CC BY
47
ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ
REVIEWS
© Коллектив авторов, 1993 УДК 616.61-018.1-022.7:579.252
A.A. Ставровская, Т.П. Стромская, A.A. Штиль
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ И ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗВИТИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
НИИ канцерогенеза
Введение
Устойчивость опухолей к цитостатикам — одна из основных проблем онкологии. Если проведение первого курса химиотерапии определяется локализацией, распространенностью, гистологической структурой опухоли, являясь, нередко, общепринятым, то терапия больных с остаточными и первично резистентными новообразованиями связана с существенными трудностями. Для выработки тактики лечения немаловажным является знание типа лекарственной устойчивости, определяющих ее механизмов, динамики развития резидуальной резистентной опухоли и др. В данной работе мы остановимся на множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток.
В основе эволюции опухолей лежат гетерогенность популяций опухолевых клеток и нестабильность их генома. Опухоль, или культура злокачественных клеток, представляет собой сложную систему взаимодействующих клонов, обладающих различными признаками [3, 24 ]. Гетерогенность позволяет клеткам выживать в условиях неблагоприятных воздействий за счет отбора предсуществующих в популяции нечувствительных (или менее чувствительных) к этим воздействиям вариантов. Повышенная генетическая изменчивость опухолевых клеток обеспечивает более частое, чем в норме, возникновение новых клонов, способных приобретать селективное преимущество в выживании и размножении.
Средства терапии злокачественных новообразований являются одним из существенных факторов отбора, влияющих на эволюцию опухоли. При монохимиотерапии или действии на культивируемые клетки одного препарата могут возникать популяции, устойчивые к нескольким агентам, различным по химической структуре и механизмам цитотоксичности. Это явление получило название "множественная лекарственная устойчивость". В перечень веществ, к которым развивается МЛУ, входят растительные алкалоиды (в том числе винка-алкалоиды и колхицин), антрацикли-ны, подофиллотоксины и некоторые другие гидрофобные препараты. Возникновение и развитие МЛУ —
A.A. Stavrovskaya, T.P. Stromskaya, A.A. Shtil
ACQUISITION OF MULTIDRUG RESISTANCE BY TUMOR CELL POPULATIONS: GENETIC MECHANISMS AND REGULARITIES
Research Institute of Carcinogenesis
Introduction
The tumor resistance to cytostatics is a major problem of oncology. While the initial chemotherapeutic cycles are determined in a routine manner with respect to tumor site, extent and histology, the therapy for residual or refractory neoplasms presents considerable difficulties. In order to choose an adequate treatment regimen it is important to be aware of the type of the drug resistance encountered, its mechanisms, dynamics of growth of the residual resistant tumor, etc. In this paper we shall speak of multidrug resistance (MDR) in tumor cells.
Heteregeneity of tumor cell populations and instability of their genome are the basis of tumor evolution. A tumor or a transformed cell culture represent a complex system of interacting clones sharing different properties [3, 24 ]. The heterogeneity allows the cells to survive in unfaivorable environment due to selection of preexisting variants insensitive (or less sensitive) to the environmental hazards. The increased genetic variability of tumor cells provides enhanced (as compared to normal cells) generation of new clones that can aquire selective advantage in survival and proliferation.
Therapeutic agents for malignant neoplasms are a signifiant factor of the selection and, hence, tumor evolution. Monochemotherapy or treatment of cell cultures with a single drug may lead to generation of populations resistant to several agents different in chemical structure and cytotoxicity mechanisms. This phenomenon is termed ’multidrug resistance’. MDR-related agents include plant alkaloids (vinca-alkaloids, colchicine, etc), anthracyclines, podophylotoxins and some hydrophobic drugs. The MDR is a multistage process: administration of initial doses of a drug results in generation of low resistant variants while further contact with the cytostatic increases the population resistance [14].
This paper analyzes one aspect of the complex problem of MDR, namely regularities of the first steps of MDR establishment in tumor cell populations. We shall
многоступенчатый процесс: воздействие первых доз препарата приводит к появлению вариантов с низкими уровнями устойчивости: при дальнейшем контакте с цитостатиком резистентность популяции увеличивается [14].
В данной работе мы представим один из аспектов сложной проблемы МЛУ — биологические закономерности становления главным образом первых и, отчасти, более поздних этапов МЛУ в популяциях опухолевых клеток. Рассмотрим следующие вопросы: 1) с какой частотой возникают варианты с МЛУ в популяциях опухолевых клеток при действии высоких и низких доз цитостатиков; 2) каковы генетические характеристики и фенотип клеток с МЛУ, обнаруживаемых на первых и последующих этапах отбора; 3) какие факторы увеличивают частоту появления резистентных клеток в популяции; Вначале приведем общие сведения об МЛУ.
Механизмы МЛУ
Существуют различные механизмы, определяющие резистентность клетки к лекарственному агенту: а) затруднение поступления цитостатика в клетку; б) ускорение транспорта препарата из клетки во внеклеточную среду; в) отсутствие (или снижение числа) мишеней для препарата в клетке; г) ускоренная репарация повреждения; д) увеличение ступени внутриклеточного катаболизма препарата и др.
Исследования фармакокинетики меченых цитостатиков показали, что все эти механизмы могут быть обнаружены в разных клеточных линиях с МЛУ, однако наиболее выраженной характеристикой большинства таких устойчивых клеток является ускоренный транспорт препаратов из клетки [14, 36]. Дальнейшее изложение проблемы будет связано именно с этим, наиболее хорошо изученным механизмом МЛУ.
Белок МЛУ Р-гликопротеин (Pgp). На модели клеток китайского хомячка линии СНО впервые было показано, что уровень устойчивости клеток к колхицину коррелирует с содержанием гликопротеина с мол. массой примерно 170 кД (Pgp, Р-170, Р-гликопротеин) [28 ]. Установлено, что Pgp — трансмембранный белок, несколько раз пересекающий плазматическую мембрану клетки (рис.) [14, 36]. Ряд данных свидетельствует в пользу того, что Pgp функционирует как активный переносчик различных токсинов из клетки во внеклеточную среду. Транспорт осуществляется, очевидно, посредством связывания молекулы цитостатика с соответствующим сайтом на цепи Pgp. Гипотетически строение молекулы Pgp не исключает образования этим белком канала для выбрасывания токсических веществ из клетки (см. рис.) [14, 36]. Молекула Pgp имеет сайты связывания с АТФ, что свидетельствует об энергозависимости функционирования белка (см. рис.). Действительно, энергетическое обеднение клеток способствует задержке выведения токсинов, а
also discuss some further steps of MDR evolution. The following problems will be considered: 1) the
frequency of MDR variant occurrence in tumor cell populations treated with low and high doses of cytostatics; 2) genetype and phenotype peculiarities of MDR cells at the initial and later selection stages; 3) factors that increase the frequency of resistant cells in populations. First, let us make a survey of some general information concerning MDR.
MDR Mechanisms
There are various mechanisms of cellular resistance to drugs, such as a) decrease in drug uptake by cells; b) enhancement of drug efflux; c) alteration of targets for drugs in cells; d) acceleration of damage reparation; e) increase in intracellular catabolism of drugs, etc.
Pharmacokinetic studies with radioactively labeled cytostatics show that all these mechanisms can be observed in various MDR cell lines, but it is the en-chanced efflux that mainly contributes to the resistance [14, 36]. Further we are going to focus on this mechanism of MDR which is studied preferentially.
MDR-associated P-glycoprotein (Pgp). As is shown on the Chinese hamster CHO line the cell resistance to colchicine correlates with the content of a glycoprotein with molecular weight about 170 kDa (Pgp, P-170, P-glycoprotein) [28 ]. Pgp is transmembrane protein (see fig. 1) [14, 36]. There is evidence that Pgp acts as an active pump excluding various toxins from cells to extracellular medium. The transport seems to be through binding of cytostatic molecules to a certain site of the Pgp molecule. The Pgp molecular structure allows the supposition that this protein forms channels for the transport of toxic agents from cells [14, 36]. The Pgp molecule has ATP-binding sites, which suggests that the protein functioning should be energy-dependent. Indeed, depletion of ATP in cells inhibits elimination of toxins, while administration of glucose enhances the transport of cytostatics, outward [14]. MDR inhibitors reverse the resistant phenotype to the sensitive one seemingly due to blockade of toxin evacuation. The inhibition (or a considerable decrease) of the drug resistance by these agents, e.g. verapamil, supports the hypothesis that this MDR type is mediated by Pgp [36 ].
The first study of Pgp in clinical samples showed its elevation in tumors of two patients after combined chemotherapy [12]. Since then there have been a number of publications on Pgp in tumors of both treated and untreated patients. Current reports also give evidence in support of the supposition that the increased Pgp expression determines both acquired drug resistance of tumors and intrinsic resistance of neoplasms originating from tissues with elevated expression of this protein (gastric, colonic, renal, adrenal, hepatic and pancreatic epithelium parenchyma) [36 ].
добавление глюкозы ускоряет транспорт цитостатиков из клетки [14]. Ингибиторы МЛУ возвращают устойчивые клетки к фенотипу чувствительных, по-видимому, за счет блокирования выведения токсинов. Отмена (или существенное снижение) этими препаратами, например верапамилом, лекарственной устойчивости служит одним из доказательств того, что данная МЛУ опосредована Pgp [36 ].
Первое сообщение об изучении Pgp в клиническом материале касалось было обнаружения его повышенного количества в опухолях двух больных после проведенной комбинированной химиотерапии [12]. С тех пор появилась целая серия работ по изучению Pgp в опухолях как леченых, так и нелеченых больных. Накапливающиеся и сегодня данные свидетельствуют в пользу того, что увеличение экспрессии Pgp определяет и приобретенную лекарственную устойчивость опухолей, и первичную резистентность тех новообразований, которые происходят из тканей с высоким уровнем экспрессии этого белка (эпителий желудка и толстой кишки, паренхима почки, надпочечника, печени и поджелудочной железы) [36 ].
Таким образом, белок Pgp является трансмембранным энергозависимым насосом, обеспечивающим активный выброс веществ из клетки. Это наиболее часто встречающийся тип, получивший название "классической" МЛУ. Молекулярной основой этого вида МЛУ является гиперпродукция белка Pgp — продукта гена mdrl (MDR1).
Гены МЛУ
Исследование генов, функция которых ассоциирована с МЛУ, началось с открытия в хромосомах резистентных клеток грызунов гомогенно окрашенных областей, представлявших собой амплифицированные участки генома [22 ]. Дальнейшие исследования выявили наличие в геноме грызунов трех, а у человека — двух генов семейства mdr (от англ. multidrug resistance) [35, 37, 41 ]. Эти гены имеют очень высокую (до 95%) степень внутри- и межвидовой гомологии [19], при этом уровни экспрессии разных генов этого семейства в клетках с МЛУ существенно различаются. Так, применение высокочувствительного метода полимеразной цепной реакции позволило обнаружить в резистентных линиях клеток человека лишь незначительные количества мРНК гена MDR2 и в 20 раз большие — гена MDR1 [15]. При трансфекции чувствительных клеток рекомбинантными конструкциями, содержащими кДНК генов семейства mdr, резистентные к цитостатикам клетки были получены только при встраивании кДНК MDR1, но не MDR2 [44, 45 ]. Эти данные позволяют считать, что основная роль в развитии МЛУ принадлежит функционированию гена MDR1. В настоящее время детально изучены нуклеотидная последовательность, экзонинтронная структура, регуляторные районы гена MDR1 [15],
Модель Р-гликопротеина(Р£р)[14].
Постулируется, что двойная а-спиральная молекула белка (6 цилиндров, проходящих через липидный бислой наружной мембраны клетки) образует канал. АТФ-связывающие домены (АТР) локализованы в цитоплазме. Сайт гликозилирования (цепь из кружочков) расположен на коротком внеклеточном фрагменте N-концевого участка белка. Молекулы цитостатиков (треугольники и шестиугольники) транспортируются из клетки наружу непосредственно через канал или после связывания с пептидной молекулой-переносчиком.
Proposed P-glycoprotein (Pgp) transmembrane orientation [14]. It is assumed that the double a-splral (6 cylinders crossing the lipid bllayer of cell membranes) forms a channel. ATP-binding domains (ATP) are localized at the Intracellular fragment. The glycosilation site (chain of circles) Is located at the short extracellular fragment of the N terminus. The drug molecules (triangles and hexagons) are transported out of the cell directly through the channel or after binding to a peptide carrier molecule.
Thus, Pgp is a transmembrane energy-dependent pump that provides active transport of substances from cells. This is the most common MDR type named "classical MDR". The molecular basis of this MDR type is overproduction of Pgp that is a product of gene mdrl (MDRI).
MDR genes
The study of MDR associated genes began with discovery of homogeneously staining regions that presented amplified genes in chromosomes of rodent resistant cells [22 ]. Further studies found in rodents and in man 3 and 2, respectively, genes belonging to the mdr (multidrug resistance) family [35, 37, 41 ]. These genes have a very high (upto 95%) intra- and interspecific homology [19 ], while various genes of this family show quite different expression in MDR cells. For instance, highly sensitive polymerase chain reaction reveals just scanty amounts of MDR2 mRNA
представлены аминокислотные последовательности и гипотетическая трехмерная структура изоформ Pgp (на основании известного сиквенса генов) [36 ]. Показано, что с высокой частотой МЛУ определяется амплификацией генов [22 ].
Частота появления вариантов с МЛУ в популяциях опухолевых клеток
Воздействие высоких доз цитостатиков на популяции опухолевых клеток может приводить к отбору редких генетических вариантов, предсуществовавших в популяции [5, 22, 33]. При этом погибают все чувствительные клетки и выживают крайне мало: одна резистентная из 100 тыс. — 10 млн клеток (частота 10'5
п
— 10’ ) [42 ]. С помощью флуктуационного теста определена частота спонтанного появления устойчивых к колхицину вариантов в культурах клеток мыши линии ЗТЗ и L Она составила соответственно 3,6-10~6 и 210'5 на клетку на генерацию [5, 33 ]. Сходные, а иногда и более высокие частоты появления лекарственно-устойчивых вариантов обнаружили и авторы, использовавшие другие цитостатики (метотрексат, PALA) — вещества, отбирающие клетки с амплификацией генов [22 ]. R. Jonhston и соавт. [27 ] нашли, что спонтанная амплификация гена дигидрофолатредуктазы, фермента, обеспечивающего устойчивость к метотрексату, появляется в популяции клеток китайского хомячка СНО с частотой 810'4. Эта частота может еще более возрастать в популяциях клеток, уже резистентных к цитостатику [27 ]. При флуктуационном анализе популяций трансформированных мышиных клеток L-53, устойчивых к колхицину, мы также обнаружили повышение частоты устойчивых вариантов [6 ].
Все упомянутые цифры достаточно высоки и превышают частоту появления классических мутантов клеток на 1—2 порядка, а иногда и более. Это может свидетельствовать о том, что агенты, отбирающие резистентные клетки с генетическими изменениями, определяющими МЛУ (амплификацией генов), могут увеличивать частоту появления таких вариантов. Показано также, что амплификация генов в опухолевых клетках — более частое событие, чем мутации [27 ], и что в малигнизированных клетках амплификация генов возникает чаще, чем в соответствующих нормальных популяциях [38 ]. Данные этих работ свидетельствуют также о том, что амплификация генов с повышенной частотой возникает в некоторых клетках с лекарственной устойчивостью.
Воздействие противоопухолевых препаратов в невысоких концентрациях может приводить к адаптации клеток к медикаментам. Длительная (в течение 2— 3 нед) обработка культур клеток мезотелиомы человека умеренными дозами винкристина, винбластина, до-ксорубицина или виндезина приводила к значительному (в 9—16 раз) возрастанию количества клеток, экспрессирующих Р-гликопротеин [31 ]. Авторы не на-
in human resistant cells while the quantity of MDR1 mRNA is 20-fold greater [15]. Transfection of sensitive cells with recombinant constructions containing mdr family cDNAs results in occurrence of drug resistant cells only after insertion of MDR1, but not MDR2 [44, 45]. These data suggest that MDR] gene makes the greatest contribution to MDR establishment. The nucleotide sequence, exon-intron structure, regulatory regions of MDR1 gene have been described [15]. Amino acid sequence and 3-dimensional structure of Pgp have been derived from mdr I sequence [36].
Occurrence of MDR Variants in Tumor Cell Populations.
Treatment of tumor cell populations with high doses of cytostatics may lead to selection of rare variants preexisting in the population [5, 22, 23 ]. The outcome of this is death of all sensitive cells and extremely poor survival of resistant ones (1 per 100,000 — 1,000,000 cells, i.e. 10"5—10'7) [42]. The rate of spontaneous generation of colchicine-resistant cell variants in cultures of 3T3 and L mouse lines as determined by flue-tuation test was 3.6 x 10' and 2 x 10' , respectively, per cell per generation [5, 33 ]. Similar or even higher frequencies of drug resistant variants are reported when other cytostatics (methotrexate, PALA) are used for selection of cells with amplifiation [22 ]. By R. Johnston et al. [27] spontaneous amplification of dihydrofolatreductase gene coding the enzyme responsible for resistance to methotrexate occurs in CHO cells at a rate of 8 x 10~4. This rate may be still higher in populations of drug-resistant cells [27 ]. Fluctuation test showed that drug resistant variants were discovered at increased frequency in colchicine-resistant transformed murine cells L-53 [6 ]. All the above-mentioned values are rather high and 1—2 orders as great as generation rate of classical mutant cells. This suggests that agents selecting cells with genetic alterations determining MDR (gene amplification) may augment the rate of generation of such variants. Gene amplification in tumor cells is a more common event than mutation [27], and occurs more frequently in malignant cells as compared with their normal counterparts [38 ]. Data reported in the mentioned publications also show that gene amplification is more frequent in some drug resistant cells.
Administration of an antitumor agent at low concentration may lead to cellular adaptation to the drug. Long-term (2—3 weeks) treatment of human mesothelioma cell culture with moderate dose vincristine, vinblastine, doxorubicin or vindesine results in a considerable (9—16-fold) rise in the frequency of Pgp+ cells [31 ]. There is no proliferation of cells in cultures treated with cytostatics, thus there is no selective proliferation of resistant cells. The cytostatic removal from
блюдали размножения подвергающихся воздействию цитостатиков культур, что свидетельствует об отсутствии избирательной пролиферации резистентных клеток. При удалении цитостатика из среды число Pgp+-клеток быстро снижалось. Следовательно, отбора стабильных генетических вариантов в этом случае не было, и большая часть популяции оказалась временно адаптированной к токсическому воздействию лекарств. Описана адаптация клеток и к другим химиотерапевтическим агентам, например к метотрексату [30].
Таким образом, существует по меньшей мере два процесса, определяющих появление популяций опухолевых клеток с МЛУ: а) появление (спонтанное или индуцированное) редких генетических вариантов — резистентных к цитостатикам клеток с последующим их размножением в результате селекции этими препаратами; б) адаптация клеточных популяций к химическим агентам. Будут ли появляться варианты первого или второго типа, очевидно, зависит от дозы препарата: при высоких концентрациях вещества отбираются "генетические" варианты, при длительной обработке низкими концентрациями цитостатиков происходит адаптация клеток к токсическому воздействию.
Генетические характеристики и фенотип клеток с МЛУ, обнаруживаемых на первых этапах отбора
Редкие варианты, отобранные высокими концентрациями цитостатиков. Анализ линий клеток человека с МЛУ показывает, что в них в большинстве случаев обнаруживается гиперэкспрессия гена MDR1 и его продукта — Pgp [11 ]. Менее чем в 1/4 исследованных линий обнаруживают другие причины МЛУ, в первую очередь снижение активности некоторых изоформ фермента топоизомеразы II, или другие изменения, такие как увеличение степени репарации ДНК или изменение внутриклеточного распределения лекарств [11]. Этот тип лекарственной устойчивости называют атипичной МЛУ, или at-MDR. Недавно найдены мутации в гене топоизомеразы II, определяющие один из видов at-MDR. В большинстве клеток с "классической" МЛУ находят амплификацию генов семейства mdr [22 ]. Описаны также отдельные варианты с достаточно высокими уровнями лекарственной устойчивости, в которых резистентность определяется не амплификацией, а гиперэкспрессией гена MDR1 [11]. В отдельных линиях опухолевых клеток человека с повышенным количеством Pgp найдены дополнительные изменения ферментов обмена глутатиона — одной из защитных систем клетки [11]. Отличает все эти варианты от клеток, полученных в результате адаптации, то, что они относительно редки, лекарственная устойчивость их достаточно стабильна, генная амплификация утрачивается лишь при длительном культивировании клеток в отсутствие селективного агента [6].
the medium leads to a rapid decrease in Pgp+ cells. So there is no selection of stable genetic variants in this case, and the major portion of the population is temporarily adapted to the drug. There are also reports of cellular adaptation to other agents, particularly to methotrexate [30].
So, there are at least two processes determining generation of MDR tumor cell populations, namely: a) generation (spontaneous or induced) of rare genetic variants resistant to cytostatics and their further preferential proliferation as a result of selection by these drugs; and b) adaptation of cell populations to chemicals. The type of the generated cells seems to depend upon the drug dose: administration of agents at high doses leads to selection of "genetic" variants, while long-term treatment with low dose cytostatics results in cell adaptation to the toxic effect.
Genetic Characteristics and Phenotype of MDR Cells at Initial Selection Stages
Rare variants selected with high concentration cytostatics. Human MDR cell lines mostly show overexpression of MDR1 gene and its product Pgp [11 ]. In less than one forth of the lines studied MDR was due to another reason, mainly to decreased activity of topoisomerase II isoforms, or other factors such as increased DNA reparation or alteration in intracellular distribution of the drug [11]. This type of MDR is referred to as "atypical MDR" or "at-MDR”. Mutations in the topoisomerase II gene are responsible for some cases of at-MDR. Most cells with classical MDR exhibit amplification of genes of the mdr family [22 ]. There are also variants with comparatively high drug resistance caused by overexpression of MDR I rather than by gene amplification [11]. Some human tumor cell lines with elevated Pgp also show changes in glutathione metabolism, a cellular defence system [11]. The distinction of these variants from cells generated as a result of adaptation is their relatively rare occurrence, rather stable drug resistance, loss of gene amplification after long-term cell cultivation without the selective agent [6 ].
Variants selected with low doses of cytostatics. Cells surviving after treatment with relatively low cytostatic doses are considerably less stable. Cultivation of human mesothelioma cell population in drug-free medium for less than a week resulted in decrease in the initially elevated number of MDR cells up to the control level [31 ]. The resistance of variants at initial steps of selection is often not typical MDR. W. Beck and M. Danks [11] point out that overexpression of MDR 1 gene without its amplification is the most frequent at low levels of drug resistance and characterizes human tumors refractory to cytostatics. Human lung tumors resistant to low dose doxorubicin did not express mRNA MDR1 or Pgp, though demonstrated
Варианты, появившиеся в результате воздействия на клеточные популяции низких доз цитостатиков.
Клетки, выжившие при воздействии относительно низких концентраций цитостатиков, гораздо менее стабильны. Менее чем через неделю культивирования в среде без селективного агента в популяции клеток мезотелиомы человека количество Pgp+-mieTOK, ранее повышенное, снижалось до уровня контроля [31 ]. Резистентность вариантов первых шагов селекции нередко не представляет собой "типичную" МЛУ. W. Beck и М. Danks [11] отмечают, что гиперэкспрессия гена MDR1 без его амплификации особенно часта при низких уровнях лекарственной устойчивости, а также характерна для резистентных к цитостатикам опухолей человека. Клетки опухоли легкого человека, устойчивые к низким концентрациям доксорубицина, не экспрессировали мРНК MDR1 и Pgp, хотя и обладали кросс-резистентносгью к препаратам круга МЛУ [9]. В большей части линий мышиного эритролейкоза DS-19 первого этапа селекции вибластином экспрессия Pgp не отмечена, его удавалось выявить лишь в популяциях дальнейших шагов отбора цитостатиком [34]. Однако, по данным Т. Licht и соавт. [31 ], адаптация клеток мезотелиомы плевры человека к винкристину, виндезину, доксорубицину сопровождалась экспрессией Pgp.
Обычно дальнейшее воздействие на популяции опухолевых клеток грызунов in vitro того же селективного агента приводит к селекции Pgp+-BapnaHTOB с амплификацией гена mdrl [9 ]. По-видимому, здесь мы имеем дело с определенным характером эволюции МЛУ: на первых этапах отбора резистентность может определяться различными причинами (как функцией Р-гликопротеина, так и другими механизмами), при дальнейшей селекции повышающимися дозами цитостатиков отбираются чаще всего варианты с типичной МЛУ. Нельзя исключить, что тип МЛУ на первых этапах развития лекарственной устойчивости определяется тканевой принадлежностью клеток. По имеющимся данным, не только ген MDR1 в разной степени экспрессирован в разных тканях, но и экспрессия различных генов этого семейства имеет разную тканевую специфичность [18]. Возможно, механизмы устойчивости, особенно на первых этапах отбора, связаны с селективным агентом.
Изменения фенотипа клеток с МЛУ сложны и многообразны. Не имея возможности разобрать подробно эту проблему, мы остановимся на частичной реверсии фенотипа малигнизированных клеток при МЛУ. Обнаружена корреляция уровня МЛУ со снижением опухо-леродности клеток и удлинением латентного периода появления опухоли [1, 4, 13]. Большинство авторов наблюдали такую реверсию малигнизации при высоких уровнях резистентности МЛУ, однако R. Ganapathi и соавт. [21 ] обнаружили снижение спонтанной метастатической активности клеток мела-
cross-resistance to MDR-related drugs [9 ]. There was no Pgp expression in most sublines of murine erythro-leukemia DS-19 at the initial stage of selection with vincristine, the protein was detected in populations of further selection steps only [34 ]. However, by data of T. Licht et al. [31 ] the adaptation of human pleural mesothelioma cells to vincristine, vindesine, doxorubicin was accompanied with Pgp expression.
Further in vitro treatment of rodent tumor cell populations with the same selective agent usually leads to selection of Pgp+ variants with mdrl gene amplification [9]. It seems that we observe a certain pattern of MDR evolution in this case: at the initial selection stage the resistance may be due to various reasons (P-glycoprotein or other mechanisms), further selection with increasing cytostatic doses mainly results in survival of typical MDR variants. There is a possibility that at the initial stages of drug resistance the MDR depends upon tissue origin of the cells. Besides the fact that MDR1 gene expression varies in different tissues the expression of other genes of the mdr family also has a different tissue specificity [18 ]. It is probable that the mechanisms of resistance may depend on the selctive agents, especially at the initial stages of selection.
Alterations on MDR cell phenotype are numerous and complex. As we cannot consider this problem in detail here let us focus on partial reversion of malignant phenotype of MDR cells. There is correlation of the MDR level, decreased tumorigenicity of cells and elongation of tumor latency [1, 4, 13]. Most authors observed the reversion of malignancy at high levels of MDR, but R. Ganapathi et al. [21 ] discovered inhibition of spontaneous metastatic activity in B16 mouse melanoma already at a 5-fold level of resistance to adriamycin. However, other researchers fail to establish direct relation between tumor cell metastasizing and MDR [23]. Som MDR cell lines demonstrate increased anchorage dependence of growth, as well as lower rate of proliferation [ 1 ]. There are reports on coincidence of MDR and cell differentiation. MDR1 gene is shown to have greater expression in more differentiated neuroblastoma cells [10]. We have found out that even the initial MDR levels are characterized by increase in the number of more differentiated cell variants [2, 8 ].
The above-mentioned data show that MDR in malignant cells may be accompanied with partial reversion of malignancy, and MDR variants differ from the par-entl population both in drug resistance and some other traits.
Factors Increasing MDR Fraction in Tumor Cell Population
Rare variants selected with high doses of cytostatics. This problem was studied by evaluation of colony for-
номы мыши В16 уже при 5-кратном уровне устойчивости к адриамицину. Вместе с тем другие исследователи не находят прямой связи между метастазированием опухолевых клеток и МЛУ [23 ]. В ряде клеточных линий с МЛУ найдено увеличение зависимости размножения клеток от субстрата, замедление темпа пролиферации [ 1 ]. Накапливаются данные о связи становления МЛУ и процессов дифференцировки. Показана повышенная экспрессия гена MDR1 в более дифференцированных клетках нейробластом [10]. Нами установлено, что уже первые уровни МЛУ характеризуются накоплением более дифференцированных вариантов клеток [2, 8 ].
Приведенные данные показывают, что в малигнизи-рованных клетках МЛУ может сопровождаться частичной реверсией признаков злокачественности и что варианты с МЛУ отличаются от исходной популяции клеток не только лекарственной устойчивостью, но и рядом других признаков.
Факторы, повышающие частоту вариантов с МЛУ в популяциях опухолевых клеток
Редкие варианты, отобранные высокими концентрациями цитостатиков. Методическим подходом, применяемым для решения данного вопроса, служила оценка частоты образования колоний клеток в присутствии цитостатиков. Доза цитостатика обычно была такой, при которой в контроле (без добавления модификатора) клетки выживали с частотой не выше 10 4. Оказалось, что большая группа различных соединений увеличивает эту частоту: промоторы опухолевого роста (ТРА — 12-0-тетрадеканоил-форбол-13 ацетат, мезе-реин и др.), химические канцерогены (7,12-диметил-бенз(а)антрацен, 20-метилхолантрен, афлатоксин В1), факторы роста (эпидермальный фактор роста, инсулин) [22 ]. Было обнаружено, что даже такое соединение, как аскорбиновая кислота, учащало появление колоний лекарственно-устойчивых клеток с амплификацией гена mdrl [22]. Нужно подчеркнуть, однако, что исследования такого рода выполнены на клетках грызунов и мы не знаем, подчиняются ли клетки человека тем же закономерностям. Поскольку в большинстве случаев речь, по-видимому, идет об амплификации генов, то вполне вероятно, что агенты, влияющие на это генетическое событие, должны и в клетках человека учащать появление вариантов с амплификацией генов. По мнению известного американского исследователя R. Schimke [40], любые агенты, влияющие на синтез ДНК, должны учащать и генную амплификацию.
Варианты, появившиеся в результате воздействия на клеточные популяции низких доз цитостатиков.
Методические подходы, применявшиеся в работах этого раздела, отличаются от предыдущих. В обсуждаемых здесь работах о влиянии модификатора на устойчивость судили по изменению экспрессии гена MDR1
mation by cells in the presence of a cytostatic. The criterion for choice of the cytostatic dose was cell survival of 10~4 or less. The authors discovered that there was a large variety of compounds able to increase this rate, including tumor promoters (TPA — 12-0-tetra decanoyl-phorbol-13-acetate, meserein, etc.), chemical carcinogens (7,12-dimethyl-benz(a) anthracene, 20-methylcholanthrene, aflatoxin Bl), growth factors (epidermal growth factor, insulin) [22]. It was found that even ascorbic acid enhanced appearance of drug resistant colonies. These cells showed amplification of mdrl gene [22]. It should be emphasized, however, that the study was performed on rodent cells, and we are not sure whether human cells obey the same regularities. It is quite possible that agents influencing gene amplification may enhance generation of variants with this genetic alteration in human cell populations. A prominent American scientist S. Schimke believes that any agent influencing DNA synthesis must increase occurrence of gene amplification [40].
Variants selected with low doses of cytostatics. The effect of modifiers on the resistance was evaluated by alterations in MDR1 (mdrl) expression or in Pgp level, rather than by frequency of resistant cell colonies or by cell death inhibition in test groups treated with a modifier. In rodent cells the mdrl expression increased in response to short-term (8 h) exposure to adriamycin, dounorubicin, m-amsacrine, mitoxantrone, but remained unchanged after treatment with vepeside, colchicine, vinblastine. These drugs also decreased the topoisomerase II gene expression [16]. However, the authors failed to detect up-regulation of MDR1 gene in response to the cytostatics in human cell systems [16]. However, in experiments with recombinant DNA molecules the MDR1 promoter in human cells was activated by vincristine, daunomycin, adriamycin, colchicine [29].
The question may arise whether frequency of low-level MDR cells can be influenced by a limited number of substances or there are many MDR-inducing factors. It appears that there is a broad range of such factors. Sublethal X-ray may lead to generation of human cell populations expressing Pgp and demonstrating MDR [25]. Exposure of human renal adenocarcinoma cells (HTB-46 line) to heat shock, sodium arsenite or cadmium chloride induced elevation of mRNA MDR1, Pgp, and increased resistance to vincristine [17]. Immediately after incubation of human breast cancer cells under hypoxia the culture became resistant to adriamycin and actinomycin D for some time. This transient drug resistance was non-Pgp-mediated [39]. This fact supports the previously mentioned findings of the initial stage MDR being determined by mechanisms different from Pgp functioning. The results of these experiments suggest
(mdrl) или количества Pgp, а не только по появлению колоний резистентных клеток или по уменьшению степени гибели клеток от цитостатика в группе опыта, куда был добавлен модификатор. В клетках грызунов экспрессия гена mdrl возрастала в ответ на кратковременное (8 ч) воздействие адриамицина, дауномицина, m-амсарина, митоксантрона, но не вепезида, колхицина, винбластина. Отметим, что одновременно эти препараты, кроме того, снижали в клетках активность гена топоизомеразы II [16]. Авторам, однако, не удалось обнаружить повышения экспрессии гена MDR1 человека в ответ на цитостатики [16]. В противоположность этому в опытах с рекомбинантными молекулами ДНК показано, что промотор гена MDR1 человека может быть активирован такими препаратами, как винк-ристин, дауномицин, адриамицин, колхицин [29 ].
Правомерен вопрос, влияет ли на появление клеток с низкими уровнями МЛУ лишь строго определенный круг веществ или существуют и иные факторы, индуцирующие МЛУ. Оказалось, что таких факторов много и они разнообразны. Сублетальное рентгеновское облучение клеток in vitro может приводить к возникновению популяции клеток опухолей человека, экспрессирующих Pgp и обладающих МЛУ [25]. В клетках аденокарциномы почки человека (линия НТВ-46) тепловой шок, обработка натрия арсенитом или кадмия хлоридом вызывали увеличение количества мРНК MDR1, Pgp и степени устойчивости к винкристину [17]. Непосредственно после инкубации клеток опухоли молочной железы человека в условиях гипоксии культуры оказывались в течение некоторого времени устойчивыми к адриамицину и актиномицину D. Эта транзиторная лекарственная устойчивость оказалась не связанной с функцией Р-гликопротеина [39 ]. Указанный факт совпадает с обсуждавшимися выше данными, показывающими, что на первых этапах МЛУ лекарственная устойчивость нередко определяется иными, не связанными с Pgp механизмами. Эти опыты свидетельствуют о том, что МЛУ может являться ответом клеток на разнообразные повреждающие воздействия.
В ряде работ обнаружена коэкспрессия гена MDR1 и генов других защитных систем клетки. Так, при действии ксенобиотиков, в том числе канцерогенов, увеличивается экспрессия генов MDR1 и цитохрома Р-450, принадлежащего к системе многоцелевых оксидаз
— одной из основных детоксифицирующих систем клетки [43 ]. Введение в клетки одного из генов теплового шока приводило к резистентности клеток-транс-фектантов к даунорубицину, винкристину, актиномицину D [26]. Таким образом, экспрессия гена MDR1 координирована с экспрессией генов, кодирующих белки других защитных систем клетки. К этим результатам примыкают данные, полученные с промотором экспериментального канцерогенеза ТРА, также повышающим частоту появления вариантов клеток, устой-
that cells may develop MDR in response to various damaging effects.
Some publications point out coexpression of MDR1 and genes of other cellular defence systems. For instance, xenobiotics including carcinogens initiate expression of genes MDRJ and cytochrome P-450, an oxidase belonging to one of the main cellular detoxication systems [43 ]. Introduction of a heat shock gene in cells resulted in resistance of transfectant cells to daunorubicin, vincristine, actinomycin D [26]. Thus, expression of MDR1 gene is coordinated with expression of genes coding proteins of other cellular defence systems. These findings correspond with data obtained in experiments using a promoter of experimental carcinogenesis TPA which also increases the rate of cell variants resistant to low dose MDR-related drugs. Short-term (upto 72 h) exposure of human KB line to TPA increased the number of cells surviving after treatment with vincristine, vepeside, mitoxantrone. The increase in the survival was much higher than could be expected if TPA induced gene mutations [20 ]. The authors put forward the hypothesis that TPA increases efficiency of the cellular defence system.
Agents inducing cell differentiation (sodium butirate, retinoic acid, dimethylsulfoxide) enhance expression of MDRJ in human neuroblastoma and colonic adenocarcinoma cell lines [10, 32]. For example, exposure to sodium butirate induced a 20— 25-fold rise in the mRNA MDR] level in 4 of 8 colonic tumor lines soon after treatment. The MDR1 expression was increased while the differentiation inducers remained in the culture medium and fell rapidly after the cells were washed from the agents [32].
It should be noted that the elevartion in mRNA MDR1 was not always accompanied with establishment of drug resistance. There are several explanations of this phenomenon. It is noteworthy that cells resistant to cytostatics may fail to arise in spite of increased expression of MDR1 gene under treatment with agents inducing cell differentiation. The increase in the MDRJ expression and further MDR establishment probably depend on the grade of cellular differentiation. It was shown that in human colonic cancer line SW-620 the elevation of MDR1 mRNA in response to differentiation-inducing agents is not accompanied with establishment of resistance to doxorubicin and vinblastine. However, in another line of the same tissue origin possessing higher differentiation (HCT-15) the same agents induced drug efflux [32 ]. As a whole the problem of regulation of MDRJ expression with various drugs and MDR of tumor cell requires further consideration.
So, the action of numerous inducers of MDRJ gene on tumor cell populations results in activation of the
чивых к низким дозам препаратов круга МЛУ. Кратковременная (до 72 ч) экспозиция культивируемых клеток человека линии КВ с ТРА увеличивала число клеток, выживших после обработки винкристином, ве-пезидом, митоксантроном. Степень роста числа устойчивых к действию цитостатиков клеток была гораздо выше, чем можно было бы ожидать в случае индукции ТРА генных мутаций [20 ]. Авторы выдвигают гипотезу о том, что ТРА увеличивает эффективность работы имеющейся в клетках широкой системы защиты.
Агенты, вызывающие дифференцировку клеток (натрия бутират, ретиноевая кислота, диметилсульфок-сид), увеличивали экспрессию гена MDR1 в клетках некоторых линий нейробластом и аденокарциномы толстой кишки человека [10, 32]. Так, рост количества мРНК MDR1 в 20—25 раз отмечен для 4 из 8 линий опухолей толстой кишки под влиянием натрия бутира-та в ранние сроки после воздействия. Экспрессия MDR1 оставалась повышенной пока индукторы диф-ференцировки находились в культуральной среде и быстро снижалась после отмывания клеток от вещества [32].
Нужно заметить, что увеличение количества мРНК MDR1 в клетках не всегда сопровождается возникновением резистентности. Высказывается ряд предположений, объясняющих этот феномен. Существенно, что клетки, резистентные к цитостатикам, могут не появиться, несмотря на повышение экспрессии гена MDR1 под влиянием агентов, вызывающих дифференцировку клеток. Возможно, повышение экспрессии гена MDR1 и последующее возникновение МЛУ зависят от степени дифференцировки клеток. Показано, что в клетках линии SW-620 опухоли толстой кишки человека увеличение количества мРНК MDR1 в ответ на агенты, вызывающие дифференцировку, не сопровождалось появлением устойчивости к доксорубицину и винбла-стину, в то время как клетки другой линии той же тканевой принадлежности, но более дифференцированные (НСТ-15), начинали выбрасывать эти препараты [32 ]. В целом проблема регуляции экспрессии гена MDR1 различными препаратами и МЛУ популяций опухолевых клеток требует дальнейшего изучения.
Таким образом, действие на популяции опухолевых клеток многочисленных индукторов экспрессии гена MDR1 сводится к активации сложной системы защиты клетки от разнообразных воздействий и к стимуляции дифференцировки.
Заключение
Рассмотренные данные свидетельствуют о том, что можно выделить по меньшей мере два основных процесса, приводящих к образованию популяций опухолевых клеток, характеризующихся МЛУ: 1) адаптация к токсическому воздействию значительной части популяции опухолевых клеток при воздействии относительно низких доз цитостатиков; 2) спонтанное или
complex system of cellular defence and in promotion of cellular differentiation.
Conclusions
The data considered in this paper distinguish at least two main processes leading to generation of MDR cell populations: 1) adaptation of a considerable fraction of tumor cell population to toxic action of a low dose cytostatic, and 2) spontaneous or induced generation of rare genetic variants, i.e. resistant cells preferentially proliferating as a result of selection with high dose cytostatics. Depending on conditions the resistant populations may have considerable genetic distinctions, e.g. cells of the first type often show increased expression of MDRl gene, the resistance in many cases is not associated with Pgp functioning. The phenotype of the second cell variant is more often determined by amplification of the mJr-containing region and by overexpression of MDRl gene. Rare genetic variants may obviously arise spontaneously and independently of toxic effects; drugs may also induce genetic alterations that further cause generation of such variants.
The problem of cell adaptation to cytostatics is much less clear. It remains unknown whether there are certain cell variants that adapt themselves to (or are selected by) low dose drugs or any cell in a population may undergo adaptation. The rate of such resistant cells is very high (several cells per 100), the drug resistance phenotype is not stable. This may be evidence of the fact that each cell may develop such transient drug resistance, and the resistance is due to changing activity of one or several genes in all the cells. It is evident, however, that a considerable fraction of cell population die soon after treatment with cytostatics. The surviving cells can respond to a wide range of damaging effects simultaneously. Does the phenotype of the surviving cells differ from that of the dying ones? There are a number of facts supporting the opinion that the surviving cells are special cell variants. First, even early stages of selection with colchicine of cells from different mammalian tissues result in survival of MDR variants with higher differentiation as compared to the rest of the population. Secondly, cells at the initial stages of selection for MDR show expression of genes of cell protection systems. Thirdly, cells transformed by carcinogens have specific phenotype that may be conventionally termed "defence phenotype": cells of rat hepatic preneoplastic nodules and hepato-carcinonas induced with carcinogens are resistant to carcinogenic agents and contain elevated amount of MDRl mRNA [43 ].
Thus, already the initial treatment with low dose cytostatics leads to a rather high frequency selection of special variants a) with greater ability to general defence reaction (ability to express proteins of several
индуцированное появление редких генетических вариантов — резистентных клеток — и последующее их размножение в результате селекции высокими концентрациями цитостатиков. Резистентные популяции, появившиеся в результате этих двух процессов, в генетическом плане могут значительно отличаться: в клетках первого типа нередко отмечается повышение экспрессии гена MDR1; достаточно часто резистентность определяется не опосредованными Pgp механизмами. Фенотип вариантов второго типа гораздо чаще определяется амплификацией участка генома, в состав которого входят гены семейства mdr и связанная с этим гиперэкспрессия MDR1. Очевидно, что редкие генетические варианты клеток могут возникать в популяции спонтанно и независимо от токсического воздействия; химиопрепараты могут индуцировать генетические изменения, определяющие появление таких вариантов.
Гораздо менее ясен вопрос об адаптированных к действию цитостатика клетках. Остается неясным, адаптируются ли (или иногда отбираются) низкими дозами препаратов какие-то определенные варианты клеток или в процессе адаптации может участвовать каждая клетка популяции. Частота появления резистентных клеток очень высока (проценты всей популяции), фенотип лекарственной устойчивости нестабилен. Это может свидетельствовать о том, что такая транзиторная лекарственная устойчивость свойственна каждой клетке и достигается за счет изменения активности одного или нескольких генов во всех клетках. Несомненно, однако, что значительная часть клеточной популяции на первых этапах воздействия цитостатиков погибает. Выжившие клетки обладают способностью ответить одновременно на широкий круг повреждающих воздействий. Отличается ли фенотип оставшихся клеток от фенотипа погибающих? В пользу того, что выжившие клетки представляют собой специальные варианты, свидетельствуют следующие факты. Во-первых, показано, что уже на ранних этапах селекции колхицином клеток разных видов млекопитающих, принадлежащих к разным тканям, происходит отбор вариантов с МЛУ, обладающих более дифференцированным, чем остальная популяция, фенотипом. Во-вторых, в клетках первых этапов селекции на МЛУ наблюдается экспрессия генов нескольких защитных систем клетки. В-третьих, показано, что трансформированные канцерогенными веществами клетки обладают специфическим фенотипом, который условно можно назвать "фенотипом защиты": клетки пренеопла-стических узелков в печени крыс и гепатокарцином, индуцированных канцерогенами, резистентны к канцерогенным веществам и содержат повышенное количество мРНК гена mdrl [43 ].
Таким образом, уже на первых этапах воздействия низких доз цитостатиков происходит селекция достаточно часто встречающихся в популяции особых вариантов со следующим фенотипом: а) с большей способ-
defence systems), b) often with higher grade of differentiation. The selective exposure continued, the cells with such phenotype may be basis for further selection of MDR variants with greater resistance, as they are fit best of all for defence from damaging environmental agents. It is not clear why this complex phenotype includes both cellular defence proteins and differentiation proteins. It is probable that the coexpression of "defence" and differentiation genes is associated with slower proliferation of the cell variants considered. The activity of these genes is possibly regulated by some common transfactors. Though there is room for other suppositions. The hypothesis requires further experimental verification.
We believe that the data considered above are of great theoretical interest because they concern problems of cell differentiation and reversion of malignancy, as well as complex phenotypic alterations of normal and tumor cells. These alterations are in agreement with the notion of general adaptation syndrome [7]. The data presented may also be of interest in treatment of tumors refractory to chemotherapy.
ЛИТЕРАТУРА/ REFERENCES
1. Абдряшитов P.И., Бершадский А.Д., Какпакова E.C. II Экс-пер. онкол. — 1989. — № 5. — С. 25—30.
2. Джураева Ф.Х., Ставровская А.А., Стром-ская Т.П. II Вести. ВОНЦ. — 1991. — N? 4. — С. 7—12.
3. Дугина В.Б., Ставровская А.А. II Бюл. экспер. биол. —
1987. — № 6. — С. 713—714.
4. Какпакова Е.С., Массино Ю.С., Малахова Е.М. II Генетика.
— 1981. — № 3. — С. 460—468.
5. Копнин Б.П., Ставровская А.А. II Там же. — 1978. — № 9.
— С. 1625—1632.
6. Копнин Б.Л., Ставровская А.А. II Там же. — 1979. — № 12.
— С. 2233—2235.
7. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. — М., 1981.
8. Ставровская А.А., Стромская Т.П., Чернова О.Б., Джурае-
ва О.Х. II Молекул, генетика. — 1990. — № 5. — С. 3—7.
9. Baas F., Jongsma А.Р.М., Broxterman H.J. et al. 11 Cancer Res.
— 1990. — Vol. 50. — P. 5392—5398.
10. Bates S.E., Mickley LA., Chen Y.-N. et al. // Molec. cell Biol.
— 1989. — Vol. 9. — P. 4337—4344.
11 .Beck W.T., Danks М.К II Molecular and cellular biology of multidrug resistance in tumor cells / Ed. I.B. Roninson. — New York — London, 1991. — P. 3—55.
12. Bell D.R., Gerlach J.H., Kartner N. et al. // J. clin. oncol. — 1985. — Vol. 3. — P. 311—315.
13. Biedler J.L., Riehn H., Peterson R.H.F., Spengler B.A. II J. nat. Cancer Inst. — 1975. — Vol. 55. — P. 671—680.
14. Bradley C., Juranka P.E., Ling V. II Biochim. biophys. Acta. —
1988. — Vol. 948. — P. 87—128.
15. Chin Soffir R., Noonan К et al. II Molec. cell Biol. — 1989.
— Vol. 9. — P. 3808—3820.
16. Chin K.V., Chauhan S.S., Pastan I., Gottesman M.M. II Cell Growth. Different. — 1990. — Vol. 1. — P. 361—365.
17. Chin K.V., Tanaka S., Darlington G. et al. // J. biol. Chem. —
1990. Vol. 265. — P. 221—226.
18. Croop J.M., Raymond М., Haber D. et al. // Molec. cell Biol. —
1989. — Vol. 9. — P. 1346—1350.
19. Endicott J., Sarangi F., Ling V. II J. DNA Sequencing Mapping.
— 1991. — Vol. 2. — P. 89—101.
ностью к общей защитной реакции (способностью экспрессировать белки нескольких защитных систем клетки), б) нередко — с более высокой степенью диф-ференцировки. При продолжении селективного давления клетки с таким фенотипом могут явиться основой для дальнейшей селекции более резистентных вариантов с МЛУ, поскольку они остаются наиболее приспособленными для защиты от летальных воздействий внешней среды. Почему в этот сложный фенотип входят не только белки защитных систем клетки, но и нередко дифференцировочные белки, пока неясно. Нельзя исключить, что коэкспрессия "генов защиты" и генов дифференцировки связана с более медленным размножением обсуждаемых вариантов клеток. Возможно, активность этих генов регулируется какими-то общими транс-факторами. Возможны и другие предположения. Высказанная здесь гипотеза требует дальнейших экспериментальных доказательств.
По нашему мнению, рассмотренные выше данные представляют несомненный теоретический интерес, затрагивая проблемы дифференцировки и реверсии признаков злокачественности, а также проблему комплексных изменений фенотипа клеток вообще и опухолевых клеток в частности. Они укладываются в представления об общем адаптационном синдроме [7 ]. Эти данные могут представить интерес и для разработки тактики лечения больных с резистентными к химиотерапии новообразованиями.
20. Ferguson P.J., Cheng Y.-C. II Cancer Res. — 1987. — Vol. 47.
— P. 433—441.
21. Ganapathi R., Grabowski S., Schmidt H. et al. // Ibid. — P. 3464—3468.
22. Gudkov A. V., Kopnin B.P. II Sov. Sei Rev. D. Physicochem. Biol. — 1987. — Vol. 7. — P. 95—136.
23. Hanania N., Boyano M.-D., Mangin C., Poupon M.-F. II Anticancer Res. — 1991. — Vol. 11. — P. 473—480.
24. Heppner G.H. // Cancer Res. — 1984. — Vol. 44. — P. 2259— 2265.
25. Hill B.T., Deuchars K., Hosking L.K. et al. // J. nat. Cancer Inst. — 1990. — Vol. 82. — P. 607—612.
26. Hout J., Roy S., Lambert H.M. et al // Cancer Res. — 1991. — Vol. 51. — P. 5245—5252.
27. Johnston R.N., Beverley S.H., Schimke R.T. II Proc. nat. Acad. Sei. USA. — 1983. — Vol. 80. — P. 3711—3715.
28. Juliano R.L, Ling V. II Biochim. biophys. Acta. — 1976. — Vol. 455. — P. 152—165.
29. Kohno K., Sato S., Takano H. et al. // Biohem. biophys. Res. Commun. — 1989. — Vol. 165. — P. 1415—1421.
30. Lesuffleur T., Barbat A., Dussaulx E., Zweibaum A. II Cancer Res. — 1990. — Vol. 50. — P. 6334—6343.
31. Licht T., Feiburg Hq.-H., Bross K.J. et al. // Int. J. Cancer. — 1991. — Vol. 49. — P. 1—8.
32. Mickley LA., Bates S., Richert N.D. et al. // J.Biol. Chem. —
1989. — Vol. 264. — P. 18 031 — 18 040.
33. Minor P.D., Roscoe D.H. II J. Cell Sei. — 1975. — Vol. 17. — P. 381—396.
34. Richon V.A., Weich N., Leng L et al. // Proc. nat. Acad. Sei. USA. — 1991. — Vol. 88. — P. 1666—1670.
35. Riordan J.R., Deuchars K., Kartner N. et al. // Nature. — 1985.
— Vol. 316. — P. 817—819.
36. Roninson I.B. II Molecular and cellular biology of multidrug resistance in tumor cells / Ed.I.B. Roninson. — New York — London, 1991. — P. 189—214.
37. Roninson LB., Chin J., Choi K. et al // Proc. nat. Acad. Sei. USA. — 1986. — Vol. 83. — P. 4538—4542.
38. Sager R., Gadi J.K., Stephens L, Grabowy C.T. II Ibid. — 1985. — Vol. 82. — P. 7015—7019.
39. Sakata R., Kwok T., Murphy B.J. et al. // Brit. J. Cancer. —
1991. — Vol. 64. — P. 809—814.
40. Schimke R.T., Hill A., Johnston R.N. II Ibid. — 1985. — Vol. 51. — P. 459—472.
41. Scotto KW., Biedler J.L, Melera P.W. II Science. — 1986. — Vol. 232. — P. 751—755.
42. Sugimoto Y., Tsuruo T. II Molecular and cellular biology of multidrug resistance in tumor cells / Ed.I.B. Roninson. — New York—London, 1991. — P. 57—70.
43. Thorgeisson S.S., Silverman J.A., Gant T.W.,
Marino P.A. // Hepatic metabolism and disposition of endo- and xenobiotics / Eds K.W. Bock, W. Gerok, S. Matern, R. Schmid. Falk Symp. 57. Dordrecht; Boston; London, 1990. — P. 239— 245.
44. Van der Bliek A.M., Kooiman P.M., Schneider C., Borst P. II Gene. — 1988. — Vol. 71. — P. 401—411.
45. Veda K., Gottesman M.M., Pastan I. II Proc. nat. Acad. Sei. USA. — 1987. — Vol. 84. — P. 3004—3008.
Поступила 26.05.92./Submitted 26.05.92.
ОПЕЧАТКИ
В журнале "Вестник ОНЦ" № 3 за 1993 г. допущены опечатки. На рисунке (с. 54) верхняя кривая должна иметь номер 1, а нижняя — номер 2. В тексте на с. 55 второй абзац сверху вместо слов "Из них 14 больных..." следует читать "Из 14 больных...".
MISPRINT
There was a misprint in issue n 3, 1993. In the figure (page 54) the details 1 and 2 should be read 2 and 1.
