CC BY
33
© Коллектив авторов, 1998 УДК 618.19-006.04-085.28:575.117.2
С. С. Шушапов, Е. И. Загрекова, В. Д. Ермилова,
А. Ф. Карамышева
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ (MDR1) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ОПУХОЛЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ НЕОАДЪЮВАНТНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ
НИИ канцерогенеза; НИИ клинической онкологии
Способность злокачественных клеток выживать несмотря на воздействие на них ряда противоопухолевых лекарств — основное препятствие на пути успешной противораковой химиотерапии. Важным типом устойчивости опухоли к лекарственным препаратам является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) [1, 5]. Характерной особенностью этого феномена является перекрестная устойчивость злокачественных клеток к широкому кругу структурно и функционально неродственных цитостатиков, таких, как винкаалкалоиды, антрациклины, актиномицин D и эпиподофилотоксины [1, 5]. Одним из основных механизмов МЛУ является уменьшение накопления лекарства устойчивыми клетками из-за энергозависимого выброса [1]. Приобретение фенотипа МЛУ человеческими клетками весьма часто является результатом гиперэкспрессии гена MDR1 [3, 8, 10, 12], который кодирует мембранный гликопротеин с мол. массой ~ 170 кД, известный как Р-гликопротеин (Pgp). Этот белок относится к суперсемейству ABC транспортеров и имеет внутреннюю АТФазную активность [4]. Используя энергию гидролиза АТФ, Pgp активно транспортирует гидрофобные соединения, включая химиопрепараты, из клетки [1]. В клеточных линиях, отобранных in vitro на Pgp-опосредоваппую МЛУ, повышение уровня устойчивости коррелирует с количеством мРНК гена MDR1 [7]. Экспрессия этого гена была исследована в опухолях человека разной локализации до или после химиотерапии, а также в некоторых нормальных тканях [1, 7]. Найдено, что в некоторых тканях организма ген MDR1 экспрессирован в большей степени, чем в других (почки, толстая кишка) [7]. Установлено, что для опухолей, которые произошли из таких тканей, характерна нечувствительность к цитостатикам, а экспрессия гена MDR1 в них чаще имеет высокий уровень еще до лечения. Однако в ряде нелеченых опухолей общепринятой РНК-гибридизацией установлена слабая экспрессия гена MDR1, тогда как в этих опухолях часто наблюдается гиперэкспрессия этого гена после химиотерапии [1, 5]. К этой категории опухолей относится рак молочной железы (РМЖ) человека, и у первичных больных в таких опухолях ген MDR1 имеет низкий до умеренного уровень экспрессии (15—40% позитивных случаев) [7, 8].
S.S.Shushanov, E.I.Zagrekova, V.D.Ermilova,
A. F. Karamysheva
A STUDY OF MULTIPLE DRUG RESISTANCE GENE EXPRESSION BY POLYMERASE CHAIN REACTION IN HUMAN BREAST CANCER FROM PATIENTS UNDERGOING NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY
Research Institute of Carcinogenesis, Research Institute of Clinical Oncology
The ability of malignant cells to survive in spite of the effect of various antitumor agents is the main obstacle for successful anticancer chemotherapy. Multiple drug resistance (MDR) is an important type of drug resistance [1,5]. This phenomenon is characterized by cross resistance of cancer cells to a broad range of structurally and functionally different cytostatics such as vinca alkaloids, anthra-cyclines, actinomycin D and epipodophilotoxins [1,5]. Decreased accumulation of a drug by resistant cells due to energy-dependent release [1] is one of the mechanisms underlying the MDR. The development of MDR phenotype by human cells is often caused by hyperexpression of MDR1 gene [3,8,10,12] which encodes a membrane glycoprotein with a molecular weight about 170 kilodalton termed P-glycoprotein (Pgp). This protein belongs to the superfamily of ABC transporters and demonstrates intrinsic ATPase activity [4]. Using the ATP hydrolysis energy the Pgp actively evacuates hydrophobic compounds including chemotherapeuticals from the cell [1]. In cell lines screened in vitro for Pgp-mediated MDR the resistance increase correlated with content of MDR1 mRNA [7]. The gene expression was studied in human tumors from various sites before and after chemotherapy as well as in some normal tissues [1,7]. Some tissues presented with a higher MDR1 expression than others (kidneys, colon) [7]. Tumors originating from such tissues are not responsive to cytostatics and MDR1 expression in such tumors is high already before treatment. However, some untreated tumors present with low MDR1 expression as assessed by standard RNA-hybridization, while demonstrating hyperexpression of the gene after chemotherapy [1,5]. Such tumors include human breast cancer (BC) with primary cases demonstrating low to moderate MDR1 expression (15-40% positive cases) [7,8].
As found, even very low MDR1 expression in a part of tumor cells may be indicative of a manifold increase in drug resistance which may have clinical significance [2,10]. This low expression is beyond sensitivity of common assays even if a large amount of RNA or protein is studied. Besides, study of RNA from clinical samples is difficult due to its partial degradation which affects accuracy of test results. Correct measurement of MDR1 is also difficult due to the existence of a homologous gene MDR2 [5]
Установлено, что даже очень низкая экспрессия гена MDR1 в части клеток опухоли может определять увеличение в несколько раз уровня лекарственной устойчивости, которое может иметь клиническое значение [2, 10]. Однако определить такую слабую экспрессию обычными методами невозможно из-за предела их чувствительности, даже если использовать большие количества РНК или белка. К тому же исследование РНК из клинических образцов осложняется их частичной деградацией, что отражается на корректности результатов. Кроме того, достоверное определение экспрессии гена MDR1 затрудняется присутствием гомологичного гена MDR2 [5], чьи продукты показывают перекрестную реактивность, хотя экспрессия гена MDR2 не связана с устойчивостью к химиопрепаратам.
Чтобы исследовать экспрессию гена MDR1 в РМЖ человека при неоадъювантиой химиотерапии, мы использовали высокочувствительную и специфичную методику, основанную на полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой можно использовать небольшие количества РНК.
Материалы и методы. Образцы ткани и выделение РНК. Биопсийный материал от нелеченой больной с РМЖ хранился в жидком азоте. После курса неоадыовантной химиотерапии по трем режимам: (цис-платин + фторафур + фармарубицин, цисплатин + фторафур + нован-трон, навельбин + новантрон) и последующей мастэктомии у этой же пациентки вновь брали образец опухоли. Из такой пары опухолевой ткани, используя тризольную методику, выделяли тотальную РНК. Концентрацию РНК измеряли при 260 и 280 нм, а качество проверяли электрофорезом в 1% агарозном геле. В качестве положительного контроля использовали тотальную РНК из культуры клеток MS-0,5 меланомы человека с 130-кратной устойчивостью к колхицину, полученной из исходной чувствительной линий MS путем ступенчатой селекции [11].
Синтез кДНК и ПЦР. кДНК синтезировали в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 100 нг тотальной РНК, 100 нг антисенспраймера, 1 мМ МпСЬ, 0,25 мМ dNTP, 67 мМ трис-НС1 (pH 8,8), 16,6 мМ (NH^SO«, 2,5% глицерина, 5 ед. TET-z-полимеразы («Биомастер»), на водяной бане при 37 °С 20 мин и охлаждали во льду. Затем вносили дополнительно 80 мкл реакционной смеси для ПЦР, содержащей 67 мМ трис-НС1 (pH 8,8), 16,6 мМ (NHj^SOj, 100 нг сенспраймера, 2 мМ MgCb. Каждый из 30 циклов амплификации проводили в следующем температурном режиме: 94 °С — 1 мин, 60 °С — 1 мин, 72 °С — 2 мин. В качестве внутреннего контроля уровня мРНК гена MDR1 определяли экспрессию гена Рг-микроглобулина (ßi-M). Праймеры для MDR1 и ß>-M были аналогичны тем, которые использовали Noonan и соавт. [7]. Продукты ПЦР, 167 пар оснований (п. о.) для MDR1 и 120 п. о. для ß^-M, анализировали в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромида этидия.
Результаты и обсуждение. MDR1 — специфические кДНК последовательности (167 п. о.), полученные обратной транскрипцией с 21-го и 22-го экзонов и последующей ПЦР, не содержат 21-го нитрона, что исключает амплификацию случайно контаминированной геномной ДНК. Использование антисенспраймера в реакции обратной транскрипции определяет высокую специфичность транскрипта. Аналогично [7], чтобы исключить погрешность выхода продукта ПЦР вследствие разной степени чистоты препарата РНК, а также незначительной ее деградации, ошибки при измерении концентрации и приготовлении реакционной смеси, параллельно с исследуемым геиом в качестве внутреннего контроля мы определяли экспрессию гена ßi-M (120 п. о.), используя ту же тотальную РНК.
whose products show cross resistance. The MDR2 expression is not related to chemotherapeutical resistance.
We applied a high sensitivity and high specificity method involving polymerase chain reaction (PCR) which requires a small RNA quantity to study MDR1 expression in human BC during chemotherapy.
Materials and Methods. Tissue specimens and RNA extraction. A biopsy specimen from an untreated BC patient was stored in liquid nitrogen. Another specimen was taken from the same patient after chemotherapy by three schedules: cisplatin+fluorouracil+farmaru-bicin, cisplatin+ftorafur+novantron, navelbine+novantron followed by mastectomy. Total RNA was extracted from this pair of specimens using the trisol methodology. RNA concentration was measured at 260 and 280 nm with further quality verification by electrophoresis in 1% agar gel. Total RNA from cell culture of human melanoma MS-0,5 having a 130-fold resistance to colchicine and selected from an initially sensitive MS line [11] was used as positive control.
cDNA synthesis and PCR. cDNA was synthesized in 20 mcl reaction mixture containing 100 ng total RNA, 100 ng antisense primer, 1 mM MnCh, 0.25 mM dNTP, 67 mM trsi-HCl (pH 8.8), 16.6 mM (NH4)2S04, 2.5% glycerol, 5 units of TET-z-polymerase (Biomaster) in water bath at 37°C for 20 min and cooled on ice. PCR mixture, 80 mcl, consisting of 67 mM tris-HCl (pH 8.8), 16.6 mM (NH4)2S04, 100 ng sense primer, 2 mM MgCL was added to the solution. Each of 30 amplification cycles was performed under the following temperature conditions: 94°C 1 min, 60°C 1 min, 72°C 2 min. P'-microglobulin gene (P^-M) expression was used as internal control for MDR1 mRNA measurement. Primers for MDR1 and (P> were similar to those used by Noonan et al. [7]. PCR products, 167 base pairs for MDR1 and 120 base pairs for (p2, were analyzed in 2% agar gel with 0.5 mcg/ml ethidi-um bromide.
Results and Discussion. MDR1-specific cDNA sequences (167 base pairs) resulting from reverse transcription of exons 21 and 22 and further PCR contained no intron 21 which excluded amplification of casually contaminated genome DNA. The use of antisense primers in the reverse transcription determined high specificity of the transcript. Like in [7] we measured ((32-M expression (120 base pairs) as internal control using the same total RNA in parallel with the tested gene to exclude error of measurement of PCR product yield due to different purity of RNA specimens and slight RNA degradation, error of concentration measurement when preparing the reaction mixture.
The yield of PCR product is proportional to initial mRNA matrix quantity only if the amplification curve behaves exponentially at the given efficiency. In view of this we shall analyze MDR1 reverse transcription product amplification in the total RNA specimens (1.0 g) from human melanoma cells MS-0.5 with a 130-fold resistance to colchicine and MDR1 hyperexpression and from an initially sensitive MS line [11]. The PCR product corresponding to the mentioned quantity of MS-0.5 RNA showed marked expression though the MDR1 product in MS specimens at the same RNA quantity was absent while (02-M expression was also significant at the same PCR efficiency (fig.l).
We studied (2-M expression at different total RNA levels to find the portion of the amplification curve that showed exponential growth (fig.2).
As seen from figs. 1 and 2 this methodology discovered the previously found MDR1 hyperexpression in colchicine-resistant human melanoma cell culture and its
Выход продукта ПЦР пропорционален начальному количеству матрицы (мРНК) только при условии, что амплификация экспоненциальна при данной эффективности. В связи с этим мы проанализировали амплификацию продукта обратной транскрипции MDR1 специфической последовательности в препаратах тотальной РНК (1,0 g) из культуры клеток MS-0,5 меланомы человека со 130-кратным уровнем устойчивости к колхицину и гипер-экспрессированным геном MDR1 и из исходной чувствительной линии MS [11]. Продукт ПЦР, соответствующий указанному количеству РНК MS-0,5, резко выражен, тогда как в MS — MDR1 продукт при том же количестве РНК отсутствует, хотя экспрессия гена ß2-M при данной эффективности ПЦР в них также резко выражена (рис. 1).
Чтобы выявить участок экспоненциального роста амплификации, была исследована экспрессия гена ßi-M при разных количествах тотальной РНК (рис. 2).
Как видно на рис. 1 и 2, данная методика обнаруживает ранее установленную [11] гиперэкспрессию гена MDR1 в устойчивой к колхицину культуре клеток меланомы человека и ее чувствительность позволяет выявить 8-крат-ное изменение количества мРНК исследуемого гена.
1 2 3
Рис. 1. Экспрессия гена MDR1 в культурах клеток меланомы человека с разными уровнями устойчивости к колхицину, выявленная ПЦР.
1 — отсутствие экспрессии гена MDR1 в клетках MS — меланоме человека, чувствительных к колхицину; 2 — экспрессия гена MDR1 в клетках MS-0,5 — меланоме человека со 130-кратным уровнем устойчивости к колхицину; 3 — экспрессия гена (Зз-М в клетках MS (внутренний контроль). В ПЦР взято по 1 д тотальной РНК исследуемого образца.
Fig. 1. MDR1 expression in human melanoma cell lines with different colchicine resistance discovered by PCR.
1, no MDR1 expression in colchicine-sensitive human melanoma MS; 2, MDR1 expression in human melanoma MS-0,5 with a 130-colchicine-resistance; 3, (p3-M expression in MS cells (internal control). 1 g total RNA from every specimen was taken for PCR.
1 2 3 4 5 6
Рис. 2. Определение участка экспоненциального роста амплификации.
Р2-М — специфические продукты ПЦР, соответствующие серии разведения тотальной РНК; 1 — 0,05-у; 2 — 0,1 у, 3 — 0,2 у; 4 — 0,4 у; 5 — 0,85 у; 6 — 1,7 у.
Fig. 2. Determination of exponential section of the amplification growth curve.
(P2-M-specific PCR products for total RNA dilution series: 1-0,05y; 2-0,1 y; 3-0,2 y; 4-0,4 y; 5-0,85 y; 6-1,7 y.
sensitivity was sufficient to detect a 8-fold changes in mRNA of the test gene.
We studied MDR1 expression in 13 patients before and after neoadjuvant chemotherapy and in 2 patients after treatment. By tumor histology the cases were distributed as follows; 10 ductal invasive cancers (DIC), 4 lobular invasive cancers (LIC) and 1 mixed (DIC+LIC) type (see the table). Tumor cell fraction in the specimens was 70% and only in 1 case (No.7) it was 30%.
Distribution of the cases with respect to disease stage was as follows; 3 T4N2M1 (1 lung metastasis, 2 cervical and supraclavicular lymph nodes); 9 T4N2M0; 1 T3N2M0; 1 T3N1M0, 1 T2N0M0.
The patients received polychemotherapy by three schedules: (I) cisplatin 60 mg/m2 intravenously (i.v.) with standard hydration once every three weeks, farmarubicin 50 mg/m2 i.v. once every three weeks, ftorafur 400 mg per os 3 times daily; (II) navelbine 20 mg/m2 i.v. on days 1 and 8, novantron 10 mg/m2 i.v. day 1 at a 3-week interval; (III) cisplatin 60 mg/m2 i.v. with a standard hydration once every three weeks, novantron 10 mg/m2 i.v. on
Мы исследовали экспрессию гена MDR1 у 13 больных до и после неоадъювантной химиотерапии и у 2 больных только после лечения. Гистологически выявлен протоковый инфильтративный рак (ПИР) у 10 больных, дольковый инфильтративный рак (ДИР) — у 4 и у 1 больного установлена смешанная форма (ДИР + ПИР) (см. таблицу). Число опухолевых клеток в таких препаратах не менее 70%, лишь в одном случае (№ 7) — 30%.
По стадиям заболевания больные разделились следующим образом: 3 — T4N2M1 (метастазы в легкое — 1, в шейно-надключичные лимфоузлы — 2); 9 — T4N2M0; 1 — T3N2M0; 1 — T3N1M0, 1 — T2N0M0.
Пациенты получали полихимиотерапию по трем режимам: I — цисплатин, 60 мг/м2 внутривенно (в/в) со стандартной водной нагрузкой 1 раз в 3 нед, фармаруби-цин, 50 мг/м2 в/в 1 раз в 3 нед, фторафур, 400 мг 3 раза в день внутрь ежедневно; II — навельбин, 20 мг/м2 в/в на 1-й и 8-й дни, новантрон, 10 мг/м2 в/в 1 день с интервалом 3 нед; III — цисплатин, 60 мг/м2 в/в со стандартной водной нагрузкой 1 раз в 3 нед, новантрон, 10 мг/м2 в/в 1 день с интервалом 3 нед, фторафур, 400 мг 3 раза в день внутрь ежедневно. По I режиму химиотерапию получили 5, по II — 6, по III — 4 больных.
После проведенной химиотерапии частичный эффект (уменьшение опухоли на 50% и более) получен у 8 больных, минимальный (уменьшение опухоли на 25—50%) — у 1, отсутствие динамики отмечалось у 5, полная регрессия опухоли — у 1 больного. При гистологическом исследовании после химиотерапии лечебный патоморфоз IV степени выявлен у 1 больной, III степени-У 3, II сте-
пени — у 5,1 степени — у 6 больных (см. таблицу).
Экспрессия гена MDR1 в каждой паре опухолевых образцов от одного пациента исследовалась строго в одинаковых условиях и при одинаковой эффективности ПЦР (рис. 3). При первом обследовании слабая экспрессия указанного гена отмечена у 7 из 13 больных, что соответствует данным литературы [7, 9], после лечения — у 4 из них. Продукты ПЦР, соответствующие гену MDR1, в каждой из 4 пар, в которых мы обнаружили экспрессию исследуемого гена до и после лечения, существенно не различались (см. таблицу; больные № 1,2, 4, 5), что подтверждает ранее полученные результаты исследования экспрессии Pgp в опухолях молочной железы человека при неоадъювантной химиотерапии [6]. У 1 больной (№ 13) мы обнаружили экспрессию гена MDR1 лишь после лечения. В 5 случаях не наблюдалась экспрессия этого гена ни до, ни после терапии, а у больных, обследованных только после лечения, слабая экспрессия выявлена в 1 из 2 случаев (см. таблицу).
В каждой исследованной паре опухолевых образцов экспрессия гена ß2-M существенно ие различалась и была значительно ниже, чем в клетках MS (см. рис. 1, 3), в которых исходная тотальная РНК составляет 1,0 g на реакцию, что свидетельствует об отсутствии плато для продукта ПЦР указанного гена.
Создается впечатление, что экспрессия гена MDR1 до лечения чаще выявляется у больных, обследованных на более поздних этапах заболевания. Так в 3/3 образцах
1 2 3 4 5 6
Рис. 3. Пример исследования экспрессии гена MDR1 методом ПЦР у больных РМЖ до и после неоадъювантной химиотерапии.
1 — MDR1-специфический продукт в клетках MS-0,5 (положительный контроль); 2 — отрицательный контроль (в ПЦР отсутствует тотальная РНК); 3 — MDR1-специфический продукт до лечения (больная № 1); 4 — MDR1 -специфический продукт после лечения (больная № 1); 5, 6 — р2-М-специфические продукты (внутренний контроль) до и после лечения соответственно (больная № 1).
Fig. 3. Example of MDR1 expression study by PCR in BC patients before and after neoadjuvant chemotherapy.
1, MDR1 -specific product in MS-0,5 cells (positive control); 2, negative control (no total RNA by PCR); 3, MDR1-specific product before treatment (case No.1); 4, MDR1-specific product after treatment (cases No.1); 5,6, рг-M-specific products (internal controls) before and after treatment, respectively (case No.1).
day 1 with a 3-week interval, ftorafur 400 mg per os 3 times daily. Schedule I was undertaken in 5, schedule II in 6 and schedule III in 4 cases.
As a result of the chemotherapy partial response (a 50% or greater disease decrease) was achieved in 8, minimal response (a 25-50°/) decrease) in 1, no change in 5, complete response in 1 cases. Histological study after chemotherapy discovered grade IV pathomorphosis in 1, grade III in 3, grade II in 5 and grade I in 6 patients (see the table).
Study of MDR1 expression in each specimen pair was performed under the same conditions and at similar PCR efficiency (fig.3). Study of baseline specimens discovered low expression of the gene in 7 of 13 patients which was in agreement with published data [7,9], after treatment MDR1 expression was found in 4 of the cases. PCR products corresponding to MDR1 were similar in the 4 specimen pairs with positive reaction before and after therapy (see the table, patients Nos. 1,2,4,5) which supported the previous findings of Pgp expression in human breast tumors during neoadjuvant chemotherapy [6]. One patient (No. 13) presented with MDR1 expression
Таблица Table
Результат исследования экспрессии гена MDR1 и клинико-морфологические характеристики больных при неоадъювантной химиотерапии РМЖ человека
Results of MDR1 expression study and clinical and morphological characteristics of BC patients undergoing neoadjuvant chemotherapy
X .0 r -Û Стадия болезни Г металогическая форма Режим химиотерапии Результат ПЦР Ответ на химиотерапию Степень лечебного патоморфоза
Ol z до лечения после лечения
1 T4N2M1 ДИР LIC II + + С S I
2 T4N2M1 ДИР LIC I + + 4P PR IV
3 T4N2M1 ДИР LIC I + - 4P PR I
4 T4N2M0 ДИР LIC I + + 4P PR III
5 T4N2M0 ПИР DIC II + + с S I
6 T4N2M0 ПИР DIC III + - ПР CR III
7 T4N2M0 ПИР DIC I + - 4P PR III
8 T4N2M0 ПИР DIC III - - 4P PR II
9 T4N2M0 ДИР + ПИР LIC+DIC - _ 4P PR II
10 T4N2M0 ПИР DIC III - - С S II
11 T4N2M0 ПИР DIC I - - 4P PR II
12 T3N2M0 ПИР DIC III - - С S I
13 T3N1M0 ПИР DIC II - + МР MR I
14 T4N2M0 ПИР DIC II н/о n.d. + 4P PR II
15 T2N0M0 ПИР DIC II н/о n.d. - С S I
Patient Nos. Disease stage Tumor histology Chemotherapy schedule before treatment PCR after treatment result Response to chemotherapy Therapeutic pathomorphosis grade
Примечание. ЧР — частичная регрессия (более 50%); ПР — полная регрессия; МР — минимальная регрессия (25—50%); С — стабилизация (отсутствие динамики); н/о — экспрессия не определялась Note. PR, partial response (more than 50%); CR, complete response; MR, minimal response (25-50%); S, stable disease (no change); n.d., not determined.
больных, обследованных в стадии T4N2M1 (больные № 1—3), обнаружены признаки, свидетельствующие об экспрессии гена MDR1 (см. таблицу). У больных в стадии T4N2M0 экспрессия MDR1 найдена в 4 случаях (больные № 4—7). В еще более ранних стадиях: T3N2M0 и T3N1M0 (по одному случаю) мы не обнаружили экспрессию указанного гена (больные № 12 и 13). Эти данные полностью согласуются с результатами иммуногистохимического исследования экспрессии Pgp в опухолях молочной железы человека на разных стадиях прогрессии, которые также показали, что экспрессия Pgp наблюдается на более поздних этапах заболевания [6].
Наши данные свидетельствуют в пользу того, что экспрессия гена MDR1 до лечения чаще выявляется у больных ДИР (№ 1—4) по сравнению с больными ПИР (№ 5—8, 10—13), у которых экспрессия исследуемого гена выявлена всего в 3 из 8 случаев. Нельзя исключить, однако, что все больные ДИР были случайным образом взяты в более поздней стадии заболевания и что именно со стадией связана экспрессия гена MDR1.
При сопоставлении полученных результатов ПЦР со степенью лечебного патоморфоза четкая корреляция не наблюдается.
after treatment only. Another 5 cases showed no MDR1 expression before or after treatment, and low gene expression was found ini of the 2 cases studied after therapy only (see the table).
Expression of p2-M was similar in the specimen pairs studied and much lower than in MS cells (see figs. 1,3) in which initial total RNA was 1.0 g per reaction which was indicative of plateau in the curve for PCR product of this gene.
It seems that MDR1 expression before treatment was found more frequently in patients having more advanced disease at examination. For instance, MDR1 expression was detected in 3 of 3 T4N2M1 cases (Nos. 1-3), 4 of 8 T4N2M0 cases (Nos.4-7) and no expression was discovered in the two cases with a lesser disease advance: T3N2M0 and T3N1M0 (Nos.2 and 3) (see the table). These findings agree with results of immunohistochemi-cal study of Pgp expression in human breast cancer of different advance demonstrating Pgp expression in late disease stages [6].
The MDR1 expression was detected more frequently before treatment in the patients with LIC (Nos. 1-4) than in DIC (Nos.5-8, 10-13), who presented with the gene expression in 3 of 8 cases. However, it is possible that all
Что касается влияния неоадъювантной терапии на экспрессию гена MDR1, то обследование больных до и после лечения позволяет заключить, что при указанных формах РМЖ человека и трех схемах лечения экспрессия гена MDR1 существенно не изменяется и остается на низком уровне. Таким образом, МЛУ, определяемая Pgp, не развивается в ткани опухоли молочной железы в результате применяемой неоадыо-вантной химиотерапии.
ЛИТЕРА ТУРА /REFERENCES
1. Bradley G., Ling V. //Cancer Metastas. Rev. — 1994. —Vol. 13. — P. 223—233.
2. Chin J. E., Soffir R., Noonan К. E. et al. //Molec. Cell. Biol. — 1989. — Vol. 9. — P. 3808—3820.
3. Choi K., Chen C.-J., Kriegler М., Roninson I. B. //Cell. —
1988, —Vol. 53.— P. 529.
4. Christopher F. H. //Ibid. — 1995. — Vol. 82. — P. 693—696.
5. Hill В. T. //Int. J. Oncol. — 1996. — Vol. 9. — P. 197—203.
6. Linn S. С., Honkoop A. H., Hoekman K. et al. //Br.
J. Cancer. — 1996. — Vol. 74. — P. 63—68.
7. Noonan К. E., Beck C., Holzmayer T. A. et al. //Proc. natl. Acad. Sci. USA. — 1990. — Vol. 87. — P. 7160—7164.
the LIC cases were at a more advanced disease stage which was relevant for MDR1 expression.
There was no clear-cut correlation of PCR results and degree of therapeutic pathomorphosis.
As concerns neoadjuvant chemotherapy effect on MDR1 expression, comparison of the findings before and after therapy for the cancer types and schedules studied failed to discover any significant differences: MDR1 expression remained rather low. Thus, P-glycoprotein-associated MDR does not develop in breast tumor tissue as a result of neoadjuvant chemotherapy schedules applied.
8. Roninson I. B., Chin J. E., Choi K. et al. //Ibid. — 1986. — Vol. 83. — P. 4538—4542.
9. Salmon S. E., Grogan Т. M., Miller T. et al. //J. natl.
Cancer Inst. — 1989. — Vol. 81. — P. 696—701.
10. Shen D.-W., Fojo A., Chin J. E. et al. //Science. — 1986. — Vol. 232. — P. 643—645.
11. Stromskaya T. P., Filippova N. A., Rybalkina E. Yu. et al. //Exp. Tox. Pathol. — 1995. — Vol. 47. — P. 157—166.
12. Uecla K., Cardarelli C., Gottesman M. M., Pastan I. //Proc. natl. Acad. Sci. USA. — 1987. — Vol. 84. — P. 3004—3008.
Поступила 19.01.98 / Submitted 19.01.98
