CC BY
243
УДК 547.814.5:577.152.1
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА В.В. Рогожин, Д.В. Перетолчин, Т.В. Рогожина
Якутская государственная сельскохозяйственная академия,
Республика Саха, 677002 г. Якутск, ул. Красильникова,15, vrogozhin@mail.ru.
Методами электронной спектроскопии изучено поглощение транс- и цис-форм дигидрокверцети-на в водно-спиртовых (0-96%) и буферных растворах (рН 4,5-8,0). Установлены максимумы поглощения дигидрокверцетина в зависимости от природы раствора. Методами стационарной кинетики изучены реакции пероксидазного окисления дигидрокверцетина, катализируемые перокси-дазой хрена. Показано, что дигидрокверцетин является медленно окисляемым субстратом перок-сидазы хрена. В водно-спиртовых и буферных растворах выявлены две изоформы дигидрокверцетина (цис- и транс-форма), которые избирательно участвуют в реакциях пероксидазного окисления. В интервале рН 4,5-8,0 определены величины kкат и Km для этого субстрата пероксидазы. Ил. 6. Табл. 1. Библиогр. 22 назв.
Ключевые слова: дигидрокверцетин, кверцетин, антиоксидант, пероксидаза хрена, ферментативный катализ.
RESEARCH OF PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES OF DIHYDROQUERCETIN V. V. Rogozhin, D. V. Peretolchin, T.V.Rogozhina
Yakut State Agricultural Academy,
15, Krasilnikov St., Yakutsk, Russia, vrogozhin@mail.ru.
Absorption of trans and cis forms of dihydroquercetin in water-alcohol (0-96 %) and buffer solutions (рН 4,5-8,0) by the methods of electronic spectroscopy was studied. Maxima of dihydroquercetin absorption, depending on the nature of a solution are found. The steady-state kinetics of horsersdish peroxidase catalyzed dihydroquercetin oxidation was studied. Dihydroquercetin was shown to be a slowly oxidized substrate of horsersdish peroxidase. Two dihydroquercetin isoforms (trans and cis forms) that were selectively in-
volved in peroxidase-induced oxidation were found in water-alcohol and buffer solutions. The kcat and K were determined in the pH range of 4,5-8,0. 6 figures. 1 table. 22 sources.
Keywords: dihydroquercetin, quercetin, antioxidant, horsersdish peroxidase, enzyme catalysis.
m
ВВЕДЕНИЕ
Дигидрокверцетин (ДГКВ) относится к группе фенольных соединений, обладающих высокой антиоксидантной активностью [1]. ДГКВ тормозит процессы перекисного окисления липидов клеточных мембран, препятствует повреждающему действию свободных радикалов, замедляет преждевременное старение клеток и развитие различных заболеваний. Основным сырьем для получения ДГКВ в промышленных масштабах служит древесина лиственницы сибирской ^апх sibirica Ledeb) и лиственницы даурской ^апх da-hurica Тигсг). Древесина лиственницы содержит до 2,5% флавоноидов, среди которых на долю ДГКВ приходится до 90-95% от общей суммы флавоноидов [2, 3].
Дигидрокверцетин широко используется в медицинской, пищевой, фармацевтической и парфюмерной промышленности [4-7]. Как консервант ДГКВ добавляется в сухое молоко, кондитерские изделия, масло и др. Для проявления антиоксидантного действия ДГКВ вносят в различные мази. В лечебной практике ДГКВ используется как противовоспалительное, антирадиационное, онкопротекторное средство. Назначают ДГКВ перорально для уменьшения проницаеми-сти и ломкости капилляров, при атеросклерозе, профилактике инсульта и инфаркта. ДГКВ улучшает коронарный кровоток, сократимость миокарда, понижает инфицирование сердечной мышцы. Используется флавоноид при лечении ревматизма, септическом эндокардите, вегето-сосудистой дистонии. При длительном приеме ДГКВ предупреждает обострение хронических заболеваний органов дыхания и возникновение ОРВИ. Способствует поддержанию функций иммунной системы, оказывает антитоксическое действие. Обладает гастропротективной активностью: стимулирует процессы регенерации слизистой оболочки желудка, предотвращает развитие и способствует заживлению язвы желудка и двенадцатиперстной кишки [6, 7].
В растворе с аскорбиновой кислотой фла-воноиды способны защитить витамин С от окисления [8]. ДГКВ хорошо растворим в полярных растворителях и в водно-спиртовых растворах, особенно при нагревании. В растворах ДГКВ может присутствовать в транс- и цис-формах [9]. Причем транс-форма флаванона более химически активна. Продуктом окисления ДГКВ является кверцетин [10]. Существует несколько методов получения кверцетина из ДГКВ, в частности методом бисульфитной делигнификации [10, 11]. Процесс протекает в присутствии бисульфита
магния при ступенчатом подъеме температуры от 80 до 160 оС. Этот метод позволяет в течение 4,5-6,5 ч превратить 95-98% ДГКВ в кверце-тин [12]. Кроме того, описан метод окисления ДГКВ в кверцетин в присутствии сернисто-кислого натрия при температуре 220 оС и давлении 3,5-4,5 МПа, осуществляемый в течение 3,5-4,5 мин [13]. Все перечисленные выше методы окисления ДГКВ в кверцетин имеют существенный недостаток, который обусловлен высокими энергетическими затратами при проведении окислительной реакции.
Цель данной работы - изучение физических и химических свойств дигидрокверцетина и разработка метода ферментативного окисления ДГКВ в присутствии пероксидазы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали дигидрокверцетин научно-производственной фирмы «Флавин» (Россия), 95-98% чистоты. Пероксидаза хрена производства <^еапа!» (Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ = 1,0. Концентрацию фермента определяли спектрофотометри-чески при 403 нм (е403 = 100 мМ-1см-1 [14]) и пири-дингемохромогену [15]. Концентрацию перекиси водорода ("Реахим", Россия) определяли спек-трофотометрически, используя молярный коэффициент поглощения при 230 нм 72,7 М-1 см-1 [16]. Остальные реактивы соответствовали квалификации ос.ч. Для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду.
Электронные спектры ДГКВ записывали в области 200-400 нм в кварцевых кюветах (толщина кюветы 1 см). В сравнении использовали водно-спиртовый раствор или буфер с определенным рН.
Реакцию пероксидазного окисления дигидрокверцетина (170-680 мкМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 25° в среде 0,1 М №-ацетатного (рН 4,5-6,0) или №-фосфатного (рН 6,0-8,0) буфера, объемом 2,5 мл с участием пероксидазы хрена в концентрации 18-180 нМ.
Спектры и кинетические кривые окисления дигидрокверцетина регистрировали на двухлу-чевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы Varian (США). За образованием продукта окисления дигидрокверцетина наблюдали по возрастанию поглощения при 405 нм. За единицу активности фермента принимали количество мкмоль дигидрокверцетина, окисленного за 1 мин. Кажущиеся константы скорости окисления дигидрокверцетина определяли из данных по стационарной кинетике. Расчет каталитических
констант производили, используя прикладные программы ферментативной кинетики.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
На рис. 1 показаны спектры дигидрокверце-тина в зависимости от рН среды. Видно, что при варьировании рН от 4,5 до 8,0 в спектрах дигид-рокверцетина проявляются три максимума поглощения в УФ-области при 230, 290 и 327 нм, которые характерны для двух изоформ флаво-ноида. Каждая из изоформ имела выраженный максимум поглощения при рН 4,5 и 8,0, которые соответствуют цис- и транс-формам дигидро-кверцетина, проявляемые соответственно в кислой и щелочной областях рН. Переход одной изоформы в другую осуществляется через две изобестические точки при 265 и 305 нм.
При изменении полярности среды в спектрах дигидрокверцетина проявляются два мак-
симума поглощения при 290 и 327 нм, варьирование которой достигалось за счет увеличения содержания этанола (рис. 2). На рис. 2 показаны спектры дигидрокверцетина в отсутствие (рис. 2, кривая 1) и в присутствии этанола (рис. 2, кривые 2-6).
В воде дигидрокверцетин имеет максимум поглощения при 327 нм, а в 16,4 М растворе этанола максимум поглощения проявляется уже при 290 нм. При этом переход одной изоформы в другую, осуществляется через изобестическую точку при 305 нм.
Наличие характерных максимумов поглощения для транс- и цис-форм ДГКВ, позволил нам рассчитать для них коэффициенты молярного поглощения при различных рН и концентрациях водно-спиртового раствора (рис. 3 и 4).
Рис. 1. Спектры поглощения дигидрокверцетина в различных буферных растворах в зависимости от рН: 1 - 4,5; 2 - 5,0; 3 - 5,5; 4 - 6,0; 5 - 6,5; 6 - 7,0; 7 - 7,5; 8 -
Концентрация дигидрокверцетина 36 мкМ
8,0.
Рис. 2. Спектры поглощения дигидрокверцетина в зависимости от содержания в исследуемом водно-спиртовом растворе этилового спирта, М:
1 - 0; 2 - 1,7; 3 - 3,4; 4 - 5,1; 5 - 8,6; 6 - 16,4. Концентрация дигидрокверцетина 36 мкМ
Рис. 3. Зависимости коэффициентов молярного поглощения дигидрокверцетина от рН при длине волны 290 (1) и 327 нм (2). Концентрация дигидрокверцетина 36 мкМ
Рис. 4. Зависимости коэффициентов молярного поглощения дигидрокверцетина от концентрации этилового спирта при длине волны 290 (1) и 327 нм (2). Концентрация дигидрокверцетина 36 мкМ
При этом точка пересечения кривых рН-зависимости приходилась на рН 6,6, а водно-спиртового раствора на - 35%. Таким образом, буферная среда при рН 6,6 и водно-спиртовой раствор в 35%, служат показателями перехода изоформ дигидрокверцетина.
Пероксидаза и флавоноиды, в том числе ди-гидрокверцетин и кверцетин, относятся к компонентам антиоксидантной системы. В живых организмах они выполняют антиоксидантные и про-оксидантные функции [17]. Следует отметить, что только совместное деятельность высоко- и низкомолекулярных антиоксидантов, обеспечивает их действие по подавлению образования активных форм кислорода и других свободных радикалов [18]. При этом низкомолекулярные
антиоксиданты могут быть субстратами ферментов, участвуя в каталитических реакциях, протекающих в присутствии пероксидазы [19]. В данной работе изучили реакции окисления ДГКВ в присутствии пероксидазы. Показано, что в процессе пероксидазного окисления в спектре поглощения дигидрокверцетина появляется максимум поглощения при 400-405 нм (рис. 5).
Аналогичные изменения мы наблюдали и при других рН. Интересно, что максимум поглощения всегда приходился на 405 нм. В отсутствие фермента реакция не наблюдалась. Поэтому определение скорости пероксидазного окисления дигидрокверцетина в присутствии пе-роксидазы хрена проводили, регистрируя увеличение поглощения светопоглощения при 405 нм.
Рис. 5. Спектры поглощения продукта пероксидазного окисления дигидрокверцетина от времени
реакции: 0 (1), 2 (2), 5 (3), 15 (4), 30 (5), 60 мин (6). Концентрация пероксидазы - 18 нМ; Н2О2 - 0,64 мМ; дигирокверцетина -120 мкМ, рН 8. Скорость
сканирования 100 нм/мин
Продуктом окисления ДГКВ является квер-цетин, имеющий при этой длине волны молярный коэффициент поглощения равный 14 мМ-1см-1 [20], который и был использован нами при расчетах скоростей ферментативных реакций. Следует отметить, что при 405 нм поглощение дигидрокверцетина было минимально и им можно было пренебречь.
На рис. 6 показаны зависимости начальных скоростей окисления дигидрокверцетина от его концентрации при рН 4,5-8,0. Спрямление этих кривых в двойных обратных координатах Лай-нуивера-Берка позволяет сделать вывод, что пероксидазное окисление дигидрокверцетина подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Отдельными экспериментами было показано, что дигидрокверцетин не является оксидазным субстратом пероксидазы. В таблице приводятся величины каталитических констант для перокси-дазного окисления дигидрокверцетина. Видно, что реакции пероксидазного окисления дигидрокверцетина характеризуются низкими величинами ^ат (1,26-293,2 с-1) и достаточно высокими
значениями ^ (0,68-1,66 мМ) в зависимости от рН.
Из полученных значений кинетических констант (^ат и видно, что дигидрокверцетин можно отнести к группе медленно окисляемых субстратов пероксидазы хрена, скорость окисления которого возрастает в щелочной области рН. При этом продуктом окисления является кверце-тин, имеющий желтую окраску и за счет этого проявляется его поглощение при 400-420 нм.
В пероксидазных реакциях промежуточные радикалы субстратов пероксидазы, образованные в реакции с окисленной формой фермента (Е1), восстанавливают образовавшийся Е2 до нативного фермента [21]. При проведении этой реакции в среде обычно не обнаруживаются свободные радикалы, поэтому предполагается комплексообразование Е2 с радикалом полуокисленного субстрата. Образовавшийся радикал может не выходить в раствор, а оставаться на ферменте, образуя фермент-субстратный комплекс.
Рис. 6. Зависимость скорости пероксидазного окисления дигидрокверцетина от его концентрации при рН 4,5 (1), 5,0 (2), 5,5 (3), 6,0 (4), 6,5 (5), 7,0 (6), 7,5 (7) и 8,0 (8); пероксидаза - 180 нМ (рН 4,5-6,0) и 18 нМ (рН 6,5-8,0); перекись водорода - 0,64 мМ; дигидрокверцетин - 170-680 мкМ
Таблица
Величины каталитических констант пероксидазного окисления дигидрокверцетина_
рН Vm, мкМмин"' kcat, мин"' kcat, c Km, мМ
4,5 13,6 75,6 1,26 1,27
5,0 14,4 80,0 1,33 0,89
5,5 35,9 199,4 3,32 1,58
6,0 132,9 738,3 12,32 1,66
6,5 117,3 6516,7 108,64 1,19
7,0 228,2 12677,8 211,33 1,03
7,5 316,7 17594,4 293,25 0,95
8,0 184,7 10261,1 171,01 0,68
Высказывается предположение [22], что комплекс пероксидазы с полуокисленным субстратом может быть частицей, эффективно окисляющей другие субстраты пероксидазы при их совместном присутствии, что приводит к активации окисления второго субстрата.
Кроме того, каталитический процесс может зависеть от присутствия дигидрокверцетина в одной из изоформ (транс- или цис-форма), которые могут проявляться в зависимости от рН и полярности среды. При этом в пероксидазной реакции принимает участие преимущественно транс-форма дигидрокверцетина, наблюдаемая в щелочной области рН.
ВЫВОДЫ
1. Методами электронной спектроскопии показано, что транс- и цис-формы дигидрокверце-тина имеют характерные максимумы поглощения при 290 и 327 нм в водно-спиртовых (0-96%) и
буферных растворах (рН 4,5-8,0). Переход одной изоформы в другую осуществляется через две изобестические точки при 265 и 305 нм.
2. Установлено, что реакцию пероксидазного окисления дигидрокверцетина способна катализировать пероксидаза хрена. При этом дигид-рокверцетин проявил себя как медленно окисляемый субстрат пероксидазы, скорость окисления которого максимальна при рН 7,0-8,0.
3. В водно-спиртовых и буферных растворах выявлены две изоформы дигидрокверцетина (цис- и транс-форма), которые избирательно участвуют в реакциях пероксидазного окисления. В интервале рН 4,5-8,0 определены величины ккат и Кт для этого субстрата пероксидазы.
4. Данные стационарной кинетики перокси-дазного окисления дигидрокверцетина могут быть использованы при разработки метода промышленного получения кверцетина ферментативным способом при участии пероксидазы.
1. Демин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Антиоксидантное действие дигидрокверцетина и рутина в пероксидазных реакциях, катализируемых цитохромом с // Вестн. моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2008. Т. 49. С. 354-360.
2. Тюкавкина Н.А., Лаптева К.И., Медведева С.А. Фенольные экстрактивные вещества рода Larix // Химия древесины. 1973. Вып. 13. С. 3-17.
3. Бабкин В.А., Остроумова Л.А., Дъячкова С.Г., Святкин Ю.К., Бабкин Д.В., Онучина Н.А. Безотходная комплексная переработка биомассы лиственницы сибирской и даурской // Химия в интересах устойчивого развития. 1997. № 5. С. 105-115.
4. Тюкавкина Н.А., Руденко И.А., Колесник Ю.А. Природные флавоноиды как биологические антиокси-данты и биологически активные добавки // Вопросы питания. 1996. № 2. С. 33-38.
5. Тюкавкина Н.А., Руденко И.А., Колесник Ю.А. Дигидрокверцетин - новая антиоксидантная и биологически активная добавка // Вопросы питания. 1997. № 6. С. 12-15 .
6. Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Плотникова Т.М. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск, 2005. 245 с.
7. Щукина О.Г., Юшкова Г.Г., Черняк Ю.И. Исследование процессов пероксидации в организме животных при пероральном введении дигидрокверцетина // Сибирский медицинский журнал. 2008. № 4. С. 46-48.
8. Harper K.A, Morton A.D., Roffe E. Phenolic compounds of black currents juice and their protective action
:СКИЙ СПИСОК
on ascorbic acid. Mechanism of oxidation of ascorbic acid and its inhibition by flavonoids // J. Food. Technol. 1969. Vol. 4. P. 255-256.
9. Turnbull J.J., Sobey W.J., Aplin R.T., Hassan A., Firmin J.L., Schofield C.J., Prescott A.G. Are anttocya-nidins the immediate products of anthocyanidin synthase? // Chem. Commun.. 2000. Vol. 24. P. 2473-2474.
10. Gregory A.S. Process for the conversion of dihy-droquercetin to quercetin // Patent US. 2890225. 1959.
11. Kurth E.F. Converting of dihydroquercetin to quercetin // Patent US. 2744920. 1956.
12. Исследование взаимодействия дигидроквер-цетина с раствором бисульфита магния/ Бобров А.И. [и др.] // Химия древесины. 1971. № 10. С. 85-90.
13. Получение кверцетина из древесины лиственницы сибирской в условиях «взрывного» автогидролиза в присутствии сернистокислого натрия / Кузнецов Б.Н. [и др.] // Химия растительного сырья. 2003. № 4. С. 37-41.
14. Ogawa S., Shira Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme environmental structure // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. Vol. 90. P. 674-678.
15. Falk J.E. Porphyrins and Metalloporphy-rins//Amsterdam.-N.Y.-London etc.: Elsevier, 1964.
16. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome C peroxidase and horseradish peroxidase:-.Titration with reducing agents // Biocem. J. 1953. Vol. 54. P. 267-276.
17. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., 1972. 252 с.
18. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи соврем. биол. 1993. Т. 113. С. 442-455.
19. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент ан-тиоксидантной системы живых организмов. СПб., 2004. 240 c.
20. Zsila F., Bikadi Z., Simonyi M. Probing the binding of the flavonoid, quercetin to human serum albumin by circular dichroism, electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods // Biochem. Pharmacol. 2003. Vol. 65. P. 447-456.
21. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Совместное окисление ферроцианида калия и о-дианизидина перекисью водорода, катализируемое пероксидазой хрена. Субстрат-субстратная активация // Биохимия. 1981. Т. 46. а 1202-1209.
22. Лебедева О.В., Угарова Н.Н. Механизм пе-роксидазного окисления. Субстрат-субстратная активация в реакциях, катализируемых пероксидазой хрена // Изв. РАН. Серия химическая. 1996. № 1. С. 25-32.
Поступило в редакцию 23 марта 2012 г После переработки 21 апреля 2012 г
