Текущий раздел: молекулярная Медицина исследование антигенсвязывающей способности моноклональных антител и мономолекулярных scFv последовательностей из них в составе искусственных Т-клеточных рецепторов

Боженко Владимир Константинович; Шкопоров Андрей Николаевич; Шишкин Александр Михайлович; Иванов Андрей Валерьевич; Шрамова Елена Ивановна

Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N12.

Текущий раздел: Молекулярная медицина Исследование антигенсвязывающей способности моноклональных антител и мономолекулярных scFv последовательностей из них в составе искусственных Т-клеточных рецепторов.

Боженко В.К.1, Шкопоров А.Н.2, Шишкин А.М.1, Иванов А.В.1, Шрамова Е.И.1

Х'ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России

2 ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития

Адрес документа для ссылки: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/vl2/papers/bojenko_vl2.htm

Статья опубликована 29 июня 2012 года.

Контактная информация

Рабочий адрес: 117997, Москва, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86, ФГБУ «РНЦРР» Боженко Владимир Константинович - д.м.н., проф., руководитель клиникодиагностической лаборатории ФГБУ РНЦРР, +7(903)799-6484, vbojenko@mail.ru

Шишкин Александр Михайлович - старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ РНЦРР, ashishkin@mail.ru

Иванов Андрей Валерьевич - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ РНЦРР, aivanov_456@mail.ru

Шрамова Елена Ивановна - к.м.н., научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ РНЦРР eshramova@mail.ru

Рабочий адрес: 117997, Москва ул. Островитянова 1, ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Шкопоров Андрей Николаевич - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории микробиологии и биобезопасности ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, ashkoporov@mail.ru

Контактное лицо:Боженко Владимир Константинович, +7(903)799-6484, vbojenko@mail.ru

Резюме

В работе проанализированы антигенсвязывающие способности панели моноклональных антител к РЭА (раково-эмбриональному антигену) и мономолекулярных конструкций на их основе с

поверхностью опухолевых клеток, экспрессирующих РЭА. Показано, что только 2 из 14 моноклональных антител к РЭА способны связываться с антигеном на поверхности клетки. Ключевые слова: РЭА, моноклональные антитела, антигенсвязывающая способность.

Investigation of antigen-binding ability of monoclonal antibodies and monomolecular scFv sequences are composed of synthetic T-cell receptor

Bozhenko V.K.1, Shkoporov A.N.2, Shishkin A.M.1, Ivanov A.V.1, Shramova E. I.1

1 Federal State Enterprise “Russian Scientific Center of Roentgen radiology” of Russian Health and Social Development Ministry, Moscow

2 The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov (RNRMU), Moscow

Summary

CEA monoclonal antibodies antigen bound properties (and monomolecular construction based on it) to membrane cells of cancer line were investigated. There were shown only 2 from 14 antibodies to bind to surface of cancer cells.

Key words: CEA monoclonal antibody, antigen-binding capacity

Оглавление:

Введение Материалы и методы Результаты и обсуждение Список литературы Введение

В настоящее время известно, что иммунная система играет важную роль не только в процессе образования злокачественной опухоли, но и во влиянии на уже сформировавшуюся опухоль [7]. Многие современные иммунологические исследования демонстрируют высокий потенциал Т-клеточной адаптивной терапии рака, которая представляет собой переливание аутологичных или аллогенных Т-клеток пациентам [11]. Тем не менее, в настоящее время остаются открытыми вопросы, касающиеся адаптивного переноса Т-клеток, такие как, выбор вида Т-клеток для терапии, выбор целевого опухолевого антигена, повышение эффективности невирусной генетической

модификации, из-за чего применение терапии ограничено [6]. Адаптивная Т-клеточная иммунотрапия может включать как варианты переливания пациентам интерлейкин-2 активированных лимфоцитов (так называемые LAK- клетки), так и более сложные варианты - когда лимфоциты модифицируются генетически для повышения их таргетности и противоопухолевой эффективности [4, 9]. Один из вариантов такой модификации - трансформация лимфоцитов искусственным геном мономолекулярного Т-клеточного рецептора [8]. При этом в качестве распознающей части Т-клеточного рецептора обычно объединяют антиген-связывающий участок из моноклонального антитела против опухоль-специфического антигена (иммуноглобулин, Ig) с Z сигнальной цепью Т-клеточного рецептора (TCR). После того, как реципиентные Т-клетки генетически модифицируют, они приобретают способность связываться с целевыми антигенами, экспрессирующимися на поверхности опухоли, за счет распознавания их иммуноглобулиновой частью химерного рецептора [10]. Одним из преимуществ такого подхода является теоретическая возможность терапии любого типа опухоли с известными специфическими поверхностными антигенами. Одной из главных задач при разработке такого варианта адоптивной иммунотерапии является клонирование антиген-связывающей части Т-клеточного рецептора. Трудность решения этой задачи заключается в том, что антиген-связывающая часть IgG антител состоит из двух независимых вариабельных цепей, в то время как в молекуле искусственного рецептора эти молекулы должны быть соединены в одну непрерывную мономолекулярную цепь. Вторым важным моментом для выбора антител для конструирования искусственного Т-клеточного рецептора является необходимость подбора антител, взаимодействующих с эпитопом нативного антигена на поверхности клетки. При получении моноклональных антител используют для иммунизации растворимые и, как правило, полученные генно-инженерно (т.е. не в клетках человека) синтетические пептиды или фрагменты молекулы антигена. Это может приводить к тому, что мноклональные антитела, связываясь с растворимым антигеном, могут не узнавать нативный эпитоп, или эпитоп может быть недоступным для них при взаимодействии с поверхностью клетки.

В нашем исследовании мы провели скрининг панели антител к опухоль специфическому антигену РЭА (раково-эмбриональный антиген или CEA, cancinoembryonic antigen) на поверхности опухолевых клеток перевиваемых линий и получили искусственный мономолекулярный Т-клеточный рецептор, связывающийся с растворимым антигеном.

Перейти в оглавление статьи >>>

Материалы и методы Антитела

Панель моноклональных антител к РЭА антигену и соответствующих гибридом, раствор РЭА антигена, меченного ФИТЦ, были любезно предоставлены ЗАО «ХЕМА», Россия. Все антитела были IgG1 изотипа.

В Таблице 1 Приводится краткая характеристика исследованных антител. В последней колонке таблицы показан эпитоп антигена РЭА (согласно классификации Gold P., Freedman S.O., 1965 [3]), с которым связывается данное антитело [5]. Следует отметить, что наиболее близкий к поверхности клеточной мембраны эпитоп - 1 и далее с увеличением номера эпитопа увеличивается его удаление от поверхности клетки.

Таблица 1.Характеристика моноклональных антител

2C5 IgG1 mouse Не известно

1C3 IgG1 mouse 4

1С6 IgG1 mouse 1

1С10 IgG1 mouse 2+

1С11 IgG1 mouse 4

1С13 IgG1 mouse 2

3C1 IgG1 mouse 4? 4''

3C2 IgG1 mouse 1

3C4 IgG1 mouse 4

3C5 IgG1 mouse 1

3C6 IgG1 mouse 1

3C8 IgG1 mouse 5

3C13 IgG1 mouse 4''

Культуры клеток

Исследовали клеточные линии опухолей человека, экспрессирующие РЭА антиген: НСТ116 (карцинома толстой кишки), НТ29 (аденокарцинома толстой кишки), А549 (карцинома легкого). Клетки культивировали в среде БМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и антибиотики в стандартной концентрации при 37о С и 5% С02. Мононуклеары периферической крови добровольцев выделяли из гепаринизированной периферической крови центрифугированием в градиенте фиколла.

Лимфоциты культивировали в среде RPMI, содержащей 10% ЭТС и антибиотики в стандартной концентрации, при 37о С и 5% С02. Лимфоциты стимулировали к пролиферации добавлением 1 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) и активировали 50 Ед/мл ИЛ-2 (БИОТЕХ) в течение 72-120 ч.

Получение генетических конструкций

Фрагменты кДНК легких и тяжелых цепей, кодирующие вариабельные домены VL и VH иммуноглобулинов IgG1, были амплифицированы из препаратов РНК гибридом 1С6 и 3C1 с использованием набора вырожденных праймеров и методов, описанных ранее [2]. Полученные ПЦР-продукты клонировали в плазмидный вектор pAL-TA (Евроген) при помощи стандартных методов и секвенировали. Таким образом, были получены плазмиды pCEA-1 с распознающей частью из антитела 1С6 и pCEA-2 - из антитела 3С1. Подробно метод получения химерного гена мономолекулярного рецептора изложен в статье (Боженко В.К. и др. 2012) [1].

Трансфекцию лимфоцитов периферической крови человека проводили методом электропорации на приборе Amaxa Nucleofector с использованием набора Human T Cell Nucleofector Kit (Lonza) согласно инструкциям производителя. Для трансфекции одного образца использовали 4-5 млн клеток и 2 мкг плазмидной ДНК. Непосредственно после импульса клетки культивировали в полной среде RPMI в стандартных условиях в течение 4-5 ч, после чего к клеткам добавляли ИЛ-2 до концентрации 100 Ед/мл. Через 24 ч после электропорации культуральную среду, содержащую ИЛ-2, заменяли новой без добавления ИЛ-2. Клетки культивировали еще сутки, после чего подвергали анализу. Экспрессию конструкций, кодирующих химерные Т-клеточные рецепторы, подтверждали методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) через 48 ч после трансфекции.

Цитофлуорометрические исследования проводили на проточном цитофлуориметре DAK0 Galaxy (Dako). В работе использовали поликлональные антитела к РЭА AS229 (Beckman Coulter), а также панель биотинилированных моноклональных антител к различным эпитопам РЭА (ЗАО «ХЕМА», Россия).

Анализ связывания антител к РЭА с поверхностью клеток

Оценку способности монолональных антител связываться с РЭА на поверхности опухолевых клеток проводили методом непрямого иммуноцитохимического окрашивания. Для этого, после добавления 20 мкл исходных антител (0,5 мг/мл, разведенных в 100 раз) проводили инкубацию их с клетками 30 мин и дважды отмывали

PBS. Для выявления связавшихся антител к клеткам добавляли стрептавидин, меченный РЕ (Beckman Coulter, США) и инкубировали 20 мин., после чего дважды отмывали PBS, ресуспендировали в той же среде в объеме 1 мл и анализировали на проточном цитофлуориметре. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, к которым был добавлен только стрептавидин.

Анализ связывания антигена РЭА рецепторами, экспрессируемыми

лимфоцитами

Оценку способности экспрессируемых химерных Т-клеточных рецепторов на поверхности лимфоцитов связывать РЭА проводили методом прямого иммуноцитохимического окрашивания. Клетки через 48 часов после трансфекции центрифугировали при 1500 об./мин в течение 5 мин, промывали в 1 мл раствора PBS (ПанЭко, Россия), осадок пипетировали в 100 мкл раствора PBS. ФИТЦ меченный антиген РЭА (ХЕМА, Россия) добавляли в количествах, рекомендованных производителем (3 мкл/106 клеток), инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. После инкубации препарат дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин, промывали в 1 мл раствора PBS, осадок пипетировали в 100 мкл раствора PBS и анализировали на проточном цитофлуориметре. В качестве отрицательного контроля исследовали лимфоциты, к которым в процессе трансфекции не добавляли плазмиду.

Перейти в оглавление статьи >>>

Результаты и обсуждение

Для анализа связывания моноклональных антител на поверхности клеток нами были выбраны три клеточные линии экспрессирующие РЭА: HT29 (линия клеток аденокарциномы толстой кишки человека), A549 (линия клеток карциномы легкого человека), HCT116 (линия клеток рака толстой кишки). Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты проверки связывания клеточных линий с моноклональными антителами. В таблице использованы следующие обозначения:

(-) - связывание отсутствует; (+-) - низкий уровень связывания; (+) - средний уровень связывания; (++) - высокий уровень связывания.

В качестве контроля использовали поликлональные антитела к РЭА AS229 (Beckman Coulter, США), которые связываются со всеми клеточными линиям, экспрессирующими

РЭА.

Моноклональные АТ

Тип клеток 2C 5 1C1 0 1C1 1 1C1 3 1C 3 1C 6 3C 1 3C1 3 3C 2 C 34 3C 5 3C 6 3C 8 3C1 3

HT29 - - - - +- - ++ - - - - - ++ -

A549 - - - - - - + - - - - - + -

HCT11 6 - - - - - - + - - + + - + -

На основании данных, приведенных в таблице 1, можно сделать заключение, что с антигеном на поверхности клетки связываются только моноклональные антитела, имеющие сродство к наиболее удаленным эпитопам от поверхности клетки - эпитопам 4 или 5. Кроме того, не все анитела, связывающиеся с этими эпитопами в растворе, связываются с ними на поверхности клетки. Из 6 проанализированных антител только 2 (3С1 и 3С8) обнаружили такие свойства. Таким образом, только 2 антитела из 14 проанализированных имели необходимые свойства для использования их в работе по конструированию искусственного Т-клеточного рецептора, распознающего РЭА антиген на поверхности опухолевых клеток.

Для отобранных антител нами был проведен сиквенс вариабельных фрагментов, однако для антитела 3С8 результат сиквенса оказался неоднозначен: при сиквенсе тяжелой цепи проявилась экспрессия псевдогена, в связи с этим, для дальнейшей работы нами было выбрано антитело 3С1. Кроме того, по рекомендации производителя (ЗАО, ХЕМА, Россия), мы включили в работу также антитело (и соответствующую гибридому) 1 С6. Несмотря на то, что по данным наших исследований, антитело 1 С6 не связывается с поверхностью клеток, несущих РЭА антиген, основанием для их дальнейшего исследования были такие характеристики как высокая афинность и стабильность.

Далее нами было созданы две плазмидные конструкции. Первая конструкция рСЕА-1 с распознающей частью 1С6 была создана на основе плазмиды рС1, путем клонирования в нее следующих участков: бсБу - участка, кодирующего одноцепочечную распознающую часть антитела к РЭА; С08 - участка, кодирующего костимулирующий фактор; С0247 - участка, кодирующего ^-цепь Т-клеточного рецептора. Вторая

конструкция - плазмида рСЕА-2 отличалась тем, что включала БеБу-участок из антитела 3С1.

Проведенные сравнительные исследования уровня связывания растворимого антигена РЭА трансфецированными активированными лимфоцитами спустя 48 часов после трансфекции показали, что он был в 4,3 раза выше для плазмиды pCEA-1 и в 3,5 раза выше для плазмиды pCEA-2, чем для неактивированных лимфоцитов в обоих случаях.

Таким образом, химерные мономолекулярные Т-клеточные рецепторы, экспрессируемые лимфоцитами человека, оказались способны связывать антиген РЭА в растворе .

Перейти в оглавление статьи >>>

Список литературы.

1. Боженко В.К., Шрамова Е.И., Шишкин А.М., Иванов А.В., Хохлова Е.В., Шкопоров А.Н. Исследование свойств новых мономолекулярных химерных Т-клеточных рецепторов к раково-эмбриональному антигену.//Клеточные технологии. 2010, (в печати).

2. Altenschmidt U., Moritz D., Groner B. Specific cytotoxic T lymphocytes in gene therapy // J. Mol. Med. - 1997. - V. 75. - N. 4. - P. 259-266.

3. Bjerner J., Lebedin Y., Bellanger L., KurokiM., Shively J.E., Varaas T., NustadK., Hammarstrom S., Bermer O. P. Protein Epitopes in Carcinoembryonic Antigen.// Tumor Bio., 2002., V. 23, P. 249-262.

4. Gade T.P., Hassen W., Santos E., Gunset G., Saudemont A., GongM.C., Brentjens R., ZhongX.S., StephanM., Stefanski J., Lyddane C., Osborne J.R., Buchanan I.M., Hall S.J., Heston W.D., Rivière I., Larson S.M., Koutcher J.A., SadelainM. Targeted elimination of prostate cancer by genetically directed human T lymphocytes // Cancer Res. - 2005. - V. 65. - N. 19. - P. 9080-9088.

5. Gold P., Freedman S.O. Demonstration of tumor-specific antigens in human colon carcinomata by immunological tolerance and absorption techniques.//J. Exp. Med. 1965, V. 121, P. 439-462.

6. June C.H. Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic.//J. Clin. Invest., 2007, V. 117, N. 6, P. 1466-1476.

7. Kruger C., Greten T.F., Korangy F. Immune based therapies in cancer // Histol Histopathol. -

2007. - V. 22. - N. 6. - P. 687-696.

8. Ma Q., DeMarte L., Wang Y., Stanners C.P., Junghans R.P. Carcinoembryonic antigenimmunoglobulin Fc fusion protein (CEA-Fc) for identification and activation of anti-CEA immunoglobulin-T-cell receptor-modified T cells, representative of a new class of Ig fusion proteins // Cancer Gene Ther. - 2004. - V. 11. - N. 4. - P. 297-306.

9. Ma Q., Safar M., Holmes E., Wang Y., Boynton A.L., Junghans R.P. Anti-prostate specific membrane antigen designer T cells for prostate cancer therapy // Prostate. - 2004. - V. 61. -N. 1. - P. 12-25.

10. Murphy A., Westwood J.A., Teng M.W., Moeller M., Darcy P.K., Kershaw M.H. Gene modification strategies to induce tumor immunity // Immunity. - 2005. - V. 22. - N. 4. - P.

403-414.

11. Tiwari M. From tumor immunology to cancer immunotherapy: miles to go // J Cancer Res Ther. - 2010. - V. 6. - N4. - P. 427-431.

Перейти в оглавление статьи >>>