ДНК и РНК из образцов клещей проведено с использованием наборов для выделения суммарных нуклеиновых кислот («ДНК-Технология», Москва) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Обратная транскрипция (ОТ) с последующей двухраундовой ПЦР Обратная транскрипция проведена с использованием наборов «РевертаЕ» в соответствии с инструкциями изготовителя («АмплиСенс», ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ). В качестве матрицы использованы образцы суммарных нуклеиновых кислот, выделенных из клещей I. persulcatus. После реакции обратной транскрипции фермент инактивирован прогреванием при 95 °С в течение 5 мин. Двухраундовая ПЦР проведена с праймерами, соответствующими 3' концу гена Е (позиции 2199-2219 и 2214-2238 на геноме ВКЭ штамма Софьин) и 5' концу гена NS1 (позиции 2402-2424 и 2517-2539) ВКЭ, синтезированными в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г.
Новосибирск). Данные праймеры выбраны на основании последовательностей генов Е и NS1 ВКЭ при рассмотрении участков геномов, максимально консервативных для штаммов ВКЭ всех трех генетических типов, содержащихся в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Genbank/index.html). С использованием данных олигонуклеотидов в качестве прай-меров проведена одно- и двухраундовая ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя (Биосан, г.Новосибирск).
Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Е и NS1 ВКЭ и молекулярно-генетический анализ Определение нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР длиной 341 н.п., соответствующих фрагментам гена Е и NS1 ВКЭ, проведено с помощью наборов Big Dye Terminators Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, США) с применением автоматического анализатора ДНК модели ABI 310 (Applied Biosystems, США) в Центре секвенирования ДНК СО РАН. Анализ полученных последовательностей осуществлен с использованием программы Mega 3.1 [12]. Для сравнения использованы последовательности генов Е и NS1 штаммов ВКЭ, относящихся к различным генетическим типам, из базы данных GenBank. Поиск гомологии полученных нуклеотидных последовательностей с уже известными последовательностями фрагментов геномов ВКЭ осуществлен с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Результаты и обсуждение Всего проанализировано 162 образца суммарных нуклеиновых кислот, полученных от голодных имаго таежного клеща (80 самок и 82 самца). Методом обратной транскрипции с последующими двухраундовой полимеразной цепной реакцией и определением нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-фрагментов в 6 пробах обнаружена РНК вируса клещевого энцефалита сибирского генетического типа.
Сравнительный анализ полученных последовательностей проведен с использованием последовательностей геномов ВКЭ дальневосточного (штамм Софьин (номер в базе данных GenBank Х07755), сибирского (Заусаев (AF527415), Васильченко (AF069066)) и западноевропейского (Найдорф (U27495)) генетических типов. Анализ нуклеотидных последовательностей, полученных ПЦР-фрагментов генов Е и NS1, выявленных положительных образцов, показал, что образцы Урал2006-31 и Урал2006-97 содержат последовательности, аналогичные образцам Урал2006-35 и Урал2006-112, соответственно. Также сравнительный анализ последовательностей образцов
Урал2006-9, Урал2006-31, Урал2006-95 и Урал2006-97 показал их сходство с ВКЭ сибирского генетического типа с высокой степенью гомологии (>91%) (Рис. 1).
Ранее показано, что в Уральском регионе встречаются штаммы ВКЭ сибирского генетического типа, относящиеся как к подтипу Заусаев, так и подтипу Васильченко [13, 14]. С помощью программы BLAST проведен поиск гомологии полученных последовательностей с опубликованными в базе данных GenBank. Полученные нами последовательности обладают высоким уровнем сходства (от 93 до 97% гомологии) с штаммами Заусаев (образец Урал2006-9) и Васильченко (образцы Урал2006-31, Урал2006-95 и Урал2006-97). Однако стопроцентной гомологии ни с одной из последовательностей геномов флавивирусов, находящихся в настоящее время в базах данных GenBank, не выявлено.
Филогенетический анализ последовательностей методом UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) (Рис. 2) осуществлен с использованием программы Mega 3.1 [12]. В качестве внешней группы использована последовательность фрагмента генома флавивируса Лангат (номер в базе данных GenBank NC_003690). Анализ построенных дендрограмм показал, что образцы Урал2006-95 и Урал2006-97, создавая отдельную группу на дереве, находятся ближе к штамму Васильченко, а Урал2006-9 образует группу с ВКЭ штамма Заусаев. Интересно отметить, что образец Урал2006-31 на филогенетическом дереве обособлен. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов Е и NS1 ВКЭ, выяв-
2219 2278
Софьин A7CGGAGAACATGCCTGGGATTTTGGCTCTACTGGTGGTTTCCTGACCTCGGTTGGTAAG
Найдорф . . А.....G . . С........С . . С . . Т . . . G. . . . А. . С . . Т . . . . GT . . АА. . . . G. . .
Васильченко . . А........С........С . . С . . Т . . С.....А......Т..........А. . С . . А
Заусаев ..А........С........G.....Т..С.....G......T..G.T.....G..С..А
Урал2006-9 . . А........С . . Т.....С.....Т . .С.....G . . А . . . Т . . G . Т.....G. . С . . А
Урал2 О 0 6-31 . . А........С........С . .С . . 'Г . . А.....А. . G . . ТТ .... 'Г.....G . . С . . .
Урал2 0 0 6-95 . .А.................С.....Т. .С........С. . .Т. . . .Т.....G. .С. .А
Урал2 0 0б-97 ..А.................С.....Т. .С........С...Т....Т.....G..C..A
2 2 7 9 2 3 3 8
Софьин GCGCTGCACACAGTTCTTGGCGGTGCCTÏTAACAGCCTTITTGGAGGAGTGGGGTTCTTG
найдорф . . . G . А . . Т . . G . . С.....Т . . С . . Т . . С......А.. С . . G . . G...........
Васильченко ..............С..С...........С......А.С.....G...........
Заусаев .................С . . Т . . С.....С......А . С.....G.....Т.....
Урал2006-9 .................С. .Т. .С.....С......А.С.....G.....Т.....
Урал2 0 0 6-31 ..............С. .С.....С. .Т. .С......А. С.....G...........
Урал2 0 0 6-95 ..............С. .С..............Т. . .А. С.....G........Т. .
Урал200 6-97 ..............С. .С..............Т. . .А.С.....G........Т. .
2339 2398
Софьин CCCAAGATCCTAGTGGGAGTGGTCCTGGCCTGGÏTGGGCCTGAACATGAGGAATCCGACC
Найдорф . . А . . АС . ТТ . . Т . А.......CAT . . . . Т....................А . . С . . Т . . А
Васильченко ......С . . . . GT . . . . Т . . А . СТТ .А..........................С . . Т . . Т
Заусаев ......C....GT....C..A.C.T....T..............Т........С..Т...
Урал2 0 0 6 - 9 ......С . . . . GT . . . . Т . . А . С . Т . . . . Т.......................С . . Т . . .
Урал2 0 0 6-31 ......С .... GT .... Т .... С.................................Т . . .
Урал2006-95 ......С. . . . GT . . . .7. .А.С.Т.А............Т.А..............Т. . .
Урал2 0 0 6-97 ......С. . . . GT . . . .Т. .А.С.Т.А............Т.А..............Т. . .
2399 2458
Софьин ATGTCCATGAGCTTCCTTCTGGCTGGAGGACTGGTTCTGGCCATGACACTCGGAGTGGGA
Найдорф ..............Т.. С Г..........Т.....СТ..........C..I........G
Васильченко .................СТ.......G........С.....Т........Т........Т
Заусаев .................С........G ... Т .... С.....Т........Г........G
Урал2006-9 .................С........G. . .Т. . . .С.....Т........т........G
Урал2006-31 ...........Т.....С.................С.....Т........т........Т
Урал2006-95 .....Т...........С........G........С.....Т........г.........
Урал2006-97 .....Т...........СТ.......G........С.....Т........Т.........
2 4 5 9 2 515
Софьин GCTGATGTTGGCTGTGCTGTGGACACTGAACGGATGGAGCTCCGCTGTGGTGAGGGT
Найдорф . . G........Т. .С...........G.....А.................С.....С
Васильченко ...........Т.....С........C..G..A.....А..............А. .С
Заусаев ...........т.....С . . А.....С . . G . . А.....А.................С
Урал2006-9 ...........Т. .С. .С. .А.....С. .G. .А.....А.................С
Урал20 0 6-31 .....С.....Т.....С........С. .G. .А.....А.................С
Урал20С-6-95 ...........Т.....С...........GA.A.....А........С........С
Урал2С06-97 ...........Т.....С...........GA.A.....А........С........С
'-•ген NS1
Рис. 1. Выравнивание последовательностей ПЦР-фрагментов генов Е и NS1 ВКЭ, выявленных в образцах клещей I. persulcatus, собранных на Урале в 2006 году.
Урал2006-9, Урал2006-31, Урал2006-95, Урал2006-97 - выявленные образцы; Софьин — штамм ВКЭ, относящийся к дальневосточному генетическому типу; Васильченко, Заусаев — штаммы ВКЭ, относящиеся к сибирскому генетическому типу; Найдорф — штамм ВКЭ, относящийся к западноевропейскому генетическому типу. Цифры над последовательностями соответствуют положению на геноме ВКЭ штамма Софьин (номер в базе данных GenBank Х07755)
39 99
93
100 г- Урал2006-95 ~L Урал2006-97
- Васильченко
100
С
Урал2006-31
Заусаев
Урап2006-9
Софьин
Найдорф
вирус Лангат
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Е и NS1 ВКЭ методом UPGMA.
Обозначения штаммов и изолятов ВКЭ те же, что на рис. 1. Цифры над узлами дерева обозначают индексы поддержки
ленные в образцах клещей, зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами EF405880-EF405883.
Таким образом, нами определены последовательности фрагментов генов Е и NS1 ВКЭ, что позволило получить первые сведения о вирусной популяции, распространенной на Урале близ северной границы обитания основного переносчика — таежного клеща. Выявленные последовательности не были описаны ранее. Отличия нуклео-тидных последовательностей, полученных нами в данной работе, от известных последовательностей геномов штаммов ВКЭ сибирского генотипа составляли от 3 до 7%.
Исследования поддержаны грантами РФФИ (проект № 05-04-48962а), Интеграционными проектами СО РАН № 5.12, №24 и Программой РАН <<Фундаментальные науки — медицине».
INVESTIGATION OF GENETIC DIVERSITY OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS SIBERIAN GENOTYPE REVEALED IN IXODES PERSULCATUS TICKS FROM NORTHERN URAL, RUSSIA
S.E. Tkachev, N.N. Livanova, S.G. Livanov
The goal of the work was to reveal and analyze tick-borne encephalitis virus (TBEV) genome fragments in I. persulcatus ticks samples collected from Ural region in 2006. Four tick-borne encephalitis virus genome fragments (EF405880-EF405883 accession numbers in GenBank database) were revealed by reverse transcription followed by nested PCR with primers corresponded to highly conservative regions of E and NS1 TBEV genes and sequencing. The sequences were shown to possess high homology level (from 93% to 97%) with Zausaev (sample Ural2006-9) and Vasilchenko (samples Ural2006-31, Ural2006-95 and Ural2006-97) strains. However, 100% homology was not observed with any flavivirus genomes sequences in GenBank database.
Литература
1. Специфическое определение флавивирусов методом молекулярной гибридизации с синтетическими дезоксиолигонуклеотидными зондами / В.И. Злобин, В.В. Погодина, Д.А. Дрокин и др. // Вопросы вирусологии. - 2003. - № 3. - С. 23-26.
2. Сибирский и дальневосточный подтипы вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России: генетическая и антигенная характеристика штаммов / В.В. Погодина, Н. Г. Бочкова, Л. С. Карань и др. // Вопросы вирусологии. — 2004. — № 4. — С. 20-24.
3. Natural tick-borne encephalitis virus infection among wild small mammals in the southeastern part of western Siberia, Russia / V.N. Bakhvalova, A.K. Dobrotvorsky, V.V. Panov, et al. // Vector Borne Zoonotic Disease. — 2006. - Vol. 6. - № 1. - P. 32-41.
4. Злобин В.И. Клещевой энцефалит. Этиология, эпидемиология и профилактика в Сибири / В.И. Злобин, О.З. Горин. — Новосибирск, 1996. — 177 с.
5. Characterization of a Siberian virus isolated from a patient with progressive chronic tick-borne encephalitis / T.S. Gritsun, T.V. Frolova, A.I. Zhankov, et al. //Journal of Virology. - 2003. - Vol. 77. - № 1. - P. 25-36.
6. Tick-borneencephalitis with Hemorrhagic Syndrome, Novosibirsk region, Russia, 1999 / V.A. Ternovoi, G.P. Kurzhukov, Y.V. Sokolov, et al. // Emerging Infectious Diseases. - 2003. - Vol. 9. - № 6. - P. 743-746.
7. Complete sequence of two tick-borne flaviviruses isolated from Siberia and the UK: analysis and significance of the 5' and 3'-UTRs / T.S. Gritsun, K. Venugopal, P.M. Zanotto, et al. // Virus Research. - 1997. - Vol. 49. -№ 1. - P. 27-39.
8. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита / В.И. Злобин, С.И. Беликов, Ю.П. Джиоев и др. - Иркутск, 2003. - 272 с.
9. К вопросу о влиянии host-эффекта на штаммо-вую изменчивость вируса клещевого энцефалита / В.В. Якименко, Д.А. Дрокин, О.Б. Калмин и др. // Вопросы вирусологии. - 1996. - Т. 41. - № 3. - С. 112-117.
10. Lee, Е. Changes in the dengue virus major envelope protein on passaging and their localization on the three-dimensional structure of the protein / E. Lee, R.C. Weir, L. Dalgarno // Virology. - 1997. - Vol. 9. - № 232 (2).
- P. 281-290.
11. Природные условия и естественные ресурсы СССР. Урал и Приуралье. - М„ 1968. - 68 с.
12. Kumar, S. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment / S. Kumar, K. Tamura, M. Nei // Briefings in Bioinformatics. - 2004. - № 5. - P. 150-163.
13. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка оболочки Е / В.И. Злобин, Т.В. Демина, Т.В. Бутина и др. // Вопросы вирусологии.
- 2001. - Т. 46. - № 1. - С. 12-16.
14. Погодина В.В. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60-летний период // Вопросы вирусологии. - 2005. - Т. 50. - № 3. - С. 7-13.
