CC BY
183
ОБЗОРЫ
УДК 571.27
Основы дизайна химерных антигенных рецепторов
С. В. Кулемзин1*, В. В. Кузнецова1*, М. Мамонкин3, А. В. Таранин12, А. А. Горчаков1,2* 'Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8/2
2Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2
3Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital and
Houston Methodist Hospital, Houston, TX, USA
#Эти авторы внесли равный вклад в выполнение работы.
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 23.06.2016
Принята к печати 17.11.2016
РЕФЕРАТ Химерные антигенные рецепторы представляют собой рекомбинантные трансмембранные молекулы, которые перенаправляют цитотоксические лимфоциты на клетки опухоли. Возможность сравнительно быстро получать опухоль-специфичные Т-клетки c химерными антигенными рецепторами для адоптивной иммунотерапии опухолей делает актуальным изучение структур, которые обеспечивают максимальную функциональность рецепторов in vivo. В обзоре приведена информация об основных элементах химерных антигенных рецепторов, а именно об антигенраспознающем модуле, шарнирной области, трансмембранном районе и сигнальных последовательностях. Обсуждается возможное влияние тех или иных участков химерных антигенных рецепторов на их активность in vitro и in vivo, рассмотрены также альтернативные варианты дизайна химерных антигенных рецепторов. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА адоптивная иммунотерапия, рак, Т-клетки, химерный антигенный рецептор. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CAR - химерный антигенный рецептор; TCR - Т-клеточный рецептор; мАТ - моно-клональное антитело; scFv - одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела; scFv-CAR - химерный антигенный рецептор с антигенраспознающей областью, основанной на scFv; DARPin - искусственный белок с анкириновыми повторами; FITC - флуоресцеинизотиоцианат; VHH - рекомбинантные однодоменные антитела верблюдовых (наноантитела); VLR - вариабельные лимфоцитарные рецепторы круглоротых; MHC - белки главного комплекса гистосовместимости; ITAM - тирозинсодержащий активационный мотив.
ВВЕДЕНИЕ
Современные методы перенацеливания клеток иммунной системы открывают значительные возможности для терапии онко- и аутоиммунных заболеваний. В последние годы наиболее успешно c этой целью используют так называемые химерные антигенные рецепторы (CAR), представляющие собой искусственные молекулы, которые обеспечивают активацию несущих их клеток при контакте с определенным антигеном. Антигенраспознающая часть CAR представлена, как правило, фрагментом моно-клонального антитела (мАТ), она взаимодействует с опухолевыми детерминантами без участия молекул MHC, а активация обеспечивается сигнальными мотивами во внутриклеточной части CAR. В качестве клеток-носителей CAR обычно используют Т-клетки (далее CAR Т-клетки). В данном обзоре структурные особенности CAR рассмотрены именно в контексте Т-клеток, хотя существуют и альтернативные кле-
точные платформы (NK-клетки, iNKT-клетки, уб T-клетки).
В общем виде схему терапии CAR Т-клетками можно представить следующим образом (рис. 1). В полученные от пациента первичные Т-клетки вводят ДНК-кассету, кодирующую CAR; трансгенные CAR Т-клетки ex vivo размножают и возвращают в организм пациента, где они при помощи антиген-распознающей части CAR взаимодействуют с опухолевыми антигенами, а внутриклеточная часть CAR индуцирует активацию Т-клеток, что приводит к лизису опухолевых клеток и пролиферации CAR Т-клеток. Таким образом, этот подход сочетает селективность антител и цитотоксический потенциал Т-лимфоцитов.
Терапию CAR Т-клетками начали применять относительно недавно, однако уже получены многообещающие результаты. В ряде испытаний удалось добиться ремиссии более чем у половины пациентов
A 1. Выделение
и активация Т-клеток
CAR Т-клетка
2. Трансдукция CAR-ретровирусами
3. Селекция,экспансия, активация CAR Т-клеток
4. Введение пациенту
Раковая клетка
Нормальная клетка
Y
CAR (химерный антигенный рецептор) на поверхности Т-клетки
специфический поверхностный маркер раковой клетки
экспрессия цитокинов, пролиферация и цитотоксическая активность CAR Т-клеток
Рис. 1. Принцип адоптивного переноса CAR Т-клеток и функционирование CAR-платформы. При помощи процедуры лейкафереза Т-клетки периферической крови онкобольного отбирают для культивирования ex vivo. После трансдукции Т-клеток кодирующими CAR ленти- или гаммаретровирусами отбирают CAR-позитивные клетки, размножают и активируют перед возвращением в организм пациента (А). При встрече CAR T-клетки и трансформированной клетки, несущей целевой белок-мишень на поверхности, CAR Т-клетки активируются, что приводит к секреции цитокинов, пролиферативной реакции и уничтожению клетки-мишени (Б)
Б
с опухолями, устойчивыми к другим видам терапии [1]. В то же время обозначились и первые трудности, связанные с недостаточной селективностью CAR [2].
СТРОЕНИЕ ХИМЕРНЫХ АНТИГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Разработанные в середине 1980-х годов CAR представляли собой вариабельные (антигенсвязываю-щие) участки антител, слитые с константной частью Т-клеточного рецептора (TCR) [3]. В 1993 З. Эшхар и соавт. модифицировали эту структуру: в качестве антигенраспознающего домена они использовали со-
единенные линкером вариабельные районы легкой и тяжелой цепей антител (scFv, single chain variable fragment), а трансмембранный домен и сигнальная внутриклеточная последовательность были заимствованы у CD3Z или FcRy, причем весь химерный рецептор состоял из одной полипептидной цепочки [4]. Следующие поколения CAR имели в целом сходную структуру, но несли дополнительные сигнальные домены для повышения Т-клеточной активности. Далее будут рассмотрены основные структурные элементы CAR.
АНТИГЕНРАСПОЗНАЮЩИЙ ДОМЕН CAR
Формат scFv
В подавляющем большинстве случаев в качестве ан-тигенраспознающего модуля CAR используют производные антител в виде scFv [5] (рис. 2). Несомненно, это достаточно удобный формат, поскольку взятые за основу scFv мАТ чаще всего уже хорошо охарактеризованы на доклинических моделях или, более того, разрешены к применению в клинике. Таким образом, при использовании CAR c ранее проверенным scFv риск неожиданной перекрестной реакции CAR Т-клеток со здоровыми тканями гораздо меньше, хоть и не равен нулю. Помимо этого, для многих таких антител получены данные структурного анализа, что позволяет направленно изменять аффинность scFv-CAR в ту или иную сторону. Из недостатков scFv
в качестве антигенраспознающего модуля CAR следует отметить возможность развития иммунной реакции против мышиных и линкерных последовательностей в составе scFv [6] и сложность конструирования полиспецифических scFv-CAR (ввиду большого размера и стабилизации структуры за счет дисульфидных связей) [7]. Кроме того, каркасные последовательности антител в составе scFv могут вызывать лиганднезави-симую кластеризацию CAR, что приводит к так называемой тонической сигнализации, неспецифической активации и, как следствие, к раннему истощению и потере функциональности модифицированных Т-клеток. Протестировав склонность нескольких scFv-CAR (против CD19, GD2, CD22, HER2) к самоассоциации, А. Лонг и соавт. обнаружили, что только CD19-специфичный CAR был полностью лишен этого свойства [8].
Опухолевые мишени, против которых созданы CAR
Опробованы в клинике: BCMA, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD123, CD133, CEA, EGFR, EGFRvIII, EphA2, ErbB-семейство, GPC3, HER2 (ERBB2), FAP, FRa, GD2, Igx, IL13Ra2, Mesothelin, Muc1, PSMA, ROR1, VEGFR2
Находятся на доклинической стадии: B7-H3 (CD276), B7H6 (NCR3LG1), CD5, CD23, CD70, CSPG4, EpCAM, GD3, HLA-A1+MAGE, IL11Ra, Lewis-Y, Muc16, лиганды NKG2D, PSCA, TAG72
Антигенраспознающая часть:
- scFv на основе VL- и VH-частей моноклонального антитела
- scFv против пептидного эпитопа или FITC
- лиганд или рецептор
- аффинный пептид/DARPin/VHH/VLR
Шарнирная часть:
- CD8a
- IgG1/IgG4
- tNGFR
Трансмембранная часть:
- CD8a
- CD28
- CD3Z
Сигнальная часть:
- CD3Z (gl)
- 4-1BB-CD3Z (g2)
- CD28-CD3Z (g2)
- 4-1BB-CD28-CD3Z (g3)
Рис. 2. Организация CAR (в мономерном виде). Рецепторы первого (g1), второго (g2) и третьего (g3) поколений отличаются наличием и числом костимулирующих последовательностей
Естественные лиганд-рецепторные пары
Значительная часть CAR, клинически протестированных к настоящему времени, содержит негумани-зированные scFv мыши, в связи с чем возникает риск развития иммунного ответа, который может блокировать CAR-терапию и вызывать анафилактический шок [9]. Отчасти из-за этого активное развитие получили альтернативные варианты дизайна антигенра-спознающих модулей CAR, в которых используются естественные, заведомо неиммуногенные пары ре-цептор/лиганд. Например, известно, что на поверхности клеток глиобластомы, рака яичника и поджелудочной железы зачастую повышена экспрессия рецептора IL13 - IL13Ra2 [10, 11]. Воспользовавшись этой информацией, из последовательностей, кодирующих IL13, удалось создать химерные рецепторы, специфично узнающие IL13Ra2 (впоследствии было показано, что они узнавали и IL13Ra1) [12-15]. Антигенраспознающие районы CAR, специфичные к лигандам NKG2D и молекуле CD70, сконструированы c использованием внеклеточной части NKG2D и CD27 (рецептора CD70) соответственно [16-18]. CAR, узнающие HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4), удалось получить, позаимствовав внеклеточные последовательности изоформ а и ß белка нейрегулин-1 [19, 20]. Наконец, созданы CAR с последовательностями CD4 [21-23], VEGF [24], NKp30 [25] в качестве антигенраспознающих модулей (мишени gp120 HIV, VEGFR2 и B7H6 соответственно).
Необходимо отметить, что в целом CAR, основанные на лиганд-рецепторных взаимодействиях, страдают от того же недостатка, что и построенные с использованием scFv: мишени таких рецепторов не являются сугубо опухолеспецифичными и присутствуют, хоть и в меньшем количестве, на поверхности нормальных клеток. Кроме того, как показывает опыт, рецептор или лиганд редко имеют только одного партнера - как правило, их несколько, поэтому, чтобы исключить возможность непреднамеренной активации CAR Т-клеток от встречи с такими молекулами, требуется серьезная структурно-функциональная оптимизация.
Пептидные лиганды
В качестве антигенраспознающих доменов химерных рецепторов успешно используются пептидные ли-ганды. Несмотря на потенциальную иммуногенность таких пептидов, риск развития иммунного ответа на них ниже, чем на значительно более крупные scFv. Д.М. Дэвис и соавт. получили CAR, содержащий в качестве внеклеточного домена пептидный лиганд T1E, который распознает клетки-мишени, экспрессиру-ющие на своей поверхности рецепторы семейства ErbB [26]. В работе Памейер и соавт. 12-мерный пеп-
тид BPEP в контексте CAR позволял успешно распознавать и уничтожать клетки-мишени рака яичника с поверхностной экспрессией интегрина avP6 [27]. Схожую схему успешно опробовали и на паре ILllRa/нонапептид IL11 (повышенная экспрессия ILllRa характерна для клеток остеосаркомы, рака желудка и кишечника, молочной и предстательной железы) [28]. Такие «пептидные» CAR пока находятся на стадии «проверки концепции» и доклинических исследований.
Родственным подходом является использование CAR, антигенраспознающая часть которых представлена искусственными анкириновыми повторами (DARPin, designed ankryrin repeat proteins) [29, 30], наноантителами (VHH) [31-34] или VLR (variable lymphocyte receptors) [35]. DARPin - компактные и стабильные белковые модули, отселектированные на высокоаффинное связывание с одной или несколькими мишенями. Так, показано, что HER2-специфичные DARPin-CAR работают (т.е. вызывают активацию и цитотоксическую реакцию) не хуже, чем «классические» scFv-CAR против той же мишени. Описана функциональность VHH и VLR в качестве антигенраспознающих модулей CAR. К важным преимуществам этой системы относится модульность и меньший размер DARPin/VHH/VLR по сравнению с scFv, что, в свою очередь, предполагает возможность создания полиспецифических и/или поливалентных CAR, узнающих несколько мишеней. Тем не менее декларируемая низкая иммуногенность DARPin/VHH/VLR-CAR пока не показана и может представлять определенную проблему при переходе к клиническим испытаниям.
Универсальные антигенраспознающие модули
Известно, что популяция опухолевых клеток, как правило, гетерогенна по поверхностным маркерам-мишеням, в связи с чем CAR Т-клетки могут распознавать их с разной эффективностью: они не будут уничтожать те клетки, экспрессия целевой мишени на которых снизилась или вовсе отсутствует. Таким образом, разумно создавать CAR Т-клетки, специфичность которых относительно легко изменить, используя богатый арсенал имеющихся мАТ. К настоящему времени опубликовано три варианта дизайна так называемых универсальных антигенра-спознающих модулей CAR.
В первом варианте в качестве антигенраспозна-ющей части используется димер авидина курицы [36] - белка, который с высокой аффинностью связывается с биотином и биотинилированными молекулами. Введение мышам таких универсальных CAR Т-клеток и биотинилированных антител против поверхностных антигенов опухолевых клеток-мишеней
приводит к эффективному и специфическому уничтожению этих клеток. Более того, последовательное введение биотинилированных антител против других мишеней приводит к соответствующему изменению (перенаправлению) активности CAR Т-клеток. Интересно отметить, что свободный биотин, неизменно присутствующий в плазме крови, не препятствует этому эффекту и не вызывает неспецифической аутоактивации CAR Т-клеток. Использование CAR с scFv против пептидного неоэпитопа и мишень-специфичных антител, содержащих этот неоэпитоп [37], позволяет добиться того же эффекта универсальности.
Во втором варианте универсальных химерных рецепторов использованы scFv, специфически связывающиеся с FITC. Принцип действия антиFITC-CAR Т-клеток сходен с описанным выше: такие клетки связываются с мАТ или scFv, конъюгированными с FITC, за счет чего начинают узнавать и уничтожать соответствующие этим антителам клетки [38, 39].
Наконец, в третьей системе универсальных CAR использован эффект мимикрии CAR Т-клеток под NK-клетки, способные проявлять антитело-зависимую клеточную цитотоксичность по отношению к перерожденным или зараженным клеткам. Как только с поверхностью клетки-мишени связывается антитело, его Fc-часть узнается CD16a (FcyRIIIA). Известно, что примерно 40% людей являются носителями полиморфизма F158V в CD16a [40], значительно увеличивающего аффинность такого рецептора к антителам [41, 42]. Использование внеклеточной части этого рецептора в качестве анти-генраспознающего модуля позволило создать «универсальный» CAR, способный перенаправлять ци-тотоксическую активность Т-клеток в соответствии с вводимыми противоопухолевыми антителами [4345]. Потенциальной проблемой при применении этого подхода может быть то, что увеличение аффинности CAR к антителам будет неминуемо сопровождаться вытеснением вводимых терапевтических антител свободными антителами плазмы крови. Так это или нет, покажут результаты проводимых в настоящее время клинических испытаний эффективности CD16-CAR Т-клеток в сочетании с ритуксимабом (мАТ против CD20) при CD20-положительных неход-жкинских лимфомах и хроническом лимфолейкозе.
Таким образом, описанное «универсальное» решение имеет два основных преимущества: а) специфичность CAR T-клеток удобно контролировать (менять при необходимости или сразу вводить несколько антител против разных мишеней); б) такие клетки легко «выключить», просто перестав вводить антитела.
С другой стороны, очевидным препятствием для перехода к клиническим испытаниям пер-
вых двух систем является потенциальная иммуно-генность авидина, неоэпитопного пептида и FITC. Возможно, значимость этой проблемы не столь велика, поскольку иммунная система онкологических больных, как правило, находится в крайне угнетенном состоянии. Еще одну проблему представляет ограниченное проникновение антител в разные органы и ткани, что может значительно снижать их эффективную концентрацию в солидных опухолях, т.е. применительно к таким формам рака эти системы, по-видимому, имеют те же недостатки, что и таргет-ные «антительные» подходы.
Шарнирная область CAR
При взаимодействии Т-лимфоцита и антиген-представляющей клетки между ними формируется иммунологический синапс с расстоянием между мембранами около 15 нм [46]. Это расстояние диктуется структурой TCR и комплекса пептид+MHC, оно определяет закрытую структуру синапса и обеспечивает исключение из него молекул, длина внеклеточной части которых превышает 15 нм. Как оказалось, такое пространственное разделение важно для эффективного запуска каскада фосфорилиро-вания и активации Т-клеток [47, 48]. Так, фосфата-за CD45 обладает достаточно крупной внеклеточной частью, и при искусственном укорочении этот белок получает возможность остаться в пределах синапса, что влечет за собой супрессию активационных сигналов [49, 50]. Расстояние между CAR Т-клеткой и опухолевой клеткой может играть важную роль в обеспечении адекватной активации эффектор-ных функций. Поскольку взаимное расположение эпитопа на молекуле-мишени и антигенраспознаю-щей области химерного рецептора в контексте CAR T-клетки задает размер образующегося синапса, становится ясно, почему этот нюанс дизайна может определять, будет ли такой рецептор функциональным или нет [51, 52]. Например, в работе А.А. Хомбах и соавт. было показано, что CAR Т-клетки, распознающие дистальный по отношению к мембране эпитоп ракового эмбрионального антигена (CEA), активировались на среднем уровне, тогда как тот же антиген, перенесенный в более проксимальное положение, активировал CAR Т-клетки с большей силой [53]. Сходным образом CAR Т-клетки с scFv, специфичным к более проксимальному по отношению к мембране эпитопу CD22 (антиген, обильно представленный на нормальных и злокачественных В-клетках), показали высокую противолейкозную активность в отличие от CAR Т-клеток, нацеленных на распознавание дистального эпитопа [54, 55]. Эти и некоторые другие примеры ([56], обзор [57]) свидетельствуют о том, что дистально расположенные эпитопы
в целом приводят к формированию синапса большего размера, чем оптимальные 15 нм, в результате чего становится возможным включение в него фосфатаз CD45 и CD148, что, в свою очередь, приводит к инги-бированию активационного сигнала.
Таким образом, поскольку положение эпитопа, узнаваемого конкретным scFv, на поверхности клетки-мишени всегда фиксировано, для обеспечения его максимальной стерической совместимости с scFv, а также для создания компактного синапса необходим эмпирический подбор внеклеточного спейсера (шарнирного района) между поверхностью Т-клетки и антигенраспознающим модулем.
В качестве спейсера наиболее часто используют последовательности CD8a, CD28 и IgG1/IgG4 (hinge-Fc часть) (в единичных работах - CD4, CD7 и IgD) [58-61], обзор [62]. Такой выбор обусловлен тем, что эти последовательности относительно нейтральны, хорошо структурно охарактеризованы и обладают необходимой гибкостью. Тем не менее выяснилось, что CD8a-шарнир работает не для всех scFv-CAR, Fc-фрагмент IgG биологически далеко не инертен, и нежелательные эффекты спейсера начинают проявляться как только исследования переходят в фазу in vivo. Так, показано, что происходит взаимное узнавание клеток с IgG-содержащими химерными рецепторами и клеток, экспрессирующих Fc-рецепторы (макрофагов, моноцитов и NK-клеток). Соответственно IgG-CAR Т-клетки неспецифически возбуждаются в отсутствие антигена и проявляют цитотоксичность по отношению к FcRy+ клеткам, которые, в свою очередь, активируются и уничтожают CAR Т-клетки, что, разумеется, сказывается на эффективности и безопасности проводимой терапии [63, 64]. Один из способов решения этой проблемы - использование вариантов IgG-шарниров, заведомо неспособных связываться с Fc-рецепторами (с удаленным C^-доменом или мутированными ключевыми аминокислотными остатками) [63-66].
Интересно, что все используемые варианты шарниров CAR - это последовательности, склонные к гомо- или гетеродимеризации, поэтому не очень ясно, насколько возникающие при этом постоянные лиганднезависимые сигналы (tonic/ligand-independent signalling) от таких рецепторов «помогают» или «мешают» CAR Т-клеткам. По умолчанию считается, что димеризация CAR обеспечивает лучшее удержание CAR на поверхности (обзор [67]). Данные, полученные in vitro, указывают на то, что димеризация CAR не влияет существенно на активацию CAR Т-клеток [14, 68, 69], а эксперименты, позволяющие адекватно сравнивать функциональность димеризующихся и недимеризующихся CAR in vivo, пока не проведены. Отметим, что относитель-
но недавно получены функциональные варианты CAR с шарнирным районом из последовательности NGFR/p75 [70] - такие рецепторы не только не узнаются сторонними клетками, но и не способны к ди-меризации. Кроме того, NGFR-спейсер может выполнять функцию удобного для детекции эпитопа, что упрощает не только селекцию и экспансию CAR Т-клеток, но при необходимости может быть использовано для оперативного уничтожения таких CAR Т-клеток в организме реципиента.
Трансмембранный домен
Основная функция трансмембранного домена - позиционировать рецептор на поверхности клетки. Как правило, этот домен конструируют из последовательностей, заимствованных из трансмембранных участков CD3Z, CD28, CD8, FcRIy, реже из CD4, CD7, 0X40 и MHC(H2-Kb), - выбор в значительной мере определяется тем, какие спейсерные или внутриклеточные последовательности располагаются рядом (обзор [71]). Показано, что трансмембранные районы на основе CD3Z и FcRIy обеспечивают эффективное включение CAR в состав эндогенного TCR. Причем именно за счет этого взаимодействия CAR без ITAM-мотивов или вообще без сигнальных последовательностей оказываются вполне функциональными [69, 72-74]. Таким образом, дизайн CAR, обеспечивающий их включение или исключение из TCR, равно как вовлечение дополнительных корецепто-ров, должен приводить не только к количественным, но и к качественным различиям в генерируемых сигналах, что требует дальнейшего изучения.
Сигнальный (внутриклеточный) домен
Функция сигнального домена CAR - передавать ак-тивационный сигнал Т-клетке как только произошло распознавание антигена его внеклеточной частью. В норме активация Т-клеток происходит за счет фосфорилирования ITAM, находящихся в цито-плазматической части цепи CD3Z из комплекса ТCR [75]. Соответственно в большинстве случаев для конструирования CAR в качестве домена, запускающего литическую активность клетки, используют именно сигнальный район CD3Z. Ранее в этом качестве были опробованы ITAM-содержащие домены других сигнальных субъединиц (например, FcRy) [4], но они менее эффективно активировали цитотокси-ческие функции модифицированных Т-лимфоцитов [76, 77]. Индукция активирующего сигнала в натив-ных Т-лимфоцитах происходит в несколько этапов. Сначала активная форма киназы LCK фосфорилиру-ет ITAM-мотивы в цитоплазматической части CD3Z, что активирует киназу ZAP-70, которая запускает сразу несколько активирующих сигнальных каска-
дов. Перечисленные события называют «сигнал 1», но для полноценной активации Т-клетки необходим также «сигнал 2» [78]. Источниками второго сигнала являются костимулирующие рецепторы, например CD28, связывание которого с CD80/CD86 вызывает активацию PI3K и запуск Р13К-зависимого сигнального пути, который, в свою очередь, инициирует mTOR-каскад, определяющий пролиферативную активность клетки.
Таким образом, первое поколение CAR, содержащее только CD3Z-цепь, посылало в клетку исключительно «сигнал 1», что индуцировало цитолиз опухоли [79], но не обеспечивало усиленную пролиферацию активированных CAR Т-клеток. «Сигнал 2» мог бы поступить в клетку от нативных коре-цепторов CAR Т-клетки, однако, многие опухолевые клетки не экспрессируют соответствующих им лигандов. Чтобы преодолеть эту сложность, в 1998 году Х. Финни и соавт. предложили CAR «второго поколения», в котором цитоплазматическая часть содержала сигнальный участок CD28 вместе с CD3Z Такой CAR обеспечивает клетку и «сигналом 1», и «сигналом 2», в результате чего клетка активируется, уничтожает мишень и пролиферирует [58, 80, 81]. Кроме CD28 в состав CAR вводили также сигнальные участки от таких костимулирующих рецепторов, как CD134 (TNFRSF4, 0X40), CD154 (CD40L), CD137 (4-1BB), ICOS (CD278), CD27, CD244 (2B4) и другие [82-88]. Природа костимулирующих последовательностей (принадлежность к IgSF-или TNFRSF-семействам) прямо влияла на характер и динамику функционирования CAR Т-клеток [82, 89]. Дальнейший прогресс в разработке сигнальной части CAR привел к комбинированию двух или более костимулирующих последовательностей (наиболее частая - 4-1BB-CD28-CD3Z). Такие рецепторы, называемые CAR третьего поколения, секретируют более широкий спектр цитокинов (включая TNFa, GM-CSF и IFNy), меньше подвержены индуцируемой активацией клеточной смерти и эффективнее уничтожают опухоли в мышиных моделях [90-92]. Несмотря на эти оптимистичные результаты, пока недостаточно данных, чтобы делать выводы о большей клинической эффективности CAR третьего поколения [93].
Наиболее частым вариантом CAR для клинического применения продолжает оставаться CAR второго поколения с последовательностями CD28-CD3Z или 4-1BB-CD3Z [94-97]. Как показано в клинических испытаниях и на доклинических моделях, использование CD28-CD3Z-сигнализирующих рецепторов разной специфичности ведет к взрывной экспансии CAR T-клеток in vivo, но одновременно ускоряет истощение эффекторов и наступление их
терминальной дифференцировки, что, в свою очередь, приводит к ограниченному персистированию в организме и отсутствию достаточного противоопухолевого эффекта [8, 98]. При этом динамика пролиферации клеток с 4-1BB-CD3Z-содержащими CAR имеет более плавный характер: 4-1ВВ-домен обеспечивает иной характер активации и «ослабляет» эффект раннего истощения клеток-эффекторов. Соответственно 4-1BB-CD3Z CAR T-клетки значительно дольше поддерживаются в организме, обеспечивая тем самым более длительный и надежный противоопухолевый контроль [87, 89, 99], обзор [100]. В то же время недавно обнаружили, что комбинация CD28-опосредованной костимуляции в контексте CD28-CD3Z-CAR и 4-1ВВ-костимуляции (коэкспрес-сия лиганда 4-1BB) сочетает в себе все достоинства обоих путей и функционирует эффективнее, чем любой из «классических» CAR-дизайнов, в том числе и 4-1BB-CD28-CD3Z-содержащий рецептор третьего поколения [101]. Аналогичный подход - использование контролируемой костимуляции для усиления функциональности CAR Т-клеток, лежит в основе GoCAR-T-технологии (Bellicum Pharmaceuticals). За счет коэкспрессии гибридной молекулы iMyD88-CD40 (iMC) и CAR первого поколения вовлекается более широкий набор активационных механизмов, и GoCAR-Т-клетки, как следует из сообщений компании, активнее пролиферируют и уничтожают опухолевые клетки in vitro и in vivo.
По всей видимости, не существует универсального решения при создании CAR-конструкций, поскольку в разных типах новообразований оптимально работают различные комбинации сигнальных и костимулирующих модулей, и такие варианты идентифицируют в основном методом проб и ошибок. В этой связи достаточно оригинальной выглядит работа австралийских исследователей, которые создали комбинаторную библиотеку цитоплазма-тических частей CAR из сочетания 14 сигнальных участков (CD3Z, CD28, 4-1BB, CD27, DAP10 и др.) в различном количестве и случайной последовательности. Все случайные цитоплазматические участки экспрессировали в Т-клетках линии Jurkat в составе CAR с одинаковым распознающим модулем. Затем оценивали, какие последовательности вызывают максимальную активацию клеток. В результате обнаружили необычную комбинацию сигнальных последовательностей DAP10-CD3Z-CD27, которая in vitro работала эффективнее, чем CD28-CD3Z [102]. Концептуально близкий подход предложен группой Л. Альварез-Валлина для идентификации оптимальных/новых антигенраспознающих модулей в составе CAR - это так называемый Т-клеточный дисплей, заключающийся в прямом скрининге scFv-библиотек
на поверхности CAR Т-клеток [103]. В этом случае scFv-библиотеку в формате химерного антигенного рецептора клонируют в лентивирусный вектор и экспрессируют на поверхности Т-клеток при помощи вирусной трансдукции. Полученную таким образом библиотеку scFv-CAR Т-клеток инкубируют с трансформированными клетками, несущими интересующую мишень, и после нескольких раундов активации-селекции и контрселекции отбирают лимфоциты, чей химерный рецептор связался с антигеном. Селекцию связавшихся клеток проводят по маркерам активации (фенотип активированных клеток меняется на CD69+), которые начинают экспрессироваться после связывания химерного рецептора с мишенью. Благодаря этому методу отбор scFv можно вести не столько по их аффинности к мишени, сколько непосредственно по способности индуцировать активацию и пролиферацию scFv-CAR Т-клеток. Таким образом, важным преимуществом CAR Т-клеточного дисплея является то, что отбор CAR происходит сразу в контексте синапса между CAR Т-клеткой и клеткой-мишенью, в результате это может быть выгоднее, чем селекция высокоаффинных фрагментов in vitro с неизбежной последующей оптимизацией и структурной доработкой в контексте CAR Т-клетки. Вместе с тем, необходимо помнить и о важном техническом ограничении Т-клеточного дисплея, а именно, о значительном снижении разнообразия скринируемой библиотеки (не выше 106—107). Подобные работы указывают на то, что основным критерием подбора состава и комбинаций модулей CAR должна быть экспериментальная проверка, причем в условиях, максимально приближенных к ситуации in vivo: функциональность тех или иных структурных модулей CAR, показанная в системе in vitro, далеко не всегда подтверждается в модельных экспериментах с использованием ксено-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gill S., June C.H. // Immunol. Rev. 2015. V. 263. № 1. P. 68-89.
2. Morgan R.A., Yang J.C., Kitano M., Dudley M.E., Laurencot C.M., Rosenberg S.A. // Mol. Ther. 2010. V. 18. № 4. P. 843-851.
3. Kuwana Y., Asakura Y., Utsunomiya N., Nakanishi M., Arata Y., Itoh S., Nagase F., Kurosawa Y. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 149. № 3. P. 960-968.
4. Eshhar Z., Waks T., Gross G., Schindler D.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. № 2. P. 720-724.
5. Bird R.E., Hardman K.D., Jacobson J.W., Johnson S., Kaufman B.M., Lee S.M., Lee T., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. // Science. 1988. V. 242. № 4877. P. 423-426.
6. Kershaw M.H., Westwood J.A., Parker L.L., Wang G., Eshhar Z., Mavroukakis S.A., White D.E., Wunderlich J.R., Canevari S., Rogers-Freezer L., et al. // Clin. Cancer Res. 2006. V. 12. № 20. Pt 1. P. 6106-6115.
7. Worn A., Pluckthun A. // J. Mol. Biol. 2001. V. 305. № 5. P. 989-1010.
трансплантации опухолей и CAR Т-клеток мышам, и уж тем более не гарантирует проявления тех же эффектов в клинике. В связи с этим дизайн и тестирование максимально широкого набора вариантов CAR считаются сегодня единственным способом довести хотя бы один из них до терапевтического применения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Ввиду очевидного трансляционного потенциала CAR Т-клеточной платформы и взрывного роста интереса к этой теме появились разнообразные форматы CAR. Тем не менее, пока получено недостаточно экспериментальных и, в особенности, клинических данных о том, как структура CAR влияет на его свойства in vivo и какие модификации обеспечат максимальную клиническую эффективность CAR Т-клеточной терапии. Крайне успешное применение CAR Т-клеток в области онкогематологии стимулирует попытки адаптации CAR T-клеточной терапии к солидным типам рака, и первые результаты показывают, что, по-видимому, потребуется дальнейшее усложнение технологии. В свою очередь, широкое внедрение этой платформы требует проведения дополнительных систематических исследований и более глубокого понимания всей совокупности механизмов, обеспечивающих формирование и поддержание противоопухолевого иммунитета.
Авторы выражают благодарность А.В. Харкевичу за помощь в подготовке иллюстраций.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 16-14-10237. А.В. Таранин был поддержан программой фундаментальных научных исследований по теме 0310-2015-0006.
8. Long A.H., Haso W.M., Shern J.F., Wanhainen K.M., Murgai M., Ingaramo M., Smith J.P., Walker A.J., Kohler M.E., Venkateshwara V.R., et al. // Nat. Med. 2015. V. 21. № 6. P. 581-590.
9. Maus M.V., Haas A.R., Beatty G.L., Albelda S.M., Levine B.L., Liu X., Zhao Y., Kalos M., June C.H. // Cancer Immunol. Res. 2013. V. 1. № 1. P. 26-31.
10. Mintz A., Gibo D.M., Slagle-Webb B., Christensen N.D., Debinski W. // Neoplasia. 2002. V. 4. № 5. P. 388-399.
11. Kioi M., Kawakami M., Shimamura T., Husain S.R., Puri R.K. // Cancer. 2006. V. 107. № 6. P. 1407-1418.
12. Krenciute G., Krebs S., Torres D., Wu M.F., Liu H., Dotti G., Li X.N., Lesniak M.S., Balyasnikova I.V., Gottschalk S. // Mol. Ther. 2015. V. 24. № 2. P. 354-363.
13. Kahlon K.S., Brown C., Cooper L.J., Raubitschek A., Forman S.J., Jensen M.C. // Cancer Res. 2004. V. 64. № 24. P. 9160-9166.
14. Kong S., Sengupta S., Tyler B., Bais A.J., Ma Q., Doucette S., Zhou J., Sahin A., Carter B.S., Brem H., et al. // Clin. Cancer Res. 2012. V. 18. № 21. P. 5949-5960.
15. Krebs S., Chow K.K., Yi Z., Rodriguez-Cruz T., Hegde M., Gerken C., Ahmed N., Gottschalk S. // Cytotherapy. 2014. V. 16. № 8. P. 1121-1131.
16. Zhang T., Lemoi B.A., Sentman C.L. // Blood. 2005. V. 106. № 5. P. 1544-1551.
17. Shaffer D.R., Savoldo B., Yi Z., Chow K.K., Kakarla S., Spencer D.M., Dotti G., Wu M.F., Liu H., Kenney S., et al. // Blood. 2011. V. 117. № 16. P. 4304-4314.
18. Barber A., Zhang T., Megli C.J., Wu J., Meehan K.R., Sentman C.L. // Exp. Hematol. 2008. V. 36. № 10. P. 1318-1328.
19. Altenschmidt U., Kahl R., Moritz D., Schnierle B.S., Gerstmayer B., Wels W., Groner B. // Clin. Cancer Res. 1996. V. 2. № 6. P. 1001-1008.
20. Muniappan A., Banapour B., Lebkowski J., Talib S. // Cancer Gene Ther. 2000. V. 7. № 1. P. 128-134.
21. Roberts M.R., Qin L., Zhang D., Smith D.H., Tran A.C., Dull T.J., Groopman J.E., Capon D.J., Byrn R.A., Finer M.H. // Blood. 1994. V. 84. № 9. P. 2878-2889.
22. Yang O.O., Tran A.C., Kalams S.A., Johnson R.P., Roberts M.R., Walker B.D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. № 21. P. 11478-11483.
23. Romeo C., Seed B. // Cell. 1991. V. 64. № 5. P. 1037-1046.
24. Niederman T.M., Ghogawala Z., Carter B.S., Tompkins H.S., Russell M.M., Mulligan R.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 10. P. 7009-7014.
25. Zhang T., Wu M.R., Sentman C.L. // J. Immunol. 2012. V. 189. № 5. P. 2290-2299.
26. Davies D.M., Foster J., van der Stegen S.J., Parente-Pereira A.C., Chiapero-Stanke L., Delinassios G.J., Burbridge S.E., Kao V., Liu Z., Bosshard-Carter L., et al. // Mol. Med. 2012.
V. 18. P. 565-576.
27. Pameijer C.R., Navanjo A., Meechoovet B., Wagner J.R., Aguilar B., Wright C.L., Chang W.C., Brown C.E., Jensen M.C. // Cancer Gene Ther. 2007. V. 14. № 1. P. 91-97.
28. Huang G., Yu L., Cooper L.J., Hollomon M., Huls H., Kleinerman E.S. // Cancer Res. 2012. V. 72. № 1. P. 271-281.
29. Binz H.K., Stumpp M.T., Forrer P., Amstutz P., Pluckthun A. // J. Mol. Biol. 2003. V. 332. № 2. P. 489-503.
30. Hammill J.A., VanSeggelen H., Helsen C.W., Denisova G.F., Evelegh C., Tantalo D.G., Bassett J.D., Bramson J.L. // J. Immunother. Cancer. 2015. V. 3. P. 55.
31. Jamnani F.R., Rahbarizadeh F., Shokrgozar M.A., Mahboudi F., Ahmadvand D., Sharifzadeh Z., Parhamifar L., Moghimi S.M. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1840. № 1. P. 378-386.
32. Sharifzadeh Z., Rahbarizadeh F., Shokrgozar M.A., Ahmadvand D., Mahboudi F., Jamnani F.R., Moghimi S.M. // Cancer Lett. 2013. V. 334. № 2. P. 237-244.
33. Zhang G., Liu R., Zhu X., Wang L., Ma J., Han H., Wang X., Zhang G., He W., Wang W., et al. // Immunol. Cell Biol. 2013. V. 91. № 10. P. 615-624.
34. Zhang G., Wang L., Cui H., Wang X., Zhang G., Ma J., Han H., He W., Wang W., Zhao Y., et al. // Sci. Rep. 2014. V. 4. P. 3571.
35. Moot R., Raikar S.S., Fleischer L., Tylawsky D.E., Nahakara H., Doering C.B., Spencer H.T. // Mol. Ther. Oncolytics. 2016. V. 3. P. 16026.
36. Urbanska K., Lanitis E., Poussin M., Lynn R.C., Gavin B.P., Kelderman S., Yu J., Scholler N., Powell D.J., Jr. // Cancer Res. 2012. V. 72. № 7. P. 1844-1852.
37. Rodgers D.T., Mazagova M., Hampton E.N., Cao Y., Ramadoss N.S., Hardy I.R., Schulman A., Du J., Wang F., Singer O., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113. № 4. P. E459-E468.
38. Tamada K., Geng D., Sakoda Y., Bansal N., Srivastava R., Li Z., Davila E. // Clin. Cancer Res. 2012. V. 18. № 23. P. 6436-6445.
39. Ma J.S., Kim J.Y., Kazane S.A., Choi S.H., Yun H.Y., Kim M.S., Rodgers D.T., Pugh H.M., Singer O., Sun S.B., et al. // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113. № 4. P. E450-E458.
40. Wu J., Edberg J.C., Redecha P.B., Bansal V., Guyre P.M., Coleman K., Salmon J.E., Kimberly R.P. // J. Clin. Invest. 1997. V. 100. № 5. P. 1059-1070.
41. Koene H.R., Kleijer M., Algra J., Roos D., von dem Borne A.E., de Haas M. // Blood. 1997. V. 90. № 3. P. 1109-1114.
42. Musolino A., Naldi N., Bortesi B., Pezzuolo D., Capelletti M., Missale G., Laccabue D., Zerbini A., Camisa R., Bisagni G., et al. // J. Clin. Oncol. 2008. V. 26. № 11. P. 1789-1796.
43. Clemenceau B., Congy-Jolivet N., Gallot G., Vivien R., Gaschet J., Thibault G., Vie H. // Blood. 2006. V. 107. № 12. P. 4669-4677.
44. Kudo K., Imai C., Lorenzini P., Kamiya T., Kono K., Davidoff A.M., Chng W.J., Campana D. // Cancer Res. 2014. V. 74. № 1. P. 93-103.
45. D'Aloia M.M., Caratelli S., Palumbo C., Battella S., Arriga R., Lauro D., Palmieri G., Sconocchia G., Alimandi M. // Cytotherapy. 2016. V. 18. № 2. P. 278-290.
46. Dustin M.L., Shaw A.S. // Science. 1999. V. 283. № 5402. P. 649-650.
47. Grakoui A., Bromley S.K., Sumen C., Davis M.M., Shaw A.S., Allen P.M., Dustin M.L. // Science. 1999. V. 285. № 5425. P. 221-227.
48. Grakoui A., Bromley S.K., Sumen C., Davis M.M., Shaw
A.S., Allen P.M., Dustin M.L. // J. Immunol. 2015. V. 194. № 9. P. 4066-4072.
49. Irles C., Symons A., Michel F., Bakker T.R., van der Merwe P.A., Acuto O. // Nat. Immunol. 2003. V. 4. № 2. P. 189-197.
50. Cordoba S.P., Choudhuri K., Zhang H., Bridge M., Basat A.B., Dustin M.L., van der Merwe P.A. // Blood. 2013. V. 121. № 21. P. 4295-4302.
51. Moritz D., Groner B. // Gene Ther. 1995. V. 2. № 8. P. 539-546.
52. Dotti G., Gottschalk S., Savoldo B., Brenner M.K. // Immunol. Rev. 2014. V. 257. № 1. P. 107-126.
53. Hombach A.A., Schildgen V., Heuser C., Finnern R., Gilham D.E., Abken H. // J. Immunol. 2007. V. 178. № 7. P. 4650-4657.
54. James S.E., Greenberg P.D., Jensen M.C., Lin Y., Wang J., Till
B.G., Raubitschek A.A., Forman S.J., Press O.W. // J. Immunol.
2008. V. 180. № 10. P. 7028-7038.
55. Haso W., Lee D.W., Shah N.N., Stetler-Stevenson M., Yuan
C.M., Pastan I.H., Dimitrov D.S., Morgan R.A., FitzGerald D.J., Barrett D.M., et al. // Blood. 2013. V. 121. № 7. P. 1165-1174.
56. Guest R.D., Hawkins R.E., Kirillova N., Cheadle E.J., Arnold J., O'Neill A., Irlam J., Chester K.A., Kemshead J.T., Shaw
D.M., et al. // J. Immunother. 2005. V. 28. № 3. P. 203-211.
57. Long A.H., Haso W.M., Orentas R.J. // Oncoimmunology. 2013. V. 2. № 4. P. e23621.
58. Finney H.M., Lawson A.D., Bebbington C.R., Weir A.N. // J. Immunol. 1998. V. 161. № 6. P. 2791-2797.
59. Moritz D., Wels W., Mattern J., Groner B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 10. P. 4318-4322.
60. Wilkie S., Picco G., Foster J., Davies D.M., Julien S., Cooper L., Arif S., Mather S.J., Taylor-Papadimitriou J., Burchell J.M., et al. // J. Immunol. 2008. V. 180. № 7. P. 4901-4909.
61. Patel S.D., Moskalenko M., Smith D., Maske B., Finer M.H., McArthur J.G. // Gene Ther. 1999. V. 6. № 3. P. 412-419.
62. Sadelain M., Brentjens R., Riviere I. // Curr. Opin. Immunol.
2009. V. 21. № 2. P. 215-223.
63. Almasbak H., Walseng E., Kristian A., Myhre M.R., Suso
E.M., Munthe L.A., Andersen J.T., Wang M.Y., Kvalheim G., Gaudernack G., et al. // Gene Ther. 2015. V. 22. № 5. P. 391-403.
64. Hudecek M., Sommermeyer D., Kosasih P.L., Silva-Benedict A., Liu L., Rader C., Jensen M.C., Riddell S.R. // Cancer Immunol. Res. 2015. V. 3. № 2. P. 125-135.
65. Jonnalagadda M., Mardiros A., Urak R., Wang X., Hoffman
L.J., Bernanke A., Chang W.C., Bretzlaff W., Starr R., Priceman S., et al. // Mol. Ther. 2015. V. 23. № 4. P. 757-768.
66. Hombach A., Hombach A.A., Abken H. // Gene Ther. 2010. V. 17. № 10. P. 1206-1213.
67. Riddell S.R., Protzer U. // Gene Ther. 2010. V. 17. № 10. P. 1191-1192.
68. Fitzer-Attas C.J., Schindler D.G., Waks T., Eshhar Z. // J. Immunol. 1998. V. 160. № 1. P. 145-154.
69. Bridgeman J.S., Hawkins R.E., Bagley S., Blaylock M., Holland M., Gilham D.E. // J. Immunol. 2010. V. 184. № 12. P. 6938-6949.
70. Zhao Y., Wang Q.J., Yang S., Kochenderfer J.N., Zheng Z., Zhong X., Sadelain M., Eshhar Z., Rosenberg S.A., Morgan R.A. // J. Immunol. 2009. V. 183. № 9. P. 5563-5574.
71. Shi H., Sun M., Liu L., Wang Z. // Mol. Cancer. 2014. V. 13. P. 219.
72. Gosse J.A., Wagenknecht-Wiesner A., Holowka D., Baird B. // J. Immunol. 2005. V. 175. № 4. P. 2123-2131.
73. Annenkov A.E., Moyes S.P., Eshhar Z., Mageed R.A., Chernajovsky Y. // J. Immunol. 1998. V. 161. № 12. P. 66046613.
74. Bridgeman J.S., Ladell K., Sheard V.E., Miners K., Hawkins R.E., Price D.A., Gilham D.E. // Clin. Exp. Immunol. 2014.
V. 175. № 2. P. 258-267.
75. Irving B.A., Weiss A. // Cell. 1991. V. 64. № 5. P. 891-901.
76. Haynes N.M., Snook M.B., Trapani J.A., Cerruti L., Jane S.M., Smyth M.J., Darcy P.K. // J. Immunol. 2001. V. 166. № 1. P. 182-187.
77. Roberts M.R., Cooke K.S., Tran A.C., Smith K.A., Lin W.Y., Wang M., Dull T.J., Farson D., Zsebo K.M., Finer M.H. // J. Immunol. 1998. V. 161. № 1. P. 375-384.
78. Lenschow D.J., Walunas T.L., Bluestone J.A. // Annu. Rev. Immunol. 1996. V. 14. №. P. 233-258.
79. Gong M.C., Latouche J.B., Krause A., Heston W.D., Bander N.H., Sadelain M. // Neoplasia. 1999. V. 1. № 2. P. 123-127.
80. Hombach A., Wieczarkowiecz A., Marquardt T., Heuser C., Usai L., Pohl C., Seliger B., Abken H. // J. Immunol. 2001. V. 167. № 11. P. 6123-6131.
81. Maher J., Brentjens R.J., Gunset G., Riviere I., Sadelain M. // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. № 1. P. 70-75.
82. Brentjens R.J., Santos E., Nikhamin Y., Yeh R., Matsushita M., La Perle K., Quintas-Cardama A., Larson S.M., Sadelain M. // Clin. Cancer Res. 2007. V. 13. № 18. Pt 1. P. 5426-5435.
83. Altvater B., Landmeier S., Pscherer S., Temme J., Juergens H., Pule M., Rossig C. // Cancer Immunol. Immunother. 2009. V. 58. № 12. P. 1991-2001.
84. Wang J., Jensen M., Lin Y., Sui X., Chen E., Lindgren C.G., Till B., Raubitschek A., Forman S.J., Qian X., et al. // Hum. Gene Ther. 2007. V. 18. № 8. P. 712-725.
85. Pule M.A., Straathof K.C., Dotti G., Heslop H.E., Rooney C.M., Brenner M.K. // Mol. Ther. 2005. V. 12. № 5. P. 933-941.
86. Song D.G., Ye Q., Poussin M., Harms G.M., Figini M., Powell
D.J., Jr. // Blood. 2012. V. 119. № 3. P. 696-706.
87. Imai C., Mihara K., Andreansky M., Nicholson I.C., Pui
C.H., Geiger T.L., Campana D. // Leukemia. 2004. V. 18. № 4. P. 676-684.
88. Finney H.M., Akbar A.N., Lawson A.D. // J. Immunol. 2004. V. 172. № 1. P. 104-113.
89. Milone M.C., Fish J.D., Carpenito C., Carroll R.G., Binder G.K., Teachey D., Samanta M., Lakhal M., Gloss B., Danet-Desnoyers G., et al. // Mol. Ther. 2009. V. 17. № 8. P. 1453-1464.
90. Zhong X.S., Matsushita M., Plotkin J., Riviere I., Sadelain M. // Mol. Ther. 2010. V. 18. № 2. P. 413-420.
91. Carpenito C., Milone M.C., Hassan R., Simonet J.C., Lakhal M., Suhoski M.M., Varela-Rohena A., Haines K.M., Heitjan
D.F., Albelda S.M., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 9. P. 3360-3365.
92. Karlsson H., Svensson E., Gigg C., Jarvius M., Olsson-Stromberg U., Savoldo B., Dotti G., Loskog A. // PLoS One. 2015. V. 10. № 12. P. e0144787.
93. Till B.G., Jensen M.C., Wang J., Qian X., Gopal A.K., Maloney D.G., Lindgren C.G., Lin Y., Pagel J.M., Budde L.E., et al. // Blood. 2012. V. 119. № 17. P. 3940-3950.
94. Savoldo B., Ramos C.A., Liu E., Mims M.P., Keating M.J., Carrum G., Kamble R.T., Bollard C.M., Gee A.P., Mei Z., et al. // J. Clin. Invest. 2011. V. 121. № 5. P. 1822-1826.
95. Brentjens R.J., Davila M.L., Riviere I., Park J., Wang X., Cowell L.G., Bartido S., Stefanski J., Taylor C., Olszewska M., et al. // Sci. Transl. Med. 2013. V. 5. № 177. P. 177ra138.
96. Grupp S.A., Kalos M., Barrett D., Aplenc R., Porter D.L., Rheingold S.R., Teachey D.T., Chew A., Hauck B., Wright J.F., et al. // N. Engl. J. Med. 2013. V. 368. № 16. P. 1509-1518.
97. Kochenderfer J.N., Dudley M.E., Feldman S.A., Wilson W.H., Spaner D.E., Maric I., Stetler-Stevenson M., Phan G.Q., Hughes M.S., Sherry R.M., et al. // Blood. 2012. V. 119. № 12. P. 2709-2720.
98. Lee D.W., Kochenderfer J.N., Stetler-Stevenson M., Cui Y.K., Delbrook C., Feldman S.A., Fry T.J., Orentas R., Sabatino M., Shah N.N., et al. // Lancet. 2015. V. 385. № 9967. P. 517-528.
99. Maude S.L., Frey N., Shaw P.A., Aplenc R., Barrett D.M., Bunin N.J., Chew A., Gonzalez V.E., Zheng Z., Lacey S.F., et al. // N. Engl. J. Med. 2014. V. 371. № 16. P. 1507-1517.
100. van der Stegen S.J., Hamieh M., Sadelain M. // Nat. Rev. Drug Discov. 2015. V. 14. № 7. P. 499-509.
101. Zhao Z., Condomines M., van der Stegen S.J., Perna F., Kloss C.C., Gunset G., Plotkin J., Sadelain M. // Cancer Cell. 2015. V. 28. № 4. P. 415-428.
102. Duong C.P., Westwood J.A., Yong C.S., Murphy A., Devaud C., John L.B., Darcy P.K., Kershaw M.H. // PLoS One. 2013. V. 8. № 5. P. e63037.
103. Alonso-Camino V., Sanchez-Martin D., Compte M., Nunez-Prado N., Diaz R.M., Vile R., Alvarez-Vallina L. // Mol. Ther. Nucl. Acids. 2013. V. 2. P. e93.
