CC BY
18
Раздел - молекулярная медицина
Исследование эффективности различных вариантов химерных Т-клеточных рецепторов относительно РЭА-позитивных опухолевых клеток
Боженко В. К., Князева А.Д., Киселева Я.Ю., Кулинич Т. М., Шишкин А. М.
ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава Российской Федерации, ул. Профсоюзная, 86, Москва, Российская Федерация, 117997
Контактная информация: Князева Алиса Дмитриевна, e-mail: knyazeva.a.d@yandex.ru
Резюме
Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности по всему миру. Иммунные клетки оказывают влияние на развитие злокачественных опухолей. Разрабатываются методы противоопухолевой терапии, основанные на модификации и активации собственных иммунных клеток так, чтобы они могли избирательно поражать только опухолевые клетки. Раковый эмбриональный антиген (РЭА) является одним из самых распространенных и универсальных маркеров для большинства опухолей.
После модификации лимфоцитов плазмидами PCI-1С6-CAR и PCI-3C1-CAR-new, несущими кодирующие последовательности разных антигенов Т-клеточного рецептора, было проведено исследование цитотоксической активности модифицированных лимфоцитов в отношении РЭА-положительных опухолевых клеток. Было показано, что данные лимфоциты избирательно поражают клетки, экспрессирующие РЭА. Также было проведено сравнение противоопухолевой активности лимфоцитов, трансфицированных разными плазмидами, и показана наибольшая цитотоксическая активность лимфоцитов, трансфицированных плазмидой PCI-3C1-CAR-new в отношении клеток культур А549 и НСТ116.
Ключевые слова: онкология, иммунотерапия, раковый эмбриональный антиген (РЭА), специфическая цитотоксичность, лимфоциты
Investigation of the efficacy of different variants of chimeric T-cell receptors for CEA-positive tumor cells
Bojenko V.K., Knyazeva A.D., Kiseleva Y. Y., Kulinich T.M., Shishkin A.M.
Federal State Budgetary Institution Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, 117997 Moscow, Profsoyuznaya str., 86 Summary
Oncological diseases are one of the leading causes of mortality worldwide. Immune cells affect the development of malignant tumors. Methods of cancer therapy based on modification and activation of own immune cells have been developed, so that they can selectively affect only tumor cells. Cancer embryonic antigen (CEA) is one of the most common and universal markers for most tumors. We modified lymphocytes with PCI-1C6-CAR and PCI-3C1-CAR-new plasmids carrying the coding sequences of various T-cell receptor antigens. Then the cytotoxic activity of the modified lymphocytes against CEA-positive tumor cells was studied. It was shown that these lymphocytes selectively affect cells expressing CEA. A comparative analysis of antitumor activity of lymphocytes transfected with various plasmids was also performed. In cell cultures A549 and HST116, the highest cytotoxic activity of lymphocytes transfected with plasmid PCI-3C1-CAR-new was revealed.
Key words: oncology, immunotherapy, cancer embryonic antigen (CEA), specific cytotoxicity, lymphocytes
Сведения об авторах
Боженко Владимир Константинович - зав. отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, д.м.н., профессор;
Князева Алиса Дмитриевна - младший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ;
Киселева Яна Юрьевна - научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н.;
Кулинич Татьяна Михайловна - заведующая лабораторией иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н.;
Шишкин Александр Михайлович - старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н.
Введение
В настоящее время онкологические заболевания продолжают оставаться одной из основных причин смертности во всем мире. Известно, что иммунные клетки оказывают влияние на процесс роста и образования злокачественных опухолей [12], поэтому собственную иммунную систему можно использовать целенаправленно для лечения злокачественных новообразований. Активно разрабатываются методы противоопухолевой терапии, основанные на модификации и активации собственных иммунных клеток так, чтобы они могли избирательно поражать только опухолевые клетки. Одним из самых распространенных и универсальных для большинства опухолей маркером является раковый эмбриональный антиген (РЭА). Его экспрессируют клетки почти всех опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), 70% опухолей немелкоклеточного рака легких, 50% опухолей молочной железы и ряд других опухолей. На избирательном узнавании и цитотоксическом воздействии на клетки, экспрессирующие РЭА, модифицированными Т-лимфоцитами построен принцип действия адоптивной иммунотерапии. Цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты являются главным эффекторным звеном в адаптивном иммунном ответе на несущие чужеродные антигены клетки организма. Генетическая модификация, приводящая к синтезу химерных Т-клеточных рецепторов, позволяет проводить эффективную терапию
Зрелые Т-лимфоциты имеют на своей поверхности рецептор Т-лимфоцитов TCR (T-cell receptor). Рецептор состоит из двух аминокислотных цепей и принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов. Цепи имеют сходное строение и могут принадлежать к двум классам: а и в или у и 5. На одном Т-лимфоците могут присутствовать только рецепторы одного класса в количестве 30 - 40 тысяч единиц. Более 95% зрелых Т-лимфоцитов имеют рецептор aPTCR. Рецептор состоит из внеклеточного участка, трансмембранной части, содержащей 10-12 аминокислотных остатков и цитоплазматической части из 3-5 аминокислотных остатков. Внеклеточный участок состоит из двух доменов. Прилежащий к мембране домен является константным, а удаленный -вариабельным [5]. Эффекторным звеном TCR-рецептора является димер Z-цепи (CD247), связанный с цитоплазматической частью рецептора [4]. Иногда вместо Z-цепи присутствует П-цепь, являющаяся продуктом альтернативного сплайсинга того же гена. В этом случае цепи составляют гетеродимер. Вместе с TCR-рецептором на поверхности Т-лимфоцитов присутствуют молекулы CD3, образующие с TCR-рецептором TCR-CD3 комплекс. Именно в составе комплекса TCR способен обеспечивать передачу сигнала внутрь клетки [3]. В то же время, в распознавании Т-клеточным рецептором антигена участвуют и другие рецепторы Т-лимфоцитов. Основная роль этих корецепторов заключается в повышении сродства комплекса TCRCD3 к антигену [10]. Корецепторы связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости, в составе которого презентируются распознаваемые Т-клеточным рецептором антигены. Такими корецепторами являются CD4 и CD8. Их участие в связывание антигена повышает сродство связывания на два порядка. Кроме того, они участвуют в передаче внутриклеточного сигнала через лимфоцит-специфическую протеинтирозинкиназу (Lck) [6]. Другим корецептором комплекса TCR-CD3 является CD28 [8].
Отличительной чертой всех антиген-распознающих частей химерных рецепторов является отсутствие зависимости распознавания антигена от наличия молекул главного комплекса гистосовместимости. Это особенно важно, так как многие опухолевые клетки обладают сниженной или отсутствующей экспрессией молекул МНС.
Первоначально химерные антигенные рецепторы отражали в своей структуре нормальные рецепторы Т-лимфоцитов, включающие антиген-распознающую часть, передаточный фрагмент и цитоплазматическую эффекторную часть [2] (Рис. 1).
Первое поколение CAR Второе поколение CAR Третье поколение CAR
Рисунок 1. Структура трех поколений химерных антигенных рецепторов (ТМ, трансмембранный регион; mAb scFv, одноцепочечный вариабельный фрагмент моноклональных антител).
Впоследствии было создано второе и третье поколение CAR, которые помимо CD3Z содержат дополнительные костимуляторные домены (Рис. 1). Наиболее часто в состав CAR второго поколения входит цитоплазматический домен молекулы CD28, располагающийся между трансмембранным доменом и ITAM-содержащей сигнальной последовательностью [2, 5, 9].
Конструкция третьего поколения CAR предполагает наличие трех внутриклеточных сигнальных доменов (Рис. 1). Помимо фрагментов CD3Z и CD28 такие рецепторы могут
содержать сигнальные последовательности CD134/0X-40, CD137/4-1BB, DAP10 и другие.
4
Исследования по сравнению работоспособности рецепторов второго и третьего поколения имеют довольно противоречивые результаты. В ряде работ показано, что Т-клетки, несущие третье поколение CAR, характеризуются большим уровнем продукции цитокинов, лучшей выживаемостью и, в целом, большей противоопухолевой активностью. Так, например, в исследовании Zhong и соавторов, конструкция CD28/4-1BB/CD3Z в составе анти-ПСМА CAR, использованная для модификации лимфоцитов, обеспечила последним высокую способность к выживанию in vivo, больший уровень экспрессии антиапоптотического фактора Bcl-2, больший уровень продукции цитокинов [14]. В то же время, в работе Wilkie и соавторов in vitro цитотоксичность Т-клеток, несущих рецепторы третьего поколения (CD28/4-1BB/CD3Z, CD28/OX-40/CD3Q, специфичные к MUC1 (экспрессируется на клетках опухолей молочной железы и яичников), была сравнима с цитотоксичностью Т-клеток, модифицированных лишь CD28/CD3Z [11]. Другое исследование демонстрирует, что хотя для антиген-индуцированной пролиферации и высокого уровня продукции цитокинов необходимым и достаточным сигнальным доменом является CD28, включение дополнительной костимуляторной молекулы тем не менее увеличивает антиапоптотические и пролиферативные свойства модифицированных клеток
[13].
В любом случае, следует помнить, что различные результаты работ с использованием рецепторов второго и третьего поколений могли быть связаны не только со структурой сигнальных доменов CAR. На исход экспериментов оказывают влияние множество других факторов, таких как строение антиген-связывающей части рецептора, способ трансфекции клеток, опухолевая модель, способ введения модифицированных клеток, условия культивирования и т.д.
Цель работы: (1) сравнить цитотоксическую активность лимфоцитов, трансфецированных следующими плазмидами: плазмида рС1-3с1-CAR-3g new, несущая
кодирующую последовательность химерного Т-клеточного рецептора с антигеном 3с1 и плазмида рС1-1c6-CAR-3g, содержащая кодирующую последовательность химерного Т-клеточного рецептора с антигеном 1с6; (2) оценить эффективность связывания РЭА мономолекулярными химерными Т-клеточными рецепторами, экспрессируемыми на поверхности модифицированных Т-лимфоцитов; (3) исследовать цитотоксические свойства лимфоцитов, экспрессирующих искусственный Т-клеточный рецептор, в отношении РЭА-положительных опухолевых клеток и клеток, не экспрессирующих РЭА. Материалы и методы
Т-лимфоциты получали методом иммуномагнитной сепарации из мононуклеарной фракции лейкоцитов, выделенных из периферической крови пациентов на ступенчатом градиенте фиколла. После предварительной четырехдневной экспансии и активации интерлейкином-2 лимфоциты трансфицировали методом электропорации. Для трансфекции использовались две плазмиды: плазмида рС1-3с1-CAR-3g new, несущая кодирующую последовательность химерного Т-клеточного рецептора с антигеном 3с1, и плазмида рС1-1c6-CAR-3g, содержащая кодирующую последовательность химерного Т-клеточного рецептора с антигеном 1с6. После трансфекции оценивали способность экспрессируемых мономолекулярных химерных Т-клеточных рецепторов связывать РЭА. Для этого лимфоциты подвергали непрямому иммуноокрашиванию, инкубируя последовательно с РЭА, антиРЭА и стрептавидином, после чего результаты оценивали с помощью проточного цитофлуориметра Cytomics FC500 (Beckman Coulter).
В качестве мишеней были использованы клетки культур А549 и НСТ116, а также HEK293, трансфицированные плазмидой РЭА и «чистые».
Для определения специфической цитотоксичности лимфоциты инкубировали в восьмилуночных планшетах с HEK293 и НЕК293-РЭА под мониторингом прибора iCELLigence. Клетки-мишени засевались в количестве 2*104 клеток на лунку, а
трансфицированные лимфоциты с добавлением IL-2 раскапывались в количестве по 1*105 и 2*105 клеток/лунку так, чтобы общий объем среды составил 0,4 мл/лунку. Планшеты ставили в прибор на 2 суток, измерения проводились с частотой 1 мин.
Цитотоксичность модифицированных лимфоцитов в отношении клеток культур А549 и НСТ116 оценивали с помощью МТТ-теста. Клетки засевали в 24-луночный планшет и добавляли к ним лимфоциты в соотношении 5:1 и 10:1. К контрольным образцам добавляли среду для уравнения объемов. Культивировали 2 сут, затем окрашивали и измеряли оптическую плотность экстракта при длине волны 570 нм на спектрофотометре.
Также цитотоксичность лимфоцитов по отношению к клеткам А549 и НСТ116 определяли, используя систему мониторинга и визуализации живых клеток IncuCyte Zoom. Клетки засевали в 24-луночный планшет и добавляли к ним лимфоциты, трансфицированные плазмидами PCI-3C1-CAR-new и PCI-1C6-CAR, в соотношении 5:1 и 10:1, а также активированные лимфоциты. К контрольным образцам добавляли среду для уравнения объемов. В лунки планшета добавляли краситель иодид пропидия, который окрашивает умершие клетки. Планшет помещали в прибор и отслеживали состояние клеток в течение двух суток, после чего интерпретировали результаты. По количеству окрашенных пропидием клеток определяли цитотоксическое воздействие лимфоцитов на клетки.
Статистическая обработка проводилась с помощью программного обеспечения ICELLigence.
Результаты и обсуждение
На основании данных, полученных в предыдущих исследованиях [1], были выбраны два антитела для дальнейшего использования в качестве распознающих доменов для химерных Т-клеточных рецепторов: (CAR): 1С6, 3С1. Антитело 1С6 обладает наибольшей аффинностью из всей серии моноклональных антител. Антитело 3С1 было выбрано, так как оно проявляло сравнительно высокий уровень связывания со всеми клеточными линиями,
экспрессирующими РЭА [15]. Таким образом, в качестве антигенной мишени были выбраны эпитопы РЭА 1-3 (мишень для антител 1С6), 4 (мишень для антител 3С1).
Оценка способности мономолекулярных химерных Т-клеточных рецепторов связывать РЭА проводилась спустя 48 часов после трансфекции лимфоцитов плазмидами рС1-3с1-СЛЕ^ new и рС1-1еб-СЛЯ-3§.
Клетки подвергали непрямому окрашиванию с использованием комплекта Imtek, включающего в себя: биотинилированные РЭА, биотинилированные антитела к РЭА, стрептавидин. Измерения проводились на проточном цитофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter). У клеток, трансфицированных обеими плазмидами обнаруживался положительный сигнал (Рис. 2, 3). Полученные данные свидетельствовали о способности связывания РЭА экспрессируемыми мономолекулярными химерными Т-клеточными рецепторами.
Рисунок 2. Данные цитофлуорометрического анализа лимфоцитов, трансфицированых плазмидой рС1 -3d-CAR-3g new, меченных FITC-антителами на Z цепь.
Рисунок 3. Данные цитофлуорометрического анализа лимфоцитов, трансфицированых плазмидой рС1 -1c6-CAR-3g, меченных БГГС-антителами на £ цепь.
Результаты тестирования модифицированных лимфоцитов на специфическую цитотоксичность представлены на Рис. 4 и Рис. 5. На рис. 4 изображены кривые роста клеток НЕК293, не подвергавшихся модификации. На рис. 5 изображены кривые роста клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой Р1-СЕА. Наименьший клеточный индекс определяется у культур, подвергавшихся цитотоксическому воздействию лимфоцитов, трансфицированных плазмидой PCI-3C1-CAR-new. В контрольных образцах значения клеточного индекса определялось как 2,15±0,35; в образцах с лимфоцитами, трансфицированными PCI-3C1-CAR-new и внесенными в соотношении 10:1, значение клеточного индекса через 67 часов инкубации составляло 1,44±0,28; в образцах с лимфоцитами, трансфицированными плазмидой PCI-1С6-CAR, внесенными в количестве 10:1, значение клеточного индекса составило 1,69±0,33. Значения клеточных индексов у
образцов, к которым трансфицированные лимфоциты были добавлены в количестве 5:1, имели промежуточную величину.
Рисунок 4. Кривые роста НЕК293. 1 - контроль. 2,3 - с добавлением Т-лимфоцитов, трансфицированных плазмидой PCI-3C1-CAR-new в соотношениях 5:1 и 10:1 соответственно. 4,5 - с добавлением Т-лимфоцитов, трансфицированных плазмидой PCI-1С6-CAR в соотношениях 5:1 и 10:1 соответственно.
Рисунок 5. Кривые роста НЕК293, трансфицированных плазмидой PI-CEA. 1 - контроль. 2,3 - с добавлением Т-лимфоцитов, трансфицированных плазмидой PCI-3C1-CAR-new в соотношениях 5:1 и 10:1 соответственно. 4,5 - с добавлением Т-лимфоцитов, трансфицированных плазмидой PCI-1С6-CAR в соотношениях 5:1 и 10:1 соответственно.
Различия между значениями клеточного индекса контрольных клеток и клеток, подвергавшихся цитотоксическому воздействию лимфоцитов достоверны (p<0,05). Клетки А549 и НСТ116 культивировали в 24-х луночных планшетах с добавлением трансфицированных лимфоцитов в течение 2 суток, после чего окрашивали на МТТ. Для детекции результатов использовали мультифункциональный комплекс для исследования внутриклеточных процессов SpectraMax i3/SpectraMax MiniMax (Molecular Devices, США) с программным обеспечением SoftMax Pro.
В контрольных образцах выживаемость клеток составляла 90±6%; в образцах, к которым были добавлены лимфоциты, трансфицированные плазмидой PCI-3C1-CAR-new в количестве 10:1, выживаемость составляла 53±7%; в образцах, культивировавшихся с лимфоцитами, трансфицированными плазмидой PCI-1C6-CAR, выживаемость клеток-мишеней была 40±7%. Различия между клетками, подвергшимися цитотоксическому воздействию лимфоцитов, достоверны по сравнению с контролем (p<0,05) (Рис. 6).
Рисунок 6 . Результаты МТТ-окрашивания клеток А549 и НСТ116. 1 - контроль. 2,3 - с добавлением Т-лимфоцитов, трансфицированных плазмидой PCI-3C1-CAR-new в соотношениях 5:1 и 10:1 соответственно. 4,5 - с добавлением Т-лимфоцитов, трансфицированных плазмидой РС1-1С6-САЯ в соотношениях 5:1 и 10:1 соответственно.
*Достоверно отличается от контроля (p<0,05);
** Достоверно отличается от контроля (p<0,05).
После инкубации клеток А549 и НСТ116 с активированными и
трансфицированными лимфоцитами в присутствии красителя пропидия иодида под
мониторингом IncuCyte Zoom были получены следующие результаты (рис.7): в первые 17
часов наибольшее количество окрашенных пропидием клеток регистрировалось в лунках, в
которые были добавлены лимфоциты, трансфицированные плазмидой PCI-1С6-CAR. В
последующих же измерениях лимфоциты, трансфицированные плазмидой PCI-3C1-CAR-
new показывали более сильный цитотоксический эффект.
Cytotoxicity - All Wells Mean vs Time
• Propidium SOOnM, a549, HCT11650Kceilsfwell
• Propidium SOOnM, a549, HCT11650K, Lym_3c1 250K
• Propidium SOOnM, aS49, HCT116 БОК, Lym_3c1 500K
• Propidium SOOnM, a549, HCT116 SOK, Lym_1 cS 250K
• Propidium SOOnM, aS49, HCT116 50K, Lym_1 cS 500K
• Propidium SOOnM, a549, HCT115 SOK, Lym.ac. 2S0K
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (Hours)
Рисунок 7. Оценка количества погибших клеток после 48 часов инкубации культуры клеток-мишеней.
Таким образом, в эксперименте продемонстрирован высокий процент связываемости РЭА мономолекулярными химерными Т-клеточными рецепторами, экспрессируемыми на поверхности модифицированных Т-лимфоцитов. Исследованы цитотоксические свойства лимфоцитов, экспрессирующих искусственный Т-клеточный рецептор, в отношении РЭА-положительных опухолевых клеток. Показана избирательная цитотоксическая активность трансфицированных лимфоцитов по отношению к клеткам, экспрессирующим РЭА.
Проведено сравнение противоопухолевой активности лимфоцитов, трансфицированных
исследуемыми плазмидами. Показана наибольшая цитотоксическая активность
лимфоцитов, трансфицированных плазмидой 3с1, в отношении клеток культур А549 и
НСТ116.
Список литературы
1. Шишкин А.М. Разработка метода адоптивной иммунотерапии РЭА позитивных опухолей человека: дис. канд. мед. наук: 14.01.12 Москва, 2015. 128 с.
2. Acuto O., Michel F. CD28-mediated co-stimulation: a quantitative support for TCR signaling. Nat Rev Immunol. 2003. V. 3. No. 12. P. 939-951.
3. Barber E.K., Dasgupta J.D., Schlossman S.F., et al. The CD4 and CD8 antigens are coupled to a protein-tyrosine kinase (p56lck) that phosphorylates the CD3 complex. Proc Natl Acad Sci. U S A. V. 86. No. 9. P. 3277-3281.
4. Brownlie R.J., Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. 2013. Nat Rev Immunol. V. 13. No. 4. P. 257-269.
5. Cheng J., Montecalvo A., Kane L.P. Regulation of NF-kB induction by TCR/CD28. Immunol Res. 2011. V. 50. No. 2-3. P. 113-117.
6. Cronin S.J., Penninger J.M. From T-cell activation signals to signaling control of anticancer immunity. Immunol Rev. 2007. V. 220. P. 151-168.
7. Emtage P.C., Lo A.S., Gomes E.M., et al. Second-generation anti-carcinoembryonic antigen designer T cells resist activation-induced cell death, proliferate on tumor contact, secrete cytokines, and exhibit superior antitumor activity in vivo: a preclinical evaluation. Clin Cancer Res. V. 14. No. 24. P.8112-8122.
8. Evans E.J., Esnouf R.M., Manso-Sancho R., et al. Crystal structure of a soluble CD28-Fab complex. 2005. Nat Immunol. V. 6. No. 3. P. 271-279.
9. Kagi D., Ledermann B., Burki K., et al. Molecular mechanisms of lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role in immunological protection and pathogenesis in vivo. Annu Rev Immunol. 1996. V. 14. P. 207-232.
10. Kieke M.C., Shusta E.V., Boder E.T., et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci. U S A. 1999. V. 96. No. 10. P. 5651-5656.
11. Lange F., Rateitschak K., Fitzner B., et al. Studies on mechanisms of interferon-gamma action in pancreatic cancer using a data-driven and model-based approach. Mol Cancer. 2011. V. 10. No. 1. P.13
12. Papac R.J. Spontaneous regression of cancer: possible mechanisms. In Vivo. 1998. V. 12. No. 6. P. 571-578.
13. Rosenberg S.A., Lotze M. T., MuulL.M., et al. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med. 1985. V. 313. No. 23. P.1485-1492.
14. Russell J.H., Ley T.J. Lymphocyte-mediated cytotoxicity. Annu Rev Immunol. 2002. V. 20. P. 323-370.
15. Trapani J.A., Smyth M.J. Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway. Nat Rev Immunol. 2002. V. 2. No. 10. P. 735-747.
