CC BY
7
УДК 57.088
Юдина А.Н., Красноштанова А.А.
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЖЕЛТОЧНЫХ БЕЛКОВ Юдина Алеся Николаевна - магистрант 2-го года обучения кафедры биотехнологии; a.n.yudina@yandex.ru. Красноштанова Алла Альбертовна - доктор химических наук, доцент, профессор кафедры биотехнологии; aak28@yandex.ru.
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
В статье рассмотрены функциональные свойства обезжиренного желточного остатка, полученного в результате поэтапного выделения IgY и лецитина из яичного желтка. Рассмотрена возможность использования данного субстрата в качестве перспективного компонента питательной среды для выращивания бактерий р. Bacillus.
Ключевые слова: желточные белки, функциональные свойства, яичный лецитин, IgY
FUNCTIONAL PROPERTIES OF EGG YOLK PROTEIN BY-PRODUCTS
Yudina A.N., Krasnoshtanova A.A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
The article discusses functional properties of lipid-free yolk by-product obtained after two-step procedure of IgY and lecithin isolation from egg yolk. It was proposed the ability of its application as a prospective substrate for nutritive medium to grow bacterium p. Bacillus.
Key words: egg yolk proteins, functional properties, egg lecithin, IgY
Введение
Желточные белки составляют 16-17% от общей массы желтка и являются его важными компонентами. Белки в желтке образуются из печени и транспортируются в яичники в связанном с липидами состоянии. Фосвитин и липовителлин являются двумя основными белками желтка, которые образуются при гидролизе вителлогенина и играют решающую роль в связывании металлов для обеспечения микроэлементами эмбриона [1-3]. Яичный желток является одним из наиболее распространенных источников для извлечения лецитина, широко используемого в пищевой промышленности и косметологии. После извлечения лецитина остается белковая часть желтка, представляющая дополнительный интерес в рамках комплексной переработки яичных компонентов. Желточные белки, благодаря разнообразному составу, обладают множеством полезных свойств, среди которых можно выделить антиоксидативную, противовоспалительную, иммуномодулирующую и антибиопленочную активности [4]. В литературе встречаются данные о возможности получения биологически активных пептидов на основе гидролизатов обезжиренного желточного белка. Следствием протеолитического действия ферментов является изменение молекулярной конформации нативного белка и получение функциональных и биологически активных продуктов, которые широко используются в питании в качестве добавок к напиткам и детским смесям, фармацевтических ингредиентов и улучшителей консистенций пищевых продуктов. Свойства таких продуктов, главным образом, зависят от степени гидролиза исходных белков. Так, к примеру, такие функциональные свойства, как растворимость, гелеобразование, жиро-
и водоудерживающая способности (ВУС, ЖУС), эмульгирующая (ЭС) и пенообразующая (ПС) способности, наиболее четко наблюдаются после проведения неполного (ограниченного) гидролиза. Белковые гидролизаты с низкой степенью гидролиза (<10%) применяют в пищевой промышленности в качестве улучшителей консистенции продуктов питания, глубоко гидролизованные белковые изоляты применяют как протеиновые добавки или специализированное диетическое питание [8-12].
Однако яичные белки, полученные после проведения процедуры экстракции лецитина органическим растворителем из желтка, характеризуются узким диапазоном биологической и функциональной ценности ввиду процессов денатурации. Исходя из полученных результатов, было установлено, что из постэкстракционного желточного белка не является возможным извлечь биологически ценный компонент IgY, так называемые желточные антитела, общее содержание которых превышает 100 мг на одно куриное яйцо [5]. Иммуноглобулины Y широко используются в последние десятилетия в качестве средства для эффективной иммунодетекции биомолекул in vivo. Благодаря многообещающим новым подходам существует перспектива для дальнейшего использования IgY-технологии по функциональным, практическим и этическим соображениям, связанным с уникальными свойствами IgY, высокоэффективным выделением большого количества специфических IgY из яичного желтка и отсутствием причиняющей вред процедуры забора крови у животных [6].
Сегодня IgY используются для лечения бактериальных и вирусных инфекций. Желточные антитела обладают хорошей переносимостью и могут входить в состав рациона диетического питания для
людей, страдающих аллергией на яичный белок, поскольку очищенные 1§У не содержит остаточных следов яичного альбумина. Системное местное введение 1§У способно оказывать профилактическое действие в отношении таких заболеваний как ротовирусная инфекция, трансмиссивный
гастроэнтерит свиней (ТГЭС), пародонтит, синегнойная инфекция, язвенная болезнь, гастрит, короновирусная инфекция (СОУШ-19) и др.
Данное основание послужило причиной разработки комплексной технологии,
предполагающей поэтапное выделение биоактивных субстанций из яичного желтка, минуя риски их деструкции под действием органических растворителей. В результате проведения процедуры извлечения 1§У из яичного желтка был получен липидно-протеиновый матрикс, из которого впоследствии выделили лецитин, а на заключительном этапе проводили исследования по установлению набора функциональных свойств, присущих обезжиренному желточному белку, не содержащему 1§У.
Таким образом, целью данного исследование является изучение функциональных свойств протеинового остатка, полученного после извлечения 1§У и лецитина из яичного желтка.
Экспериментальная часть
В качестве объекта исследования в работе были использованы куриные яйца, обладающие соответствующими техническими требованиями ГОСТа 31654-2012: влажность - 84%, содержание жира в желтке - 32,6%, сырого протеина в белке -10,6%, в желтке - 16,6%, фосфолипидов в желтке -29,6%.
Согласно предыдущим исследованиям первоначально проводили этап извлечения 1§У, подразумевающий проведение специфической преципитации водорастворимой фракции (ВФ), содержащей 1§У, солями хлорида натрия. Так, нативную желточную массу смешивали с эквивалентным объемом фосфатного солевого буфера (рН 7,4), после чего полученную смесь в 7 раз разбавляли доведенной до рН 5,0 дистиллированной водой. Далее желточный раствор замораживали при -200С в конической воронке. По истечение времени замораживания твердую желточную массу оставляли при комнатной температуре для индуцирования процесса самопроизвольного оттаивания через складчатый фильтр, чтобы декантировать липиды и липоподобные соединения посредством фильтрации. В результате процедуры получили прозрачную водорастворимую фракцию (ВФ), далее подвергаемую специфической преципитацией солями хлорида натрия в концентрации 10 мас %, а также задержанный на фильтре липидно-протеиновый матрикс. Солевую водорастворимую фракцию (ВФ) далее очищали и концентрировали путем ультра- и диафильтрации. В итоге получили 1§У-содержащий концентрат с содержанием белка не менее 12 г/л и чистотой фракции 98% [13-15]. Концентрацию белка
в растворе измеряли посредством
колориметрического биуретового метода, а чистоту фракции (отсутствие растворенных солей и примесей) - с помощью метода определения сухого веса образца [17].
Содержание общих жиров в липидно-протеиновом матриксе определяли методом Сокслета [17]. Было установлено, что в липидно-протеиновом матриксе на долю липидных и липоподобных соединений приходится около 38%. Методами инфракрасной спектрометрии и тонкослойной хроматографии было доказано присутствие фосфолипидов в составе матрикса [18]. Именно поэтому вторым этапом работы было решено провести комбинированную ацетоново-спиртовую экстракцию фосфолипидных компонентов, после которой был получен обезжиренный желточный остаток. Микрометодом Къельдаля [17] было определено в его составе общее содержание белка, равное 18,3%.
Полученный желточный остаток после высушивания при комнатной температуре был проверен на наличие следующих функциональных свойств: влагоудерживающая (ВУС),
жироудерживающая (ЖУС), эмульгирующая (ЭС) и пенообразующая (ПС) способности по стандартным методикам [17]. ВУС определяли, исходя из количественной способности воды адсорбироваться в массе исследуемого веществ. ЖУС
идентифицировали как максимальное количество добавляемого масла, при котором не наблюдается отделение масляной фазы в процессе испытания. ЭС рассматривали как разницу в удерживании веществом воды и масла в процессе испытания. Для определения ПС определяли высоту столба пены, формирующейся при падении водного раствора исследуемого образца в мерный цилиндр.
Из полученных результатов следует, что максимальное значение ЖУС (г масла/ г белка) равно 0,86.
Данное соотношение определяет отличный показатель ЖУС для применения желточного белка при производстве мясных изделий в качестве регулятора консистенции.
Максимальное значение ВУС (г воды/г белка) составляет 2,3. Данное свойство особо ценно при изготовлении колбас, поскольку от обеспечения гидратации мяса зависят сочность, нежность и вкус продукта.
При исследовании эмульгирующей способности желточного остатка было установлено что его ЭС равна 30%, что в 3 раза выше данного показателя для пшеничных белков. Пенообразующей способностью исследуемая субстанция не обладает.
Таким образом, полученный желточный остаток обладает потенциалом функциональных свойств и может быть применен в качестве эмульгатора для пищевой и кормовой промышленности, способного снизить энергию ПАВ, затрачиваемую на фазовое разделение несмешивающихся фракций.
Другим отличительным свойством такого субстрата является его питательная ценность за счет сравнительно высокого содержания сырого протеина (около 18,3%) по сравнению с другими возможными белок-содержащими полупродуктами смежных производств. Так, на его основе возможно изготовить питательные среды, широко используемые в биотехнологической практике. В частности, заменить доброкачественное мясо крупного рогатого скота, используемое при приготовлении мясо-пептонного бульона (МПБ) на протеиновый желточный остаток.
Для изучения биологических свойств полученного желточного остатка использовали культуру Bacillus megaterium 3750 из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева. Из полученного желточного белка готовили питательную среду, обладающую характерным яичным запахом и слабоопалесцирующую по внешнему виду в сравнении с контрольной средой МПБ. Для этого вышеуказанный желточный остаток разводили дистиллированной водой до содержания аминного азота 100 мг%. В состав разведенной питательной основы включали 0,5% хлорида натрия и доводили рН до значения 7,6. Готовые питательные среды стерилизовали в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин. Посевной материал вносили в жидкие питательные среды в количестве 1%. Культивирование вели при оптимальной температуре роста 37±2°С в течение 24-48 часов. Параметры кинетики роста культуры микроорганизма определяли по характеру роста в жидких средах путем измерения оптической плотности.
Кривая роста микроорганизмов Bacillus megaterium 3750 на жидкой среде, содержащей желточный белок, и на МПБ представлена на рисунке 1.
О 5 10 15 20 25 30 35
время, ч
■ котроль —А— проба Рисунок 1. - Кривые роста микроорганизма Bacillus megaterium 3750 на жидкой среде МПБ (контроль) и среде, содержащей желточный белок (проба)
Из полученных результатов следует, что при культивировании бактерий р. Bacillus на среде, содержащей желточный белок, наблюдается значительное сокращение продолжительности лаг-фазы в сравнении с контрольной пробой (с 12 до 1-2 ч). Кроме того, на исследуемой среде наблюдается более высокая скорость роста и накапливается большее количество биомассы. Все это доказывает перспективность замены МПБ на желточный белок.
При этом удельная скорость роста ц составляет 0,07 ч-а время генерации g равно 9,9 ч. Для контрольной пробы, данные параметры равны 0,09 ч-1 и 7,7 ч, соответственно. Однако по сравнению с контрольной пробой, исследуемая среда позволяет больше накопить биомассы и обладает существенно менее длительной лаг-фазой, поэтому ее использование является перспективной.
Заключение
Поиск возможностей для применения обезжиренного желточного остатка является частью разработки технологии глубокой переработки сырья с целью получения биологически ценных компонентов, что позволит повысить рентабельность и экономическую эффективность предприятия. В ходе исследования была проверены функциональные свойства желточного остатка. Среди наиболее ярко-выраженных свойств особо выделить ЭС, ВУС и ЖУС. Данные свойства способны позиционировать полученный полупродукт как потенциальный ингредиент в производстве мясных продуктов для выравнивания консистенции и придания желаемых реологических характеристик. В то же время протеиновый остаток желтка может являться отличным субстратом для роста бактерий p. Bacillus.
Список литературы
1. Каплин В.С., Каплина О.Н. IgY-технологии в медицине. Желточные антитела птиц в иммунотерапии // Международные обзоры: клиническая практика и здоровье. - 2016. С. 59-75
2. Каплин В.С., Каплина О.Н. IgY-технологии. Желточные антитела птиц // Биотехнология, 2017. -Т.33 №2. С. 29-40
3. Комарова З.Б. Получение пищевых яиц с заданными функциональными свойствами / З.Б. Комарова, С.М. Иванов, Д.Н. Ножник, О.П. Шахбазова // Известия Нижневаторского агроуниверситетсткого комплекса. Сер. 28, Зоотехния и ветеринария. - 2012. - №4. С. 1-4
4. Lee, J. H., Lee, Y., Paik, H. D., & Park, E. Antioxidant and Immune-Modulating Activities of Egg Yolk Protein Extracts. Food science of animal resources. -2022, No 42, Vol.2. P.321-331
5. Wei Nie, Chao Zhao, Xiaoxiao Guo et. al. Preparation and identification of chicken egg yolk immunoglobulins against human enterovirus 71 for diagnosis of hand-foot-and-mouth disease. Analytical Biochemistry. - 2019. Vol.573. P. 44-50
6. Karachaliou, C. E., Vassilakopoulou, V., & Livaniou, E. IgY technology: Methods for developing and evaluating avian immunoglobulins for the in vitro detection of biomolecules. World journal of methodology. - 2021. No.11. Vol.5. P.243-262
7. Zambrowicz, A., D^browska, A., Bobak, L., & Szoltysik, M. Egg yolk proteins and peptides with biological activity. Postepy higieny i medycyny doswiadczalnej. - 2014. Vol.68. P.1524-1529
8. Lee, J. H., Lee, J. E., & Paik, H. D. Immunomodulatory activity of egg yolk protein
hydrolysates prepared by novel two-step hydrolysis: A study of mechanism and stability after in vitro digestion model. Poultry science. - 2022. Vol. 101. No.5
9. White, H. B., Dennison, B. A., Della Fera, M. A., Whitney, C. J., McGuire, J. C., Meslar, H. W., & Sammelwitz, P. H. Biotin-binding protein from chicken egg yolk. Assay and relationship to egg-white avidin. The Biochemical journal. - 1976. No.157 Vol.2 P.395-400
10. Lilienthal, S., Drotleff, A. M., & Ternes, W. Changes in the protein secondary structure of hen's egg yolk determined by Fourier transform infrared spectroscopy during the first eight days of incubation. Poultry science. 2015. No. 94. Vol.1. P.68-79
11. Xiao, J., Wang, J., Cheng, L., Gao, S., Li, S., Qiu, N., Li, H., Peng, L., & Geng, F. A puzzle piece of protein N-glycosylation in chicken egg: N-glycoproteome of chicken egg vitelline membrane. International journal of biological macromolecules. - 2020. No.164. P.3125-3132
12. Muniyappa, K., & Adiga, P. R. Nature of the thiamin-binding protein from chicken egg yolk. The Biochemical journal. - 1981. No.193. Vol.3 P.679-685
13. Юдина А.Н., Красноштанова А.А. Выбор оптимальной схемы выделения иммуноглобулинов из желтка яиц сельскохозяйственной птицы. «Биохимическая физика», Москва, 2019, с. 247-250.
14. Юдина А.Н., Красноштанова А.А. Способы выделения иммуноглобулинов из желтка яиц сельскохозяйственной птицы. сб. «Успехи в химии и химической технологии», РХТУ им. Д. И. Менделеева Москва, 2019, том 33, с. 49-50.
15. Юдина А. Н., Красноштанова А. А. Способ селективного выделения и очистки иммуноглобулинов (IgY) из желтка яиц сельскохозяйственной птицы // Успехи в химии и химической технологии. Сборник трудов XVI Международного конгресса по химии и химической технологии. — Т. 11 из 34. — РХТУ им. Д.И. Менделеева Москва, 2020. — С. 21-23.
16. Кусакина М.Г., Суворов В.И., Чудинова Л.А. Большой практикум «Биохимия». Лабораторные работы:
учеб. Пособие - Перм. гос. нац. исслед. ун-т.-Пермь, 2012, с. 5-11.
17. Юдина А.Н., Красноштанова А.А. Процесс выделения лецитина из желтка яиц сельскохозяйственной птицы при их комплексной переработке // Биохимическая физика. - 2020. - 16-17 ноября.
