CC BY
47
13. Serum proteinase-like peptidase activities and proteinase inhibitors in women with breast disease / A. Vashista, P.R. Baker, P.E. Preece et al. // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1984. Vol. 20. P. 197-202.
14. Stimson W.H. Correlation of the blood level of a pregnancy-associated -macroglobulin with the clinical course of cancer patients / W.H. Stimson // Lancet. 1975. P. 777-779.
15. The activity of a2-macroglobulin in the blood of patients with prostatic carcinoma / Z. Zietek,
I. Iwan-Zietek, M. Kotschy et al. // Pol. Merkuriusz Lek. 1997. Vol. 2. P. 196-198.
16. The value of pregnancy-associated alpha-glycoprote-in in patients with colorectal cancer / C.B. Wood, C.H. Home, CM. Towleret al. // Br. J. Surg. 1978. Vol. 65. P. 653-656.
17. Warwas M. Haptoglobin and proteinase inhibitors in the blood serum of women with inflammatory, benign and neoplastic lesions of the ovary / M. Warwas, J. Gerber, A. Pietkiewicz // Neoplasma. 1986. Vol. 33. P. 79-84.
УДК 616-006
А.Н. Зенков, Н.В. Скворцова, Е.Л. Черноловская, М. А. Зенкова,
Т.И. Поспелова, М.И. Лосева, В.В. Власов
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ МБЮ И МИР У БОЛЬНЫХ ЛИМФОМОЙ С ПЕРВИЧНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ КОСТНОГО МОЗГА
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Новосибирская государственная медицинская академия МЗ РФ
Исследованы уровни экспрессии генов MDR1 и MRPy больных неходжкинскими лимфомами высокой и низкой степени злокачественности с первичным поражением костного мозга до и после химиотерапии. Выявлено, что повышение экспрессии какого-либо из генов у больных гемобластозами происходит в ответ на химиотерапию и сочетается с неблагоприятным клиническим прогнозом и более частым возникновением рецидивов.____________________________
Ключевые слова: множественная лекарственная устойчивость, лимфома, MDRl, MRP, химиотерапия
Использование стандартных схем лечения злокачественных заболеваний крови приводит к достижению стойких ремиссий у высокого процента больных. Тем не менее в ряде случаев ремиссии могут быть короткими, а рецидивы — частыми, потому что опухолевые клетки становятся устойчивыми к воздействию лекарственных препаратов [ 1, 2]. Фенотип множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) характеризуется приобретением клетками опухоли резистентности к широкому спектру различных химических соединений и коррелирует с отрицательными прогностическими критериями, такими, как прогрессирование заболевания и отсутствие эффекта от лечения [3].
В более чем 90% случаев МЛУ бывает обусловлена гиперэкспрессией Р-гликопротеина — белка, кодируемого геном MDR1. Р-гликопроте-ин функционирует как АТФ-зависимый трансмембранный насос, откачивающий из клетки токсические вещества. Вторым наиболее значимым типом МЛУ является устойчивость, ассоциированная с гиперэкспрессией белка MRP, который функционирует аналогично Р-гликоп-ротеину [4].
Лимфомы низкой степени злокачественности (НСЗ) обычно характеризуются медленно прогрессирующим течением и длительной выживаемостью больных. Для лимфом высокой степени злокачественности (ВСЗ), наоборот, характерно
быстрое прогрессирование заболевания, нередко требующее более агрессивного лечения [5, 6]. Роль экспрессии генов MDR1 и MRP в развитии синдрома МЛУ у больных неходжкинской лим-фомой (НХЛ) до сих пор до конца не выяснена. Как было показано ранее, больные, у которых выявляется повышенный уровень Р-гликопротеина, имеют худший прогноз по сравнению с теми, у которых Р-гликопротеин не выявляется [7]. Целью настоящего исследования явилось определение уровней экспрессии генов MDR1 и MRP у больных неходжкинскими лимфомами до и после химиотерапии.
Методика. В исследовании приняли участие 62 чел. с НХЛ. У 29 из них диагностирована НХЛ НСЗ и у 33 — НХЛ ВСЗ. Первичными больными были 24 чел., остальные — после химиотерапии. Пациенты имели уровень лейкоцитов не менее 12х109/л, в связи с чем попадание в препараты неопухолевых лимфоцитов было сведено к минимуму. Периферическая кровь больных собиралась в стерильные пробирки, содержащие 1М цитрат натрия рН 7,0. В течение нескольких часов после забора из крови методом центрифугирования в градиенте плотности фикола выделяли мононуклеарные клетки. Мононуклеарные клетки отделяли от основного препарата и 2-кратно отмывали буфером PBS [8, 9]. Из клеток выделяли суммарную РНК с помощью метода фе-нол-SDS, после чего уровни экспрессии генов
ПО
MDR1 и MRP определяли методом полуколичест-венного ОТ-ПЦР с использованием в качестве внутреннего стандарта гена рибосомального белка L30. В исследовании использовались следующие праймеры:
—для амплификации MDR1 специфического ПЦР-продукта: MDR1 - прямой праймер 5' — ССС АТС ATT GCA ATA GCA GG 3'; MDR1 -обратный праймер 5' - GTT CAA ACT TCT GCT ССТ GA 3' (продукт длиной 157 пар оснований);
—для амплификации MRP специфического ПЦР- продукта: MRP — прямой праймер 5' — GGA AAC CAT CCA CGA ССС ТАА ТСС СТ 3'; MRP - обратный праймер 5' - ССА ССТ ССТ CAT TCG CAT CCA ССТ TG 3' (продукт длиной 296 пар оснований),
—для амплификации RPL специфического ПЦР-продукта: RPL30 — прямой праймер 5' -ATG GTG GCT GCA AAG AAG АС 3'; RPL30 -обратный праймер 5' - GTT ТАС ТТС ТСА ССА GTC TG 3' (продукт длиной 350 пар оснований).
ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 2 е.а. Taq-ДНК-полиме-разы, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфаты, 500 мкМ прямой и обратный праймеры и к-ДНК, полученную с 10—50 нг суммарной клеточной РНК. Амплификацию проводили в следующих условиях: 1 цикл — 95°С — 3 мин, 55°С—1 мин, 72°С—1 мин; следующие циклы проводили в условиях: 94°С - 1 мин, 55°С-1 мин, 72°С-1 мин.
Периферическая кровь 19 доноров, не страдающих заболеваниями крови, была исследована в качестве контрольной группы.
Результаты. Для определения частоты встречаемости повышенных уровней экспрессии генов MDR1 и MRP уровни экспрессии этих генов в контрольной группе были приняты за норму.
Ввиду того что и в контрольной группе у нескольких человек определялась экспрессия генов MDR1 и MRP, за повышенную экспрессию был принят уровень, в 2 раза превышающий средний уровень в контрольной группе.
Повышенный уровень экспрессии генов MDR1 и MRP определялся у 64% и 33% больных НХЛ ВСЗ соответственно. В 33% случаев определялся повышенный уровень экспрессии обоих генов. В группе больных НХЛ НСЗ 63% обследованных имели повышенный уровень экспрессии гена MDR1 и у 41% больных был повышен уровень экспрессии гена MRP. Повышенный уровень экспрессии обоих генов определялся у 34% пациентов с НХЛ НСЗ (рис. 1).
Среднее соотношение экспрессии гена MDR1 по отношению к контрольному гену RPL (MDR1/RPL), отражающее уровень экспрессии гена MDR1, равнялось 0,28 в группе первичных больных с лимфомами ВСЗ и 0,51 — с лимфома-ми ВСЗ после химиотерапии. Среднее отношение MRP/RPL у первичных больных — лимфомами ВСЗ и больных после химиотерапии было, соответственно, 0,015 и 0,2. Средние отношения MDR1/RPL и MRP/RPL у первичных больных с лимфомами НСЗ составили 0,28 и 0,02 соответственно, в то время как у больных после химиотерапии среднее отношение MDR1/RPL было 0,49, а среднее отношение MRP/RPL — 0,11. В контрольной группе средние отношения были 0,09 (MDR1/RPL) и 0,02 (MRP/RPL) (рис. 2.)
Все больные по результатам клинических исследований были разделены на группу с хорошим ответом на лечение, куда вошли 14 больных с НХЛ ВСЗ и 13 больных с НХЛ НСЗ, и группу с отрицательным ответом на лечение, которую составили 19 больных с НХЛ ВСЗ и 16 больных с
Рис. 1. Процент больных с повышенным уровнем экспрессии генов MDR1 и MRP
Рис. 3. Сравнительный анализ среднего значения соотношений МБЯ1/ЯРЬ и МЯР/ЯРЬ в группах больных с хорошим ответом на лечение и больных, у которых терапия оказалась неэффективна
НХЛ НСЗ. В группе с хорошим ответом на лечение у больных с НХЛ ВСЗ средние отношения MDR1/RPL и MRP/RPL составили 0,27 и 0,02 и были гораздо ниже, чем в группе с отрицательным ответом на лечение, — 0,57 и 0,23 соответственно. У больных с НХЛ НСЗ отношения MDR1/RPL и MRP/RPL были 0,28 и 0,07 в группе с хорошим ответом на лечение и 0,61 и 0,14 — в группе с отрицательным ответом, что значительно выше (рис. 3).
Выводы. Исследования показали, что у больных после химиотерапии уровень экспрессии генов MDR1 и MRP как минимум в 2 раза превышает тестируемый уровень экспрессии генов у первичных больных. Г иперэкспрессия указанных генов положительно коррелирует с плохим клиническим прогнозом заболевания и большим числом осложнений в период проведения химиотерапии.
Таким образом, повышенный уровень экспрессии генов MDR1 и MRP у больных с НХЛ является отрицательным прогностическим критерием и одним из оснований для индивидуализации лечения и назначения более агрессивных программ полихимиотерапии.
EXPRESSION OF THE MDR1 AND MRP GENES IN PATIENTS WITH LYMPHOMA WITH PRIMARY BONE MARROW INVOLVEMENT.
A.N. Zenkov, N.V. Skvortsova, E.L. Chernolovskaya, M.A. Zenkova, T.I. Pospelova, M.I. Loseva, V.V. Vlasov
Expression of MDR1 and MRP genes in patients with low-grade and high-grade non-Hodgkin's lymphomas with primary bone marrow involvement before and after chemotherapy was investigated. The data demonstrate that overexpression of MDR1 and MRP genes in hematological malignancies increased in patients after chemotherapy and correlated with poor clinic prognosis and more often recurrences of the malignancies.
The data demonstrated that the post-chemotherapy patients showed significantly increased levels of expression of the MDR1 and MRP genes as compared to patients who never received chemotherapy. Therefore evaluation of the expression of the MDR1 and MRP genes in patients with lymphoma can be used as a prognostic method
for administration more aggressive protocols of chemotherapy to those patients who show increased levels of
MDR1 and/or MRP genes.
ЛИТЕРАТУРА
1. Chevillard S. French multicentric evaluation of mdrl gene expression by RT—PCR in leukemia and solid tumors. Standardization of RT—PCR and preliminary comparisons between RT—PCR and immunohis-tochemistry in solid tumors / S. Chevillard // Leukemia. 1997. Vol. 11. P. 1095-1106.
2. Common expression of the multidrug resistance marker p—glycoprotein in B—cell chronic lymphatic leukemia and correlation with in vitro drug resistance / R.L. Sparrow, F.J. Hall, H. Siregar, M.B. Van der Weyden // Leukemia Research. 1993. Vol. 17. P. 941-947.
3. Dalton W.S. Mechanism of drug resistance in hematological malignancies / W.S. Dalton // Supplement to Seminars in hematology. 1997. Vol. 34. № 4. P. 3-8.
4. MDR1 and MRP expression in chronic B—lymphop-roliferative disorders / M. Webb, M. Brun, M. McNiven et al. // British journal of hematology. 1998. Vol. 102. P. 710-717. ‘
5. Multidrug resistance in acute leukemia: a comparison of different diagnostic methods / G. Pall, M. Spitaler, J. Hofmann et al. // Leukemia. 1997. Vol.
11. P. 1067-1072.
6. Multidrug resistance mechanisms in chronic lymphocytic leukemia / U. Consoli, A. Santonocito, F. Stagno et al. // British Journal of Hematology. 2002. Vol. 116. P. 774-780.
7. P-glycoprotein—actin association through ERM family proteins: a role in P-glycoprotein function in human cells of lymphoid origin / F. Luciani, A. Mo-linari, F. Lozupone et al. // Blood. 2002. Vol. 99. №
2. P. 641-648.
8. Quantitative determination of MDR1 mRNA expression in peripheral blood lymphocytes: a possible role of genetic polymorphisms in the MDR1 gene / K. Oselin, 1. Nowakowski-Gashaw, P.M. Mrozikie-wicz et al. // European Journal of Clinical Investigation, 2003. Vol. 33. P. 261-267.
9. Sonneveld P. Multi-drug resistance in hematological malignancies / P. Sonneveld // Journal of Internal Medicine. 2000. Vol. 247. P. 521-534.
