CC BY
46
КРеати1н1я1ницурпиЯ1и1онкошпиЯ
ИЗ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
79
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКЗОСОМ, СЕКРЕТИРУЕМЫХ РАЗЛИЧНЫМИ НОРМАЛЬНЫМИ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ IN VITRO И IN VIVO
С. Б. Ланда, М. В. Филатов, А. В. Арутюнян
Учреждение Академии Наук Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН
Ланда Сергей Борисович, канд. биол. наук, старший научный сотрудник ПИЯФ РАН, 188300, Россия, г. Гатчина, Орлова роща, тел.: +7905 229 32 71, e-mail: Sergey.landa@gmail.com
Охарактеризованы экзосомы, секретируемые в культуральную среду нормальными фибробластами, дендритными клетками, лимфоцитами и злокачественно трансформированными клетками, полученными из опухолей различного тканевого происхождения.
Ключевые слова: экзосомы, лазерная корреляционная спектроскопия, атомная силовая микроскопия, иммунно-афинное связывание.
RESEARCH IN EXOSOMES SECRETING TO DIFFERENT NORMAL AND TENDING TO BECOME MALIGNANT IN VITRO AND IN VIVO CELLS
S.B. Landa, M.V. Filatov, A.V. Arutyunian
Academy of Sciences Institution, Konstantinov St.Petersburg Institute of Nuclear Physics of Academy of Sciences of Russia
The article characters exosomes secreting to culture medium by normal fibroblasts, by dendritic cells, by lymph cells and cells taken from tumors of different tissue origin tending to become malignant.
The key words: exosomes, laser correlation spectroscopy, atomic force microscopy, immune-affinity adhesion.
Введение
До последнего времени считалось, что межклеточные взаимодействия осуществляются, главным образом, через растворимые молекулярные ли-ганды, узнаваемые клеточными рецепторами. Недавние находки обнаружили другой путь влияния клеток на своих удаленных партнеров - посредством секреции и захватывания из окружающей среды микропузырьков, содержащих биологически активные белки наряду со специфическими мРНК и миРНК [3]. Для обозначения таких везикул размером менее 100 нм используется термин «экзосомы» [4].
Особенности взаимодействия клеток через экзосомы, их молекулярные характеристики, возможности практического использования требуют пристального изучения. Расширение методического арсенала, используемого для исследования экзо-
сом, позволит получать дополнительную информацию об этом новом биологическом явлении.
Материалы и методы
Перевиваемые культуры клеток человека: линия Ter, полученная из глиобластомы, Hela (аде-нокарцинома шейки матки), MCF-7 (аденокарци-нома молочной железы), HT1080 (фибросаркома), ECV (трансформированные клетки эндотелия), GM08632 (кожные фибробласты, трансформированные вирусом SV40), Mg63 (остеосаркома), а также эмбриональные фибробласты легкого (ФЛЭЧ) и фибробласты кожи (ФКЭЧ) культивировали в среде DMEM/F12 (Биолот) с добавлением 5% эмбриональной сыворотки (Биолот), без антибиотиков, в 5% СО2 атмосфере при 370С. По мере роста культур культуральная среда собиралась и исследовалась на предмет наличия экзосом.
80
ИЗ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
ЙДЕативиаЯвйидиВпия1и1ВнКВидпия
Лазерная корреляционная спектроскопия (ЛКС, или динамическое светорассеивание) использовалась в качестве основного метода для регистрации экзосом в биологических жидкостях. ЛКС - одна из разновидностей методов светорассеивания, в которой информация о размере рассеивающих частиц отражена в изменении частоты первоначального монохроматического лазерного излучения. Информация в виде распределения по размерам частиц становится доступной в виде гистограммы, в которой ось абсцисс - шкала размеров в нанометрах (от 1 до 105 нм), а ось ординат - вклад в общее рассеивание частиц данного размера [2]. ЛКС-измерения экзосом выполнены на установке, изготавливаемой в нашей лаборатории на регулярной основе для нужд заинтересованных исследователей.
При интерпретации гистограмм учитывалось, что при извлечении или добавлении в образец новых частиц вклад остальных фракций меняется, поскольку суммарное рассеивание всех частиц равно 100%. Измерения проводились в соответствии с ранее описанной процедурой [1], для каждого образца не менее 10 раз. Далее получали среднее и дисперсию размера и вклада в рассеивание для каждой фракции частиц.
Для прямой визуализации экзогамных частиц применяли технику атомной силовой микроскопии. Экзосомы из культуральной среды концентрировались ультрафильтрацией, затем наносились на поверхность «мики» (mica) - минерала, используемого в качестве субстрата при приготовлении образцов для атомной силовой микроскопии. После прикрепления образцы фиксировались 0,5% глу-таровым альдегидом, споласкивались водой, высушивались. Визуализацию образцов проводили с помощью сканирующего зондового микроскопа серии Solver Bio (NT-MDT, Зеленоград, Россия). Полученные СЗМ-изображения обрабатывали посредством программного обеспечения Image Analysis Nova.
Результаты и обсуждение
Для исследования экзосом, продуцируемых клетками человека in vitro, культуральную среду исследовали Л КС до и после выращивания клеток. После 6 суток культивирования клеток в среде накапливаются частицы двух типов диаметром 21.8+0.54 нм и 93+6.1 нм (гистограммы А и Б на рис. 1). Размеры этих частиц соответствуют ожидаемым для экзосом. Чтобы быть уверенными, что это частицы, секретиру-емые клетками, требуется продемонстрировать, что они несут молекулярные маркеры, соответствующие поверхностным молекулам плазматической мембраны клеток. Для этой цели использовали главный комплекс гистосовместимости первого типа (HLA-АВС), присутствующий на поверхности практически всех разновидностей клеток.
Моноклональные антитела к HLA-ABC добавлялись к исследуемой среде. После этого белок А из Staphylococcus aureus, пришитый к агарозному носителю ковалентной связью, использовался для удаления добавленных антител и связавшихся с ними антигенов. Рис. 1 В демонстрирует, что такая
процедура практически полностью удаляет из среды рассматриваемые частицы. Следовательно, они происходят из клеток путем секреции с захватом компонентов плазматической мембраны, что является свойством экзосом.
Ь* А.
р ^Д и %■ шяя иии "н"
Щщ
»м
Рис. 1. Гистограммы фракционного состава среды ОМЕМ/П2 с эмбриональной сывороткой до (А), после 6 суток культивирования клеток (Б) и после добавления моноклональных антител к HLA-ABC и белка А, иммобилизованного на агарозных микросферах (В). По оси абсцисс - гидродинамический диаметр частиц Dh нм, по оси ординат - вклад в рассеяние в относительных единицах
КЯвати1н9я1ницуРпия1и18нкоВВпиЯ
ИЗ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИИ
Еще одним признаком экзосом является их ли-пидный состав, сходный с составом рафтов - особых микродоменов клеточной мембраны, обогащенных холестерином, сфингомиелином и ганглиозидом GM3. Такой состав делает экзосомы устойчивыми к растворению неионным детергентом Тритоном Х-100 и чувствительным к разрушающему действию сапонина [5]. Этот критерий использовали для проверки сходства регистрируемых нами секрети-руемых наночастиц с экзосомами. Фракции с размерами, близкими к 20 нм и 100 нм, оказались устойчивы к действию Тритона Х-100 и разрушались при добавлении в среду сапонина.
Секреция экзосом клетками с неизбежностью должна сопровождаться увеличением их количества в среде с ростом времени культивирования клеток. Так, вклад в рассеивание фракции частиц с диаметром около 20 нм увеличивается с 0,05 у.е. через сутки культивирования до 0,63 у.е. через 3 суток и 0,64 у.е. через 6 суток. Вклад фракции частиц диаметром 100 нм увеличивается от нуля через сутки, до 0,16 у.е. через 2 суток, через трое суток достигает 0,58 у.е. и к исходу 6 суток достигает 0,74 у.е. Сходная картина наблюдалась при исследовании экзосом, секретируемых всеми клетками, использованными в этой работе.
Полученные результаты определенно указывают на возможность детектировать наличие экзосом в биологических жидкостях методом динамического светорассеивания. Для уверенной интерпретации данных желательно получить изображение этих частиц. Мы использовали возможности атомной силовой микроскопии для визуализации экзосом в культуральной среде (рис. 2). Сравнивая рис. 2 А и В видно, что в случае с измерениями с помощью ЛКС предварительная обработка моноклональными антителами к HLA-ABC с последующей иммуно-аффин-ной хроматографией на пришитом к агарозе белке А практически полностью удаляет из среды исследуемые экзосомы (рис. 2 В). Это подтверждает, что оба метода регистрируют одни и те же образования.
Исследование экзосом, продуцируемых различными клеточными линиями нормальных и злокачественно трансформированных клеток, обнаруживает однородность их размеров. Независимо от того, какие клетки являются источником экзосом, динамическое рассеивание регистрирует 2 пика, соответствующих размерам около 20±1 нм и 93±6
нм. Оба пика сравнимы по вкладу в динамическое светорассеивание. Подавляющее большинство экзосом имеет размер около 20 нм. В отличие от оценочных размеров экзосом, приводимых в литературных источниках, дающих распределение размеров экзосом от 20 до 100 нм, нами установлено, что экзосомы гораздо более однородны по размеру и имеют бимодальное распределение с выраженными модами порядка 20 нм и 90 нм. Полученные при атомной микроскопии картины также обнаруживают гомогенность размеров экзосом.
Представляется возможным с помощью динамического светорассеивания выявлять экзосомы в различных биологических жидкостях, содержащих другие рассеиватели, усложняющие интерпретацию полученных данных. Критериями определения являются размер (около 20 и 90 нм) и способность быть удаленными из смеси с помощью антител против HLA-ABC.
На рис. 3 приведены примеры такого доказательного детектирования экзосом в образцах спин-но-мозговой жидкости и плазмы крови человека соответственно. На рисунке 3 А отчетливо видны пики, соответствующие размерам 20 и 90 нм, предположительно представленные экзосомами. Попытка их удаления с помощью иммобилизованного на агарозе белка А не приводит к какому-либо изменению картины (рис. 3 Б), однако после добавления антител против HLA-ABC такая же процедура почти полностью удаляет из смеси частицы рассматриваемых размеров (рис. 3 В).
Выводы
1. Предлагаемый метод доказательного выявления экзосом позволяет измерять содержание этих частиц в различных биологических жидкостях.
2. Исследование экзосом, продуцируемых нормальными и злокачественно трансформированными клетками, может позволить развить новое поколение диагностических процедур для дифференциального выявления онкологических заболеваний, т.к. есть основания полагать, что появление злокачественных новообразований значительно увеличивает количество экзосом в биологических жидкостях, а также анализ белков и РНК, содержащихся в экзосомах, может позволить судить об их тканевом происхождении и патологических изменениях в данной ткани.
Б
В
к
81
Рис. 2. Визуализация экзосом методом атомно-силовой микроскопии при малом (А) и большом (Б) разрешении и после удаления экзосом с помощью моноклональных антител к HLA-ABC и белка А, иммобилизованного на агарозных микросферах (В)
ИЗ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИИ
Вива8ивйая1№ид8дпия1и1дн8ийВпия
I
ir
■М-U u
: h-
Список литературы
1. Ланда С.Б., Филатов М.В., Арутюнян А.В., Вар-фоломеева Е.В. Исследование образования мега-молекулярных комплексов в плазме крови методом лазерной корреляционной спектроскопии // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 4. - С. 37-41.
2. Лебедев А.Д., Левчук Ю.Н., Ломакин А.В., Носкин В.А. Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии. - Киев: Н. думка, 1987. - 256 с.
3. Belting M. and Wittrup A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid - binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease // J. Cell Biol. - 2008. - Vol. 183. - № 7. - P. 1187-1191.
4. Chaput N., Taieb J., Schartz N.E., Andre F., Angevin E., Zitvogel L. Exosome-based immunotherapy. Cancer Immunol Immunother. - 2004. - Vol. 53. - P. 234-239.
5. Smalheiser N.R., Exosomal transfer of proteins and RNAs at synapses in the nervous. System // Biology Direct. - 2007. - Vol. 2. - № 35. - P. 1-15.
4m
82
Рис. 3. Экзосомы в спинно-мозговой жидкости пациента до (А), после добавления белка А (Б) и моноклональных антител к HLA-ABC (В)
