Научная статья на тему 'Триптофан как регулятор реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена'

Триптофан как регулятор реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

CC BY
360
118
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Химия растительного сырья
Scopus
ВАК
CAS
Область наук
Ключевые слова
ТРИПТОФАН / О-ДИАНИЗИДИН / ГИДРОХИНОН / ПЕРОКСИДАЗА ХРЕНА / ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА

Аннотация научной статьи по агробиотехнологии, автор научной работы — Рогожина Татьяна Васильевна, Рогожин Василий Васильевич

Изучено влияние триптофана на реакции пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона, катализируемые пероксидазой хрена. Определены величины каталитических констант и констант ингибирования в интервале рН 4,5-8,0. Показано, что триптофан ингибирует пероксидазу в реакции окисления о-дианизидина по конкурентному типу, тогда как в реакциях окисления гидрохинона при кислых значениях рН проявляется неконкурентный характер ингибирования. Предложены механизмы ингибирования триптофаном реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Триптофан как регулятор реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена»

УДК 577.152.1

ТРИПТОФАН КАК РЕГУЛЯТОР РЕАКЦИЙ ПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ о-ДИАНИЗИДИНА И ГИДРОХИНОНА В ПРИСУТСТВИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА

© Т.В. Рогожина, В.В. Рогожин

Якутская государственная сельскохозяйственная академия,

ул. Красильникова, 15, Якутск, 677007 (Россия) e-mail: vrogozhin@mail.ru

Изучено влияние триптофана на реакции пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона, катализируемые пероксидазой хрена. Определены величины каталитических констант и констант ингибирования в интервале рН 4,5-8,0. Показано, что триптофан ингибирует пероксидазу в реакции окисления о-дианизидина по конкурентному типу, тогда как в реакциях окисления гидрохинона при кислых значениях рН проявляется неконкурентный характер ингибирования. Предложены механизмы ингибирования триптофаном реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона.

Ключевые слова: триптофан, о-дианизидин, гидрохинон, пероксидаза хрена, ферментативная кинетика.

Введение

Триптофан относится к группе гетероциклических соединений, он является незаменимой аминокислотой для человека и животных, служит предшественником для многих функционально активных соединений растений и животных (индолил-3-уксусная кислота (ИУК), серотонин, мелатонин, никотиновая кислота, ниа-цин и др.). Входит в семейство гидрофобных аминокислот, поскольку содержит ароматическое ядро индола. Триптофан присутствует в составе большинства растительных белков. В составе первичной структуры пе-роксидазы определяется только один остаток триптофана. Пероксидаза (КФ 1.11.1.7) катализирует реакции индивидуального и совместного оксидазного и пероксидазного окисления различных органических соединений, среди которых много биологически активных веществ (НАДН, аскорбиновая кислота, флавоноиды, фенотиазины и др.). Регуляторами активности пероксидазы могут быть как различные субстраты фермента, так и соединения, не окисляющиеся в пероксидазных реакциях. В реакциях совместного окисления участвуют быстро и медленно окисляемые субстраты, проявляющие эффекты как активирования, так и ингибирования окисления одного из субстратов, исследование которых позволит раскрыть функциональную роль фермента в биогенных системах [1].

К субстратам пероксидазы относится ИУК, предшественником которой в растениях является триптофан. Оксидазное окисление ИУК пероксидазой протекает через образование тройного комплекса фермент - ИУК - кислород [2, 3]. Исследования механизма окисления ИУК пероксидазой растений показали, что на поверхности белковой глобулы должен располагаться участок связывания ауксина [4, 5], который может находиться в составе дистального домена фермента [6]. При этом считается, что активную роль в катализе пероксидазы играет участие остатка Trp-117, удаленного на 8-9 А от атомов азота порфиринового цикла, т.е. находящегося в зоне туннелирования электронов. При этом субдомен, включающий структурно сходные участки в дистальном домене пероксидазы, формируется в направлении от активного центра к поверхности дистального домена, противоположной входу в активный центр. Таким образом, предполагается, что центр связывания ИУК может располагаться вблизи от активного центра пероксидазы [6]. Причем оксидазное окисление ИУК может возрастать в присутствии гидрофобных аминокислот, тогда как полярные аминокис-

* Автор, с которым следует вести переписку.

лоты почти не оказывают влияния на каталитический процесс окисления ауксина. Установлена прямая корреляция между гидрофобностью аминокислот и степенью их влияния на скорость окисления ИУК [7, 8].

Однако в литературе отсутствуют данные о влиянии триптофана на пероксидазное окисление органических соединений, катализируемое пероксидазой растений. Возможно, что проведение таких исследований позволило бы определить место локализации и протяженность активного центра фермента на поверхности белковой глобулы, установить участки индивидуального связывания на ферменте, а также раскрыть причины широкой субстратной специфичности пероксидазы.

Для изучения влияния триптофана на реакции окисления органических соединений с участием перекиси водорода, катализируемые пероксидазой, в качестве субстратов нами были выбраны о-дианизидин и гидрохинон, относящиеся к группе быстро окисляемых субстратов пероксидазы. Ранее было показано, что при совместном окислении гидрохинон и о-дианизидин могут конкурировать за место связывания в активном центре фермента [9]. При этом предварительное связывание о-дианизидина улучшало последующее связывание гидрохинона, ускоряя процесс его пероксидазного окисления. На основании полученных данных было высказано предположение, что о-дианизидин и гидрохинон имеют различные участки связывания в области активного центра пероксидазы.

В данной работе мы изучили кинетические характеристики реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона в широком диапазоне рН и исследовали механизм ингибирования фермента триптофаном реакций пероксидазного окисления выбранных субстратов.

Экспериментальная часть

Реактивы. В работе использовали пероксидазу хрена производства «Reanal» (Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ=1,0. Концентрацию фермента устанавливали спектрофотометрически при 403 нм (е=100 мМ-1 см-1 [10]) и по пиридингемохромогену [11]. Применяли гидрохинон и триптофан - «Реахим» (Россия); о-дианизидин марки ч. очищали возгонкой в вакууме. Концентрацию перекиси водорода («Реахим», Россия) находили спектрофотометрически, используя молярный коэффициент поглощения при 230 нм 72,7 М-1 см-1 [12].

Методы. Реакцию окисления о-дианизидина (17,2-68,8 мкМ) или гидрохинона (0,1-0,5 мМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 23 °С в среде 0,1 М натрий-ацетатного, рН 4,5-6,0, или 0,1 М натрий-фосфатного, рН 6,0-8,0, буферов объемом 2,5 мл при различных концентрациях пероксидазы хрена. Окисление о-дианизидина регистрировали по возрастанию поглощения при 460 нм (е=30 мМ-1см-1) [13]. За окислением гидрохинона наблюдали по уменьшению поглощения при 290 нм (е=2,2 мМ-1см-1) [14].

Ингибирование пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона триптофаном изучали путем добавления в кювету вместе с субстратами (при насыщающей концентрации одного из субстратов) перокси-дазы ингибитора. Кинетические кривые снимали на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы «Varian» (США). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль субстрата (о-дианизидина и гидрохинона) за 1 мин. Кажущиеся константы скорости окисления субстратов пероксидазы определяли из данных по стационарной кинетике [15].

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлены зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии триптофана, которые имеют вид пучка прямых, пересекающихся на оси ординат, что соответствует конкурентному типу ингибирования. Откладывая экспериментальные данные в координатах (Km, [Триптофан]), мы определили константы конкурентного ингибирования (рис. 2).

Графики зависимостей обратных начальных скоростей пероксидазного окисления гидрохинона в присутствии триптофана имели вид семейства прямых, пересекающихся на оси абсцисс, что указывает на неконкурентный характер ингибирования (рис. 3). Константу неконкурентного ингибирования определяли, откладывая экспериментальные данные в координатах (1/kcat, [Триптофан]) (рис. 4).

Аналогичные зависимости мы наблюдали для реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона в присутствии триптофана при всех изученных рН.

Значения кинетических констант для реакций индивидуального и совместного с триптофаном окисления о-дианизидина и гидрохинона при различных рН показаны в таблице.

1Л', мин мкМ

0,6 ■

0,4 - —А -

0,2 - *

г . 0-

-211

20

411 60

1/0ДН, мМ-1

Рис. 1. Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина в присутствии пероксидазы от его концентрации, в координатах Лайнуивера-Берка, при различных концентрациях триптофана, мМ:

1 - 0, 2 - 0,05, 3 - 0,1, 4 - 0,15; пероксидаза -

0,81 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,5

Рис. 2. Зависимость Кт реакций пероксидазного окисления о-дианизидина от концентрации триптофана. Условия на рисунке 1

Рис. 3. Зависимость начальной скорости окисления Рис. 4. Зависимость 1/к^ реакций пероксидазного

гидрохинона в присутствии пероксидазы от его окисления гидрохинона от концентрации

концентрации, в координатах Лайнуивера-Берка, триптофана. Условия на рисунке 3

при различных концентрациях триптофана, мМ:

1 - 0, 2 - 0,1, 3 - 0,2, 4 - 0,3; пероксидаза - 1,4 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 6

Конкурентный тип ингибирования пероксидазы триптофаном в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина свидетельствует о том, что субстрат и ингибитор связываются в одном и том же месте активного центра фермента. В случае окисления гидрохинона проявлялся неконкурентный тип ингибирования, указывающий на разные места связывания триптофана и гидрохинона в активном центре пероксидазы.

Из данных таблицы видно, что связывание триптофана с пероксидазой зависит от рН среды. Так, в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина величина К1 при рН 4,5-8,0 изменяется в диапазоне от 27 до 111 мкМ. При этом худшее связывание триптофана с ферментом наблюдается при рН 6,5, а лучшее связывание триптофана с пероксидазой - при кислых и щелочных рН.

Величины каталитических констант для реакций индивидуального и совместного с триптофаном окисления о-дианизидина и гидрохинона

рН Кш(одн) кса^ОДН^ с-1 Кі(одн+тф> мкМ *Кі(одн+ИУК> мкМ К-т^Х^ мкМ кса^ГХ^ с-1 Ki(гx+ТФ), мкМ *К;(гх+ИУК> мкМ

4,5 64±5 2220±200 36±4 9,6±0,5 650±45 1600±180 662±42 113±6

5,0 56±4 2500±220 27±4 13,6±0,8 360±25 2200±200 685±44 101±5

5,5 49±3 3000±250 42±5 21,7±1,2 340±18 2200±200 690±46 105±5

6,0 42±3 2200±180 92±6 15,1±0,9 300±15 1900±150 608±40 78±4

6,5 30±3 1600±120 111±8 14,0±0,8 250±12 1800±120 654±45 66±3

7,0 20±2 600±42 85±6 5,3±0,2 150±10 1700±115 863±50 64±3

7,5 15±1 250±15 74±6 - 100±7 1500±100 1112±110 17±1

8,0 12±1 80±6 68±5 - 56±3 1200±80 1332±120 -

* Данные из [9].

В реакциях окисления гидрохинона величина К1 в том же диапазоне рН изменяется от 0,65 до 1,33 мМ, т.е. с возрастанием рН сродство ингибитора к ферменту может понижаться в 2,1 раза. При этом эффективность связывания триптофана с пероксидазой в реакциях окисления о-дианизидина соизмерима с константой связывания субстрата. С увеличением рН ухудшалось связывание триптофана с пероксидазой.

В реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина связывание триптофана с ферментом при рН 4,5 и 8,0 было соответственно в 18,4 и 19,6 раза эффективнее, чем в реакциях окисления гидрохинона. По-видимому, на сродство ингибитора к ферменту оказывает влияние природа субстрата. При этом субстраты, имеющие близкую с триптофаном полярность, значительно повышают эффективность связывания ингибитора с пероксидазой.

Аналогичные зависимости были получены при изучении связывания ИУК в присутствии гидрофобных и полярных аминокислот [4], с помощью которых установлена корреляция между гидрофобностью аминокислоты и сродством ауксина к ферменту. Поэтому преимущественным местом связывания триптофана и о-дианизидина в активном центре фермента служит гидрофобная область, а местом связывания гидрохинона является гидрофильный участок, в составе которого большое число полярных или заряженных аминокислотных остатков.

Наши предположения подтверждаются данными таблицы. Видно, что величины К1 реакций пероксидаз-ного окисления о-дианизидина и гидрохинона для триптофана и ИУК несколько различаются. ИУК имеет в 3,7-16,0 раз более высокое сродство к ферменту по сравнению с триптофаном в реакциях окисления о-дианизидина и еще больше возрастает в реакциях окисления гидрохинона (в 5,9-65,4 раза). Кроме того, величины каталитических констант для обоих эффекторов зависели от рН среды.

Таким образом, в связи с тем, что ранее в литературе было определено возможное место связывания ИУК в активном центре пероксидазы в области дистального субдомена, нами высказано предположение о возможном месте связывания триптофана в активном центре пероксидазы.

Выводы

1. Сходство в строении триптофана и ИУК, а также аналогичный тип ингибирования пероксидазы триптофаном в реакции окисления о-дианизидина свидетельствуют о том, что триптофан, ИУК и о-дианизидин связываются в одном и том же месте активного центра. Иной тип ингибирования пероксидазы в реакции окисления гидрохинона служит доказательством того, что этот субстрат пероксидазы связывается в другом участке активного центра, проявляя в реакциях окисления в присутствии триптофана и ИУК неконкурентный тип ингибирования.

2. Изучение влияния триптофана на реакции пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона, катализируемые пероксидазой, позволило установить, что в области активного центра фермента имеется протяженная субстратсвязывающая площадка, где могут связываться разные по природе субстраты. Причем связывание одного из них может влиять на связывание другого. Действие ингибиторов (триптофана и ИУК) дает возможность установить наличие в области активного центра пероксидазы разных участков связывания для о-дианизидина и гидрохинона, расположенных близко друг к другу.

3. Наличие в активном центре пероксидазы участка специфичного связывания триптофана позволяет этой аминокислоте выполнять роль регулятора реакций окисления быстро окисляемых субстратов, таких как

о-дианизидин и гидрохинон. Возможно, данный механизм может быть использован в растениях при окислении различных фенолов в реакциях с участием перекиси водорода, катализируемых пероксидазой, в частности в реакциях синтеза лигнина. Кроме того, действие эффекторов регулирует рН среды, проявляя индивидуальность для разных субстратов фермента.

Список литературы

1. Лебедева О.В., Угарова Н.Н. Механизм пероксидазного окисления. Субстрат-субстратная активация в реакциях, катализируемых пероксидазой хрена // Известия РАН. Серия химическая. 1996. №1. С. 25-32.

2. Gazaryan I.G., Lagrimini L.M., Ashby G.A., Thomeley R.F. Mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by plant peroxidases: anaerobic stopped-flow spectrophotometric studies on horseradish and tobacco peroxidases // Biochem. J. 1996. V. 313. Pp. 841-847.

3. Savitsky P.A., Gazaryan I.G., Tishkov V.I., Lagrimini L.M., Ruzgas T., Gorton L. Oxidation of indole-3-acetic acid by dioxygen catalysed by plant peroxidases: specificity for the enzyme structure // Biochem. J. 1999. V. 340. Pp. 579-583.

4. Metodiewa D., Pieres de Melo M., Escobar J.A., Cilento G., Dunford H.B. Horseradish peroxidase-catalysed aerobic oxidation and peroxidation of indole-3-acetic acid. I. Optical spectra // Arch. Biochem. and Biophys. 1992. V. 296, N1. Pp. 27-33.

5. Pieres de Melo M., Escobar J.A., Metodiewa D., Dunford H.B., Cilento G. Horseradish peroxidase - catalysed aerobic oxidation of indole-3-acetic acid. II. Oxygen uptake and chemiexcitation // Arch. Biochem. and Biophys. 1992. V. 296, N1. Pp. 34-39.

6. Савицкий П.А., Рожкова А.М., Тишков В.И., Упоров И.В., Руденская Г.Н., Газарян И.Г. Существование центра связывания индолил-3-уксусной кислоты в пероксидазах растений. Структурное сходство пероксидаз и ауксин-связывающих белков // Биохимия. 1998. Т. 63, №6. C. 749-754.

7. Veselova I.A., Kireiko A.V., Shekhovtsova T.N. Catalytic activity and the stability of horseradish peroxidase increase as a result of its incorporation into a polyelectrolyte complex with chitosan // Applied Biochemistry Microbiology. 2009. V. 45, №2. Р. 125-129.

8. Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 303-322.

9. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Роль индолил-3-уксусной кислоты в реакциях окисления быстро и медленно окисляемых субстратов пероксидаз // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. 2004. Т. 45, №6. С. 423-428.

10. Ogawa S., Shira Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme environmental structure // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 90, N2. Pp. 674-678.

11. Falk J.E. Porphyrins and metalloporphyrins. Amsterdam. N.Y.; L. etc., 1964. 236 p.

12. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome C peroxidase and horseradish peroxidase. Titration with reducing agents // Biocem. J. 1953. V. 54, N2. Pp. 267-276.

13. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена // Биохимия. 1977. Т. 42, №8. C. 1372-1379.

14. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы хрена // Биохимия. 1999. Т. 64, №2. С. 219-224.

15. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М., 1976. 320 с.

Поступило в редакцию 1S января 2010 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.