CC BY
83
Анализ соответствия четырех вакцинных штаммов современным изолятам вируса клещевого энцефалита сибирского типа
О.В. Морозова1 ([email protected]),
В.Н. Бахвалова2 ([email protected]), О.Ф. Потапова2 ([email protected]),
А.Е. Гришечкин1 ([email protected]), Е.И. Исаева1 ([email protected])
1 ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, Москва
2 ФГБУН «Институт систематики и экологии животных» Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск
Резюме
Молекулярное типирование современных изолятов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) посредством определения нуклеотидных последовательностей продуктов обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) c праймерами, соответствующими гену Е, а также ПЦР с генотип-специфичными флуоресцентными зондами в реальном времени показали доминирование сибирского типа ВКЭ с преобладанием подтипа Заусаев в изолированных природных очагах Новосибирской, Челябинской областей и Республики Алтай. Несмотря на молекулярно-эпидемиологические доказательства циркуляции сибирского типа ВКЭ в большинстве эндемичных областей России, все инактивированные вакцины против клещевого энцефалита (КЭ) основаны на штаммах дальневосточного и европейского типов, выделенных от клещей или больных 37 - 75 лет назад. Высокие уровни внутривидовой гомологии основного иммуногена - гликопротеина оболочки вирионов Е (96 - 99%) - обусловлены, возможно, его полифункциональностью. Внутривидовая вариабельность аминокислотных последовательностей других белков, включая поверхностные гликопротеины М и NS1, может достигать 10%. Подкожная трехразовая иммунизация мышей четырьмя инактивированными вакцинами против КЭ в соответствии с рекомендациями ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»Минздрава России индуцировала антитела к ВКЭ сибирского типа с титрами в иммуноферментном анализе (ИФА) в диапазоне 1:200 - 1:1600. При этом титры в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с антигенами штаммов ВКЭ разных подтипов: Айна (номер доступа в GenBank AF091006) (1:20 -1:80) и Заусаев - штамм 2689 (JQ693478) (0 - 1:320) сибирского генетического типа - значительно отличались для одинаковых сывороток иммунизированных мышей и были меньше соответствующих титров для гомологичных сочетаний штаммов вакцин и для РТГА. Несмотря на наличие антител, нейтрализующих штамм Айна ВКЭ, коррелирующих с защитным эффектом отечественных вакцин и австрийской вакцины от заражения штаммом 2689 подтипа Заусаев, протективный эффект немецкой вакцины при разведениях 1:32, 1:100 и 1:320 отсутствовал, что приводило к полной гибели иммунизированных мышей при заражении 100 ЛД50 штамма 2689 ВКЭ.
Ключевые слова: сибирский тип ВКЭ, молекулярное типирование, инактивированные вакцины против КЭ, ИФА, РТГА, реакция нейтрализации, защитный эффект вакцин
Analysis of Adequacy of the Four Vaccines with Modern Tick-Borne Encephalitis Virus Isolates of the Siberian Type
O.V. Morozova1 ([email protected]), V.N. Bakhvalova2 ([email protected]), O.F. Potapova2([email protected]), А.Е. Grishechkin1 ([email protected]), E.I. Isaeva1 ([email protected])
1 The Federal State Budgetary Institution «D.I. Ivanovsky Virology Institute», Ministry of Health of Russian, Moscow
2 The Federal State Budgetary Institution of Science «Institute of Systematics and Ecology of Animals», Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk
Abstract
Molecular typing of the tick-borne encephalitis virus (TBEV) recent isolates by means of nucleotide sequencing of RT-PCR products with primers corresponding to E gene as well as real-time PCR with subtype-specific fluorescent hydrolysis probe revealed dominance of the TBEV Siberian subtype with prevalence of Zausaev-like variants in isolated natural foci of Novosibirsk, Chelyabinsk regions and Altay Republic. Despite of molecular epidemiological evidences of the TBEV Siberian subtype circulation in the majority of the Russian endemic regions all available vaccines against the tick-borne encephalitis (TBE) are based on the virus strains of Far Eastern and European subtypes isolated from ixodid ticks or patients 37 - 75 years ago. High intraspecies homology levels of the main immunogen -envelope glycoprotein E (96 - 99%) might be resulted from its multiple functions. Intraspecies variability of amino acid sequences of other viral proteins including surface glycoproteins M and NS1 can reach 10%.
Subcutaneous immunization of mice 3 times with 4 inactivated vaccines against TBE in accordance with the Scientific Centre of Medical Products, Russian Ministry of Health induced antibodies against the TBEV of the Siberian subtype antigens with ELISA titers varied in
a range 1:200 - 1:1600. The same sera contained anti-hemagglutinins with various titers in hemagglutination inhibition (HI) reaction with antigens of the TBEVstrains of different subtypes Aina (GenBank accession number AF091006) (1:20 -1:80) and Zausaev strain 2689 (JQ693478) (0-1:320) that were lower than corresponding titers for homologous combinations of the vaccine strains and HI antigens. In spite of antibodies neutralizing the TBEV Aina strain correlating with protection effect of Russian vaccines and Austrian vaccine from the viral change with Zausaev-like strain 2689 the German vaccine diluted in 32, 100 and 320 times did not protect mice from the same viral challenge that caused complete loss of the vaccinated mice after the infection with 100 LD50 strain 2689. Key words: Siberian subtype of TBEV, Molecular typing, inactivated vaccines against TBE, ELISA, HI, neutralization test, protection effect of vaccines
Введение
Для специфической профилактики флавиви-русных инфекций в настоящее время в мире используют преимущественно инактивированные вакцины, за исключением живых аттенуиро-ванных вакцин против вирусов желтой лихорадки и японского энцефалита. В настоящее время в России разрешены к применению шесть типов вакцин против клещевого энцефалита (КЭ), полученных инактивацией вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) из первичных культур фибробластов куриных эмбрионов. Отечественные вакцинные штаммы ВКЭ дальневосточного генетического типа включают штамм Софьин, выделенный из мозга умершего больного на Дальнем Востоке в 1937 году, и штамм 205, выделенный от клеща Ixodes persulcatus в Хабаровском крае в 1973 году. Для производства зарубежных вакцин в Австрии и Германии применяют штаммы западноевропейского генетического типа: Найдорф (выделенный от клеща Ixodes ricinus в 1971 г.) и К23 (выделенный от клеща Ixodes ricinus в 1975 г.) соответственно; в Китае - штамм Сеньжанг дальневосточного генетического типа, выделенный из мозга умершего в 1953 году. Все вакцинные штаммы были выделены 35 - 75 лет назад и отличаются от доминирующих в настоящее время в природных популяциях эндемичных областей России изолятов сибирского генетического типа ВКЭ.
До настоящего времени уровень иммунизации инактивированными вакцинами против КЭ в большинстве регионов России не превышает нескольких процентов от общей численности населения (в среднем 5 - 7%). Исключениями являются Свердловская область и Республика Алтай, в которых охват вакцинацией против КЭ составляет 78 и 40% населения соответственно. При этом именно в этих эндемичных областях уровни заболеваемости КЭ остаются высокими и превышают ежегодные среднероссийские показатели в 6 - 10 раз. Вакцинация не всегда предотвращает заболевание [7, 13, 14, 17, 21], однако для иммунизированных лиц заболеваемость в два раза ниже и характерны более легкие лихорадочные формы течения КЭ [1, 2, 7, 9, 13].
Цель работы состояла в молекулярном определении доминирующего генетического типа ВКЭ в изолированных природных очагах и сравнении иммуногенности и протективных свойств четырех
инактивированных вакцин при заражении современным штаммом ВКЭ доминирующего типа.
Материалы и методы
Вирус
ВКЭ детектировали в клещевых суспензиях ик-содовых клещей из Новосибирской, Челябинской областей и Республики Алтай посредством обратной транскрипции с последующей ПЦР с генотип-специфичными флуоресцентными зондами в реальном времени и определения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР с последующим фи-логененетическим анализом [15, 16]. Для оценки иммуногенных свойств инактивированных вакцин против КЭ использовали штамм Айна сибирского типа ВКЭ из Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России и штамм 2689 подтипа Заусаев сибирского типа ВКЭ, выделенный от иксодового клеща в Новосибирской области в 2010 году (номер доступа в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) JQ693478), из коллекции Института систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск. Защитный эффект вакцин проверяли при заражении штаммом 2689.
Иммунизация мышей инактивированными вакцинами против КЭ
Сравнивались следующие препараты: вакцина против КЭ ЭнцеВир (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Томске «НПО «Вирион»), вакцина против КЭ производства Предприятия Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова (ПИПиВЭ) Московской области, ФСМЕ-Иммун (компания Baxter, Австрия) и Энцепур взрослый (компания Novartis, Германия).
Вакцины разводили в 10, 32, 100 и 320 раз в среде 199. Самок мышей линии BALB/c и самцов мышей ICR весом 16 г (10 групп по 10 особей в каждой группе) иммунизировали подкожно три раза с интервалами 7 дней между инъекциями в соответствии с рекомендациями ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Титры антител (АТ) в сыворотках крови иммунизированных мышей выявляли в ИФА с иммобилизованными антигенами сибирского типа ВКЭ из инфицированных клеток СПЭВ после
предварительного осаждения 20 объемами охлажденного при -20 °С ацетона и растворения в бикарбонатном буфере рН 9 или из инактивированных вакцин с последующими блокировкой и связыванием с антителами (АТ) кролика, направленными против IgG мыши и конъюгированными с пероксидазой хрена производства Sigma или ЗАО «БиоСан» (г. Новосибирск), и окрашиванием иммунных комплексов в растворе ортофенилен-диамина.
Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с нативными или формалинизированными эритроцитами гуся проводили с 4 - 8 агглютинирующими единицами (АЕ) штаммов Айна и 2689 сибирского генетического типа ВКЭ в соответствии с методическими рекомендациями [8, 18].
Реакцию нейтрализации (РН) проводили с 2 lg ЦПД50 ВКЭ сибирского типа и АТ из сывороток крови мышей, трехкратно иммунизированных четырьмя инактивированными вакцинами против КЭ, в последовательных 10-кратных разведениях в течение 1 часа при 37 °С с последующим заражением клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) в 24- или 48-луночных планшетах и с наблюдениями за развитием цитопатического действия (ЦПД) ВКЭ на протяжении последующих 5 - 7 дней.
Защитный эффект четырех инактивированных вакцин проверяли у трехкратно иммунизированных мышей посредством внутрибрюшинного введения 100 ЛД50 штамма 2689 подтипа Заусаев сибирского генетического типа ВКЭ.
Статистическое сравнение выборочных средних проводили с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) по методу наименьших значимых различий (LSD), выборочных долей - по t-критерию Стьюдента [6]. Определение среднего геометрического титров (СГТ) антител проводили вычислением антилогарифма от среднего арифметического десятичных логарифмов обратных значений титров в соответствии с [6]. Принят уровень значимости различий P < 0,05.
Работу с инфекционным ВКЭ и потенциально опасным материалом выполняли в лаборатории, аттестованной для работы с патогенами второй группы опасности для человека Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (лицензия № 77.99.18.001.Л.000032.03.08 от 5.03.2008 г.).
Содержание, кормление, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Результаты и обсуждение
Молекулярное типирование современных изолятов ВКЭ
Внутривидовая гетерогенность квазивидов фла-вивирусов вызывает необходимость выделения
типов и подтипов, объединяющих близкородственные вирусные изоляты. В 1980-е годы посредством иммунотипирования [10], а позднее с применением молекулярной гибридизации геномных РНК с олигонуклеотидными зондами и филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена Е были выделены дальневосточный, сибирский и европейский типы ВКЭ [3, 15, 19], принятые в настоящее время Международным комитетом по таксономии вирусов. Однако филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кодирующих областей полноразмерных геномов показал существование четырех типов ВКЭ, включая восточный и западный типы, а также близкородственные, переносимые клещами флавивиру-сы [20], что пока не утверждено Международным комитетом по таксономии вирусов. Помимо этого, на территории Иркутской области и Монголии выделены штаммы ВКЭ 178-79 (номер доступа в GenBank EF469661) и 886-84 (EF469662), существенно отличающиеся по структуре генома от всех ранее известных типов ВКЭ, на основании чего предложено отнести их к генетическим типам 4 и 5 соответственно [4].
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена Е (рис. 1) и NS1 (данные не представлены), а также обратная транскрипция с последующей ПЦР с генотип-специфичными флуоресцентными зондами в реальном времени для изолятов ВКЭ из природных очагов Новосибирской, Челябинской областей и Республики Алтай в 2007 - 2011 годах показали доминирование сибирского типа ВКЭ.
На основании определения нуклеотидных последовательностей доминирующих генетических вариантов квазивида ВКЭ постулируется не только доминирование сибирского типа ВКЭ в большинстве эндемичных областей России и ближнего зарубежья, но и постепенное вытеснение других типов вируса [5, 11]. Однако нельзя не учитывать искажения структуры квазивида в хронологических рядах штаммов ВКЭ после пассажей в фибробла-стах куриных эмбрионов, в культурах пермиссив-ных клеток и в лабораторных мышах.
Несмотря на внутривидовые генетические отличия ВКЭ, позволяющие дифференцировать различные типы посредством молекулярной гибридизации геномных РНК с олигонуклеотидны-ми зондами, филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей продуктов ОТ-ПЦР или ПЦР с генотип-специфичными флуоресцентными зондами в реальном времени, из-за вырожденности генетического кода уровни гомологии основного иммуногена - гликопротеина оболочки вирионов Е - составляют 96 - 99%, что, возможно, вызвано полифункциональностью этого вирусного белка, в то время как отличия аминокислотных последовательностей других белков ВКЭ, включая гликопротеины М и NS1, достигают 10%.
Рисунок 1.
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Едлиной 773 н.п. для изолятов ВКЭ, выделенных от клещей из Новосибирской, Челябинской областей и Республики Алтай в 2007 - 2011 годах (программа Меда 4.0, алгоритм UPGMA, 1000 репликаций)
53£ Новосибирск GU060547
84
85
100
74
86
Челябинск GU143821
J Новосибирск 2689 JQ693478 ^Заусаев AF527415
40
53 64
с
88
100 65
100 67 87
—Алтай 84 JQ687274 рАлтай 72 JQ687273 Челябинск AF527415 Челябинск GU143820 Новосибирск GU060546 Айна AF091006 Васильченко L40361 205DQ989336 Глубинное/2004 DQ862460 Софьин-НО АВ062064 Софьин Х07755 |—Хипр TEU39292 Найдорф TEU27495
100
5Ч
86 I_
гАбсеттаров AF091005 ''-Алтай 103 JQ687275 -Вирус ОГЛ Боголюбовка AY323489
гПовассан Партизанск/2006 EU543649
П-Г
100 LnoBaccaH Спасск-9 EU770575
1Í5
0,15
o,lo
0,05
э!ю
Примечание: Жирным шрифтом обозначен современный штамм ВКЭ, выделенный от иксодового клеща в Новосибирске в 2010 году и относящийся к доминирующему подтипу Заусаев сибирского генетического типа ВКЭ. Жирным курсивом отмечены вакцинные штаммы ВКЭ для инактивированных вакцин против КЭ российского и австрийского производства.
До настоящего времени характеристики современных изолятов ВКЭ не учитываются при производстве инактивированных вакцин. Вакцины отечественного производства основаны на дальневосточных штаммах ВКЭ, выделенных в 1937 и 1973 годах, а вакцины зарубежного производства - на европейских штаммах, изолированных в 1971 и 1975 годах, что не соответствует доминирующему в большинстве эндемичных областей России сибирскому генетическому типу ВКЭ (см. рис. 1) [3 - 5, 11, 15, 16].
Необходима регулярная проверка соответствия вакцинных штаммов современным вирусным изо-лятам не только с использованием перекрестных серологических реакций (с анализом антител, индуцируемых в результате иммунизации инактивиро-ванными вакцинами, в ИФА, РТГА и РН с современными штаммами ВКЭ), но и с обязательной прямой оценкой защитного эффекта вакцин от заражения типичными современными штаммами ВКЭ.
Анализ иммуногенных свойств инактивированных вакцин против КЭ
Для оценки иммуногенных и протективных свойств четырех инактивированных вакцин против КЭ 10 групп по 10 мышей ICR и BALB/c в каждой группе были три раза иммунизированы подкожно с интервалом семь дней вакцинами в разведениях в 10, 32, 100 и 320 раз в среде 199 в соответствии с рекомендациями ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва. Через семь дней после последней вакцинации у пяти групп мышей были взяты образцы крови для серологических реакций, а пять других групп непосредственно после иммунизации без травмирующих процедур отбора образцов крови заражали 100 ЛД50 штамма 2689 ВКЭ, выделенного от иксодового клеща в 2010 году в Новосибирской области.
ИФА с иммобилизованными антигенами штамма Айна сибирского типа из инфицированных кле-
ток СПЭВ, очищенными посредством осаждения ацетоном, показал наличие ^ в титрах от 1:200 до 1:1600 (табл. 1). Необходимо отметить, что титры антител в каждой группе сывороток от мышей, иммунизированных любой вакциной в соответствующем разведении, совпадали с точностью до двухкратного разведения.
Также следует отметить, что титры в ИФА суммарных ^ для гомологичного сочетания вакцинного штамма Софьин и антигена этого же штамма для ИФА достигали 1:3200, однако для гетероло-гичных внутритиповых комбинаций:
1) дальневосточный тип: вакцинный штамм 205 в составе вакцины ЭнцеВир и штамм Софьин для ИФА;
2) европейский тип: вакцинные штаммы Найдорф или К23, штамм Абсеттаров для ИФА
- не превышали 1:1600, как и для межтиповых перекрестных иммунологических реакций.
Титры антител в РТГА (табл. 2) и РН (табл. 3) были меньше титров в ИФА, что обусловлено отсутствием антигемагглютинирующих и вируснейтрали-зующих свойств у части антител [12] и меньшей чувствительностью РТГА и РН по сравнению с ИФА. Неожиданными оказались отличия между штаммами сибирского типа Айна и 2689 (подтип Заусаев), выявленные в РТГА (см. табл. 2 и рис. 2).
Антигемагглютинины к штамму ВКЭ 2689 (см. рис. 2) были выявлены у всех мышей BALB/c после иммунизации томской вакциной ЭнцеВир, что было значимо (от Р < 0,05 до Р < 0,001) выше доли серопозитивных особей среди иммунизированных другими вакцинами. В группе мышей после иммунизации вакциной Энцепур для всех особей получены отрицательные результаты. При этом наиболее высокими были титры антител сре-
ди мышей, получавших вакцину ЭнцеВир; средняя геометрическая титров антигемагглютининов у се-ропозитивных особей в группах мышей, иммунизированных томской вакциной, составляла 1:22,6, австрийской - 1:13,9, московской - 1:10,0.
Необходимо отметить самые низкие титры ви-руснейтрализующих антител в сыворотках крови мышей после иммунизации вакциной Энцепур в разведении 1:10 и отсутствие вируснейтрализую-щих антител при последующих разведениях этой вакцины (см. табл. 3).
Анализ протективного эффекта инактивированных вакцин при заражении современным штаммом ВКЭ, относящимся к доминирующему подтипу Заусаев сибирского генетического типа ВКЭ
Несмотря на детекцию антител в перекрестных серологических реакциях ИФА, РТГА и РН (см. табл. 1 - 3 соответственно) с антигенами сибирского типа ВКЭ и антителами из сывороток крови иммунизированных мышей, обнаружены существенные отличия протективных свойств вакцин (табл. 4, рис. 3).
Наиболее высокий уровень защиты мышей BALB/c от 100 ЛД50 ВКЭ подтипа Заусаев сибирского типа, доминирующего в природных очагах России, отмечен для вакцины ЭнцеВир: минимальная иммунизирующая доза (МИД50), защищающая 50% мышей при трехкратном введении составила менее 0,0016 мл. Эта вакцина даже при максимальном разведении (1:320) обеспечила выживание 100% животных после заражения ВКЭ, а суммарная доля выживших после заражения мышей среди иммунизированных разными разведениями вакцины была существенно выше (от Р < 0,05 до Р < 0,001) по сравнению с аналогичным показателем других вакцин (см. табл. 4). МИД московской
Таблица 1.
Результаты ИФА с иммобилизованными на полистирольные планшеты антигенами штамма Айна и вторыми антителами, направленными против IgG мыши и конъюгированными с пероксидазой хрена, в разведении 1:1000
разведения вакцин для иммунизации мышей Титры IgG в сыворотках крови мышей после иммунизации вакцинами:
ПИПВЭ, Москва ЭнцеВир, «Микроген», Томск фСМЕ-Иммун, Baxter, Австрия Энцепур, Novartis, Германия
х* lg (х) х lg (х) х lg (х) х lg (х)
1:10 400 2,6 1600 3,2 400 2,6 1600 3,2
1:32 400 2,6 1600 3,2 400 2,6 1600 3,2
1:100 400 2,6 1600 3,2 400 2,6 1600 3,2
1:320 200 2,3 400 2,6 400 2,6 1600 3,2
СГТ 336,4 2,53 1131,4 3,05** 400,0 2,60 1600,0 3,20**
SD - 0,15 - 0,30 - 0,00 - 0,00
SEM - 0,05 - 0,11 - 0,00 - 0,00
Примечания: Здесь и в таблицах 2 и 3: *для обозначения титров антител приведены обратные значения разведений сывороток;
** у вакцин ЭнцеВир и Энцепур показатели выше, чем у ПИПВЭ и ФСМЕ-Иммун (LSD, от P < 0,003 до P < 0,0001).
СГТ - средняя геометрическая титров; SD (standard deviation) - стандартное отклонение; SEM (standard error of means) - ошибка средней.
Таблица 2.
Результаты РТГА с 8 АЕ штаммов Айна и 2689 (подтип Заусаев) сибирского типа ВКЭ
разведения вакцин для иммунизации мышей Антиген Титры антигемагглютининов в сыворотках крови мышей после иммунизации вакцинами:
ПИПВЭ, Москва ЭнцеВир, «Микроген», Томск фСМЕ-Иммун, Baxter, Австрия Энцепур, Novartis, Германия
x lg (х) х lg (х) х lg (х) х lg (х)
1:10 Айна 80 1,9 80 1,9 40 1,6 80 1,9
2689 - 0* - 0* 20 1,3 - 0*
1:32 Айна 80 1,9 80 1,9 40 1,6 80 1,9
2689 160 2,2 40 1,6 - 0* - 0*
1:100 Айна 80 1,9 80 1,9 40 1,6 40 1,6
2689 - 0* 640 2,8 - 0* - 0*
1:320 Айна 80 1,9 40 1,6 20 1,3 40 1,6
2689 - 0* 40 1,6 - 0* - 0*
СГТ Айна 80,0 1,90** 67,3 1,83 33,6 1,53** 56,6 1,75**
SD - 0,00 - 0,15 - 0,15 - 0,17
SEM - 0,00 - 0,05 - 0,05 - 0,06
СГТ 2689 3,6 0,55 31,8 1,50*** 2,1 0,33 1,0 0,00
SD - 1,10 - 1,15 - 0,65 - 0,00
SEM - 0,39 - 0,41 - 0,23 - 0,00
Примечания: * Здесь и в таблице 3 при расчете логарифмов для учета групп с нулевыми значениями титра показателю разведения условно присвоено значение «1»; ** у вакцин ПИПВЭ, ФСМЕ-Иммун и Энцепур показатели для антигена Айна выше, чем для 2689
(LSD, отP < 0,05 до P < 0,0005); *** для антигена 2689 показатель у вакцины ЭнцеВир выше, чем у вакцины Энцепур (LSD, P < 0,03).
Рисунок 2.
Результат определения антигемагглютининов к ВКЭ в сыворотках крови мышей BALB/c, иммунизированных вакцинами против КЭ в разведениях 1:10 (РТГА с 8 АЕ штамма 2689)
и австрийской вакцин находились в допустимом ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России интервале от 0,001 до 0,017 мл. Для вакцины Энцепур МИД50 составила 0,04 мл, что превысило рекомендованные пределы и привело к гибели от ВКЭ 50,0 ± 16,7% мышей, иммунизированных при ми-
нимальном разведении вакцины (1:10), и к полной гибели животных, зараженных ВКЭ после иммунизации с разведениями вакцины в 32, 100 и 320 раз (см. табл. 4).
Наблюдаемые различия между иммуногенными и защитными свойствами вакцин обусловлены, возможно, высокой консервативностью белка оболоч-
Таблица 3.
Результаты реакции нейтрализации 2 lg ЦПД50 штамма Айна сибирского типа ВКЭ и антител из сывороток крови мышей ICR, иммунизированных вакцинами против КЭ разного разведения
разведения вакцин против КЭ Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови мышей после иммунизации вакцинами:
ПИПВЭ, Москва ЭнцеВир, «Микроген», Томск фСМЕ-Иммун, Baxter, Австрия Энцепур, Novartis, Германия
х lg (х) х lg (х) х lg (х) х lg (х)
1:10 100 2,0 100 2,0 100 2,0 10 1,0
1:32 100 2,0 100 2,0 100 2,0 0 0,0
1:100 10 1,0 100 2,0 10 1,0 0 0,0
1:320 0 0 10 1,0 0 0 0 0,0
СГТ 17,8 1,25 56,2 1,75** 17,8 1,25 1,8 0,25
SD - 0,96 - 0,50 - 0,96 - 0,50
SEM - 0,34 - 0,18 - 0,34 - 0,18
Примечание. * Показатель у вакцины ЭнцеВир выше, чем у вакцины Энцепур (LSD, P < 0,02).
Таблица 4.
Протективный эффект вакцин против КЭ по отношению к 100 ЛД50 штамма 2689 подтипа Заусаев сибирского типа ВКЭ
разведения вакцин против КЭ Доля (% ± m*) выживших мышей BALB/c после заражения ВКЭ среди иммунизированных разными разведениями вакцин:
ПИПВЭ, Москва ЭнцеВир, «Микроген», Томск фСМЕ-Иммун, Baxter, Австрия Энцепур, Novartis, Германия
1:10 100% 10/10** 90,0 ± 10,0% 9/10 100% 10/10 50,0 ± 16,7% 5/10
1:32 100% 10/10 100% 10/10 Н.и. 0% 0/10
1:100 80,0 ± 13,3% 8/10 100% 10/10 80,0 ±13,3% 8/10 0% 0/10
1:320 50,0 ± 16,7% 5/10 100% 10/10 50,0 ± 16,7% 5/10 0% 0/10
*** ± m 82,5 ± 6,1% 33/40 97,5 ± 2,5% 39/40 76,7 ± 7,9% 23/30 12,5 ± 5,3% 5/40
Примечания: *т - статистическая погрешность доли [6];
**здесь и далее в числителе число выживших животных, в знаменателе - число иммунизированных, а затем зараженных ВКЭ мышей; *** - суммарная доля выживших после заражения мышей среди иммунизированных разными разведениями вакцины. Н.и. - не исследованы.
ки вирионов Е, на основе которого разработаны методы ИФА, РТГА и РН, и разницей в составе других белков ВКЭ, в том числе и гликопротеинов на поверхности вирионов и инфицированных клеток.
Анализ генетической гетерогенности и перестроек квазивида ВКЭ при адаптации к различным резервуарным хозяевам свидетельствует о том, что при разработке комбинированных вакцин нового поколения необходимо сочетание не менее трех штаммов, выделенных от клещей из разных природных очагов и относящихся к разным типам ВКЭ. Независимо от генетического типа изоляты ВКЭ, выделенные от диких млекопитающих, отличаются низкими патогенностью, репродуктивной
активностью и иммуногенностью при заражении лабораторных мышей ICR, в связи с чем рассматривать их в качестве кандидатов в вакцинные штаммы нецелесообразно. Для оценки защитного эффекта вакцин против КЭ необходимо использовать обновляемые панели региональных, выделенных от клещей-переносчиков, высоковирулентных штаммов с максимально возможными периферическими титрами.
Выводы
1. Молекулярное типирование изолятов ВКЭ за последние пять лет показало доминирование подтипа Заусаев сибирского типа ВКЭ в при-
Рисунок 3.
Протективный эффект вакцин против КЭ по отношению к 100 ЛД50 штамма 2689 ВКЭ сибирского генетического типа
Примечание: *Для вакцины ФСМЕ-ИММУН в разведении 1:32 протективный эффект не исследовали.
родных очагах Новосибирской, Челябинской областей и Республики Алтай.
2. Вакцинные штаммы дальневосточного и европейского генетических типов ВКЭ, выделенные 35 - 75 лет назад, отличаются от современных вирусных изолятов (от 1 до 10% аминокислотных замен поверхностных гликопротеинов Е, М и NS1).
3. Подкожная иммунизация мышей инактивиро-ванными вакцинами против КЭ индуцировала антитела к антигенам ВКЭ сибирского типа с разными титрами в ИФА, РТГА и РН.
4. Обнаружены значительные различия титров в РТГА с антигенами подтипов Айна и Зауса-ев сибирского типа ВКЭ. При этом результаты РТГА, проведенной с антигеном подтипа Зауса-
ев, коррелируют с данными по протективному эффекту разных вакцин.
5. Наиболее высокий уровень защиты мышей от 100 ЛД50ВКЭ подтипа Заусаев сибирского типа отмечен для вакцины ЭнцеВир: минимальная иммунизирующая доза, защищающая 50% мышей при трехкратном введении, составила менее 0,0016 мл. МИД50 московской и австрийской вакцин находились в допустимом интервале от 0,001 до 0,017 мл. Для вакцины Энцепур МИД50 составила 0,04 мл, что превысило рекомендованные пределы и привело к гибели от ВКЭ 50,0 ± 16,7% мышей, иммунизированных вакциной при минимальном разведении (1:10), и к полной гибели животных, зараженных ВКЭ после иммунизации с разведениями вакцины в 32, 100 и 320 раз. ш
Литература
10.
11.
12. 13.
Воробьева М.С. Современное состояние вакцинопрофилактики клещевого энцефалита / Клещевой энцефалит. - Владивосток: ГУП «Полиграфком-бинат», 2002. С. 166 - 169.
Воробьева М.С. Клещевой энцефалит / Нужны ли людям вакцины? / Под ред. Н.В. Медуницына, М., 2006. С. 134 - 141.
Злобин В.И., Мамаев Л.В., Джиоев Ю.П. и др. Генетические типы вируса клещевого энцефалита // Журнал инфекционной патологии. 1996. Т. 3, № 4. С. 13 - 17.
Злобин В.И., Демина Т.В., Мамаев Л.В. и др. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка оболочки Е // Вопросы вирусологии. 2001. № 1. С. 13 - 16.
Карань Л.С., Маленко Г.В., Бочкова Н.Г. и др. Применение молекулярно-генетических методик для изучения структуры штаммов вируса клещевого энцефалита // Бюллетень СО РАМН. 2007. № 4. С. 34 - 40. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980. - 292 с.
Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит: актуальные аспекты. - М.: Издатель И.В. Балабанов. - 168 с.
Мельникова Е.Э. Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации // Арбовирусы (методы лабораторных и полевых исследований) / Под ред. С.Я. Гайдамович. - М., 1986. C. 126 - 135.
Морозова О., Бахвалова В. Вакцины против клещевого энцефалита: прошлое, настоящее и будущее / Lambert Academic Publishing (LAP), Saarbrucken, Germany, 2011. - 100 р.
Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1981. № 6. C. 741 - 746.
Погодина В.В., Карань Л.С., Колясникова Н.М. и др. Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя // Вопросы вирусологии. 2007. № 5. С. 16 - 21.
Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. - М.: Мир., 2000. - 581 с.
Щучинова Л.Д. Эпидемиологический надзор и контроль инфекций, передающихся клещами, в Республике Алтай.: Автореф. дис. ... к.м.н. - Омск: 2009.
Andersson C.R., Vene S., Insulander M. et al. Vaccine failures after active immunisation against tick-borne encephalitis // Vaccine. 2010. V. 28. P. 2827 - 2831.
15. Bakhvalova V.N., Rar V.A., Tkachev S.E. et al. Tick-borne encephalitis virus strains of Western Siberia // Virus Res. 2000. V. 70 (1 - 2). R 1 - 12.
16. Bakhvalova V.N., Ranov V.V., Morozova O.V. Tick-borne encephalitis virus quasispecies rearrangements in ticks and mammals / Flavivirus encephalitis / R. Daniel (Ed.). - InTech, 2011. R. 213 - 234. http://www.intechopen.com/articles/show/title/tick-borne-encephalitis-virus-quasispecies-rearrangements-in-ticks-and-mammals.
17. Brauchli Y.B., Gittermann M., Michot M. et al. A fatal tick bite occurring during the course of tick-borne encephalitis vaccination // Rediatr. Infect. Dis. J. 2008. V. 27. R 363 - 365.
18. Clarke D.H., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod-borne viruses // Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1958. V. 7 (5). R. 561 - 573.
19. Ecker M., Allison S.L., Meixner T. et al. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J. Gen. Virol. 1999. V. 80 ( Rt 1). R 179 - 185.
20. Grard G., Moureau G., Charrel R.N. et al. Genetic characterization of tick-borne flaviviruses: new insights into evolution, pathogenetic determinants and taxonomy // Virology. 2007. V. 361. R 80 - 92.
21. Rlisek S, Honegr K, Beran J. TBE infection in an incomplete immunized person at-risk who lives in a high-endemic area - impact on current recommendations for immunization of high-risk groups // Vaccine. 2008. V. 26. R. 301 - 304.
информация cdc
Обновленная информация о распространении в мире вакциноассоциированного полиовируса (апрель 2011- июнь 2012 г.)
Один из основных инструментов, используемых при ликвидации полиомиелита,-живая оральная полиомиелитная вакцина (ОПВ). Она недорога, легко вводится через рот и обеспечивает долгосрочную защиту от паралитического заболевания, благодаря созданию прочного гуморального иммунитета. Тем не менее редкие случаи острого паралитического полиомиелита, ассоциируемого с вакцинацией, могут отмечаться как у иммунологически компетентных реципиентов ОПВ, так и у контактных, у лиц с иммунодефицитом, у находящихся на территориях с низким уровнем охвата вакцинацией ОПВ.
С апреля 2011 по июнь 2012 года в целом ряде стран сохраняется нестабильная ситуация с циркуляцией вакциноассоциированного по-лиовируса (ВАПВ). Снизилось число вспышек в Афганистане, Эфиопии, Индии, на прежнем уровне - их количество в Демократической Республике Конго и Сомали, пошла на убыль крупная вспышка в Нигерии. Зарегистрированы новые случаи острого паралитического полиомиелита, ассоциируемого с вакцинацией, в
Мозамбике и Эфиопии. Генетически подтверждена циркуляция ВАПВ в Мадагаскаре. ВАПВ циркулирует также в соседней Нигерии. Во всех странах, кроме Мозамбика, ВАПВ был второго серотипа (85%), но циркуляция ВАПВ не является непреодолимым препятствием на пути ликвидации полиомиелита.
ВОЗ определяет следующие пути по предотвращению циркуляции ВАПВ:
1) проведение дополнительных мероприятий по иммунизации в странах с низким уровнем охвата рутинными прививками ОПВ;
2) скорейший переход к двухвалентной ОПВ (серотипы 1 и 3)
3) рациональное использование инактивиро-ванной полиовакцины;
4) мониторинг циркуляции ВАПВ;
5) создание противовирусных препаратов для эффективного лечения острого паралитического полиомиелита, ассоциируемого с вакцинным вирусом.
Источник: MMWR. 2012. V. 61 (37). Р. 741 - 746.
