CC BY
24
В клетках крови и органах млекопитающих уровни вирусоносительства составляли 30-80 % дальневосточного и сибирского типов ВКЭ с единичными случаями европейского типа в зависимости от вида, фазы по-пуляционного цикла и сезона года. Вирусная нагрузка 103-105 копий в органах млекопитающих в 10-100 раз меньше по сравнению с индивидуальными клещами. При этом среди образцов, содержащих РНК и белок Е ВКЭ, патогенный для лабораторных мышей и гемаг-глютинирующий вирус, обнаруживали только у единичных особей грызунов и насекомоядных, но более половины - у клещей. При трансмиссиях ВКЭ от клещей к млекопитающим обнаружены единичные нуклео-тидные замены в генах поверхностных гликопротеинов Е и №1, из которых только часть приводила к аминокислотным заменам из-за вырожденности генетического кода. Наибольшие отличия выявлены для структур З'-нетранслируемой области (З'ЦГГО) генома ВКЭ с множественными делециями около олиго(А)-фрагментов для вариантов вируса, адаптированных к клещам, и более длинными гетерогенными последовательностями для персистирующего ВКЭ от диких млекопитающих. При этом в течение периодов с низкой заболеваемостью людей КЭ преобладали клещевые варианты ВКЭ, а в годы с высокой заболеваемостью - варианты, характерные для млекопитающих.
Анализ иммунного ответа у диких млекопитающих посредством ИФА и реакции подавления гемаг-глютинации (РПГА) показал, что частоты детекции ^М совпадали с антигемагглютининами (АГА) и были существенно меньше, чем IgG. Доля мелких млекопитающих с АГА в крови изменялась по годам от 0 до 28,8±4,5 %. Основной вклад в иммунную прослойку зверьков с АГА к ВКЭ вносят грызуны, среди которых лидирует красная полевка. У насекомоядных большинство лет АГА не
были обнаружены. Наблюдаемые отличия по содержанию вирусспецифических антител между грызунами и насекомоядными соответствовали их участию в прокормлении личинок и нимф клещей. Для ежегодной доли мелких млекопитающих, содержащих АГА, не обнаружено зависимости с динамикой их численности, однако выявлена значимая (р<0,01) положительная корреляция с интенсивностью прокормления преимагина-льных фаз клещей. С учетом временного интервала (1-2 года), который необходим для трансфазовой передачи возбудителя от нимф или личинок к имаго, годовые величины доли животных с АГА коррелировали с гемаг-глютинирующей активностью штаммов ВКЭ, выделенных от клещей, и с заболеваемостью людей (р<0,05) в течение 1980-2006 гг., исключая период 2007-2010 гг.
Таким образом, 30-летний мониторинг природного очага КЭ в окрестностях Новосибирска показал положительную зависимость периодических изменений заболеваемости людей от биологических свойств ВКЭ и параметров паразитарной системы КЭ, обусловленных мелкими млекопитающими, среди которых наиболее значимы:
1) гемагглютинирующая активность и нейрови-рулентность штаммов ВКЭ;
2) длина З'-нетранслируемой области генома ВКЭ;
3) доля мелких млекопитающих с антигемагглю-тининами к ВКЭ;
4) интенсивность прокормления мелкими млекопитающими личинок и нимф клещей.
Показана отрицательная корреляция между заболеваемостью населения КЭ и параметрами паразитарной системы, связанными с клещами, а именно с численностью имаго и их вирусофорностью.
Исследования проведены при поддержке Президиума СО РАН, включая грант №83 (2009-2011 гг.).
ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОГЕННОГО И ЗАЩИТНОГО ЭФФЕКТОВ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА (КЭ) ПО ОТНОШЕНИЮ К СОВРЕМЕННЫМ ШТАММАМ ВИРУСА КЭ
О.В. Морозова, В.Н. Бахвалова*, О.Ф. Потапова*, А.Е. Гришечкин**, Е.И. Исаева** Учреждение Российской академии наук «Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН», Новосибирск,
*Учреждение Российской академии наук «Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН», Новосибирск,
**ФГБУ«НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ
Для специфической профилактики КЭ в России разрешены 6 типов вакцин, полученных инактивацией формалином вируса КЭ (ВКЭ) из первичных культур фибробластов куриных эмбрионов. Вакцины отечест-
венного производства основаны на дальневосточных штаммах ВКЭ, а зарубежного производства - на европейских штаммах, что не соответствует доминирующему в большинстве эндемичных областей России и ближ-
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
Таблица 1
Анализ экспрессии генов ключевых цитокинов в клетках крови мышей ICR после 3-кратной иммунизации 4 вакцинами против КЭ
Экспрессия цитокинов Относительное количество (%) мышей после иммунизации вакцинами с экспрессией гена соответствующего цитокина
ФСМЕ-Иммун (Австрия) «Энцепур» (Германия) «Энцевир» (Томск) ПИПиВЭ Москва
Th1 иммунный ответ (преимущественно клеточный иммунитет)
INFy 11,1±11,1 60,0 ± 16,3 50,0 ± 16,7 10,0 ± 10,0
IL12 66,7±16,6 0 70,0 ± 15,3 20,0 ± 13,3
TNF 22,2± 14,7 30,0 ± 15,3 20,0 ± 13,3 40 ± 16,3
Th2 иммунный ответ (преимущественно гуморальный иммунитет)
IL4 77,8±14,7 44,4± 17,6 100,0 0
IL6 0 0 80,0 ± 13,3 0
IL10 0 0 100,0 100,0
него зарубежья сибирскому генетическому типу. Цель: изучение экспрессии генов цитокинов, иммунного ответа и защитного эффекта 4 вакцин против КЭ по отношению к современным изолятам ВКЭ из природных очагов России.
Вакцины против КЭ «Энцевир» («Микроген», г. Томск) производства предприятия Института полиомиелита и вирусных энцефалитов (ПИПиВЭ) Московской обл., «ФСМЕ-Иммун» («Baxter», Австрия) и «Энцепур взрослый» (Германия) разводили в 10, 32, 100 и 320 раз в среде 199 в соответствии с рекомендациями ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Самок мышей линии BALB/c и самцов мышей ICR весом 14-16 г иммунизировали подкожно 3 раза с интервалами 7 дней между инъекциями. Цито-киновые профили определяли посредством обратной транскрипции (ОТ) с последующей ПЦР с праймерами, соответствующими мРНК интерферона гамма, фактора некроза опухолей, интерлейкинов 4, 6, 10, 12 и 1р в динамике через 1 неделю после 1, 2 и 3-й иммуниза-ций для суммарных РНК, выделенных из клеток 100 мкл крови. Антитела (АТ) из сывороток иммунизированных мышей выявляли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с иммобилизованными антигенами ВКЭ различных генетических типов из инфицированных клеток СПЭВ или из инактивированных вакцин со вторыми АТ, направленными против IgG мыши и конъю-гированными с пероксидазой хрена производства ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ или ЗАО «БиоСан» (г. Новосибирск) и окрашиванием иммунных комплексов в растворе ортофенилендиамина. Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с нативными или формали-низированными эритроцитами гуся проводили с 8 агглютинирующими единицами (АЕ) штаммов ВКЭ различных генетических типов. Реакцию нейтрализации (РН) с 3-4 lg ЦПД50 ВКЭ сибирского типа проводили в присутствии АТ из сывороток крови иммунизированных мышей в последовательных 10-кратных разведениях 1 ч при 37°С с последующим заражением клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) в 96-луночных планшетах и наблюдениями за развитием цитопатического действия (ЦПД). Защитный эффект 4 инактивированных вакцин проверяли у 3-кратно иммунизированных мышей посредством внутрибрюшинного введения 100 ЛД50 ВКЭ (штамм 2689 подтипа Заусаев сибирского ге-
нетического типа, выделенный от иксодового клеща в Новосибирской обл. в 2010 г.).
Несмотря на присутствие клеточных и вирусных белков в различных концентрациях и наличие единичных молекул РНК в составе российских вакцин против КЭ, детектируемых в ОТ-ПЦР с гибридизационно-флу-оресцентной детекцией продуктов реакций в реальном времени, анализ экспрессии генов ключевых цитокинов показал их слабую индукцию, наиболее выраженную для вакцины «ФСМЕ-Иммун» (Австрия), без статистически достоверных изменений в динамике (табл. 1).
Отсутствие выраженной стимуляции цитокиново-го ответа и особенно индукции экспрессии генов фактора некроза опухолей TNF-a и интерлейкина IL-1ß снижает риск развития осложнений после вакцинации (Marth and Kleinhappl, 2002).
В ИФА на АТ класса IgG наиболее высокие титры обнаружены в сыворотках мышей ICR после иммунизации вакциной ПИПиВЭ - к гомологичным антигенам дальневосточного типа ВКЭ средняя геометрическая титров (СГТ) составила 372,2, к гетерологичным антигенам сибирского типа ВКЭ - 199,5 (табл. 2); самые низкие титры - в сыворотках мышей после иммунизации вакциной «Энцепур» (Германия), что соответствует содержанию антигенов ВКЭ в составе этих вакцин.
В РТГА с 8 АЕ боратно-солевого антигена штамма 2689 антигемагглютинины в сыворотках мышей после иммунизации вакцинами «Энцепур» и ПИПиВЭ не были обнаружены, после иммунизации вакциной «ФСМЕ-Иммун» выявлены в 50 % сывороток, а после иммунизации «Энцевир» - в 90 %.
В РН АТ из сывороток мышей, иммунизированных зарубежными вакцинами «ФСМЕ-Иммун» (Австрия) и «Энцепур» (Германия) без разведения и при разведении в 10 раз, нейтрализовали 3 ^ЦПД50 ВКЭ сибирского типа с титрами вируснейтрализую-щих АТ до 1:10 000.
Оценка иммуногенности вакцин против КЭ методами ИФА и РТГА соответствовала результатам анализа протективного эффекта вакцин по отношению к штамму 2689. Наиболее высокий уровень защиты мышей BALB/c обеспечивала вакцина «Энцевир»: минимальная иммунизирующая доза (МИД50), защищающая 50 % мышей при 3-кратном введении, составила менее 0,0016 мл МИД50 московской и австрийской вакцин
Таблица 2
Детекция АТ класса IgG в ИФА с антигеном штамма Айна сибирского типа ВКЭ
Показатели иммуногенности вакцин Вакцина «ФСМЕ-Иммун» (Австрия) Вакцина «Энцепур» (Германия) Вакцина «Энцевир» (Томск) Вакцина ПИПиВЭ (Москва)
Относительное количество ( %) мышей с вирусспецифическими антителами 77,8±14,7 90,0 ±10,0 100,0 100,0
СГТ IgG (min и max обратные значения титров антител) 90,3 (50-200) 58,1 (50-200) 106,9 (50-200) 199,5 (100-400)
находились в допустимом ГИСК интервале от 0,001 мл до 0,017 мл. Для вакцины «Энцепур» МИД50 составила 0,04 мл, что превысило рекомендованные пределы и привело к полной гибели мышей, иммунизированных разведенной в 32, 100 и 320 раз немецкой вакци-
ной, в результате последующего заражения 100 ЛД50 ВКЭ подтипа Заусаев сибирского типа, доминирующего в природных очагах России.
Исследования выполнены при поддержке Междисциплинарного гранта №83 СО РАН.
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ АКАРИЦИДНЫХ ОБРАБОТОК ПРИ КЛЕЩЕВОМ ЭНЦЕФАЛИТЕ
И.В. Фельдблюм, М.Ю. Девятков, Е.В. Касьяненко, И.А. Окунева ГБОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития России, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в Пермском крае, г. Пермь
Клещевой энцефалит (КЭ) - одно из наиболее распространенных природно-очаговых заболеваний, передающихся клещами, на территории России. Актуальность и научно-практическая значимость этой инфекции определяется высоким уровнем заболеваемости, особенно на эндемичных территориях, дорогостоящим лечением, нетрудоспособностью, инвалидностью и смертностью.
Территория Пермского края является активным очагом трансмиссивных природно-очаговых инфекций, где заболеваемость КЭ превышает российские показатели в 3-10 раз, в зависимости от интенсивности эпидемического процесса в различные годы. Ежегодно регистрируется от 200 до 800 случаев КЭ. Летальность колеблется в отдельные годы от 0,98 до 1,9 %. Экономический ущерб при КЭ ежегодно по краю составляет от 5 до 21 млн рублей.
Целью настоящего исследования явилась эпидемиологическая оценка значения акарицидных обработок в профилактике КЭ.
Материалы и методы. Работа выполнена на базе ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в Пермском крае. Анализ проявлений эпидемического процесса КЭ проведен по данным официальной регистрации за 19532010 гг. Объемы проведенных акарицидных обработок оценивались по территории в целом и на отдельных микроучастках по данным отчетной формы № 27 за 2007-2010 гг. Влияние акарицидных обработок на за-
болеваемость КЭ изучалось при помощи корреляционно-регрессионного анализа. Статистическая обработка проведена с использованием методов параметрической статистики.
Результаты исследования. Заболеваемость КЭ в Пермском крае с 1953 по 2010 гг. характеризовалась неравномерностью распределения по годам и колебалась от 4, 24 на 100 тыс. в 1973 г. до 40, 7 в 1996 г. Среднемноголетний показатель составил 16,0 на 100 тыс. населения. Установлен цикличный характер активности изучаемого природного очага: 13-летний (19571970 гг.) период значительной эпидемической напряженности со среднемноголетним показателем 22,37 ± 1,8 на 100 тыс. населения сменился 20-летним периодом (1971-1989 гг.) снижения его активности. Средне-многолетний показатель составил 9,98 ± 1,2 на 100 тыс. населения. В 1990-2003 гг. вновь наблюдался подъем заболеваемости КЭ со среднемноголетним показателем 19,63±0,7 на 100 тыс. населения. Период 2004-2010 гг. характеризовался снижением интенсивности эпидемического процесса со среднемноголетним показателем 7,2±1,2 на 100 тыс. населения.
Внутригодовая динамика заболеваемости КЭ характеризовалась выраженной весенне-летней сезонностью. Первые случаи заболеваний наблюдались, как правило, в конце апреля, максимальная обращаемость населения по поводу присасываний клещей и наибольший уровень заболеваемости имели место в мае, по-
