CC BY
24
микробиология
© коллектив авторов, 2019
Косилова И.С.1, Домотенко Л.в.1, Фурсова Н.К.1, Дентовская СБ.1, Ершова М.Г.2, Шепелин А.П.1
ИСПЫТАНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА «АГАР МЮЛЛЕРА-ХИНТОН II - ОБОЛЕНСК»
'Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, 142279, п. Оболенск, Московская обл., Россия;
2ГБУЗ Ярославской области «Инфекционная клиническая больница № 1», 150040, Ярославль, Россия
Приведены результаты сравнительных испытаний разработанной в ФБУН ГНЦ ПМБ питательной среды «Агар Мюллера-Хинтон II - Оболенск» и контрольной питательной среды «MuellerHinton IIAgar» импортного производства при определении чувствительности к антимикробным препаратам (АМП) клинических штаммов бактерий с помощью диско-диффузионного метода и метода градиентной диффузии (Е-тесты), при оценке карбапенемазной активности штаммов, несущих гены карбапенемаз, в CIM-тесте. Использованы 173 охарактеризованных штамма бактерий видов: Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli; Photorhabdus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., в том числе на наличие генов карбапенемаз OXA - и NDM-типов у грамотрицательных бактерий. Показана высокая степень совпадения результатов определения чувствительности к антимикробным препаратам для двух питательных сред. Показатель согласования категорий чувствительности штаммов к АМП (S, I, R) составил 98,2% для диско-диффузионного метода, 94,4-100% - для методов Е-тестов и CIM-теста. В рамках Программы импортозамещения успешно разработана отечественная питательная среда «МХА II-Оболенск», удовлетворяющая требованиям ГОСТР ИСО 20776-2-2010 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам».
Ключевые слова: питательная среда; агар Мюллера-Хинтон; диско-диффузионный метод; Е-тесты; CIM-тест; грамотрицательные бактерии; грамположительные бактерии.
Для цитирования: Косилова И. С., Домотенко Л. В., ФурсоваН. К., Дентовская С. В., ЕршоваМ. Г., Шепелин А. П.
Испытания питательной среды отечественного производства «Агар Мюллера-Хинтон II - Оболенск». Клиническая
лабораторная диагностика.2019; 64 (6): 360-367. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-6-360-367
KosilovaI. S.1, DomotenkoL. V.1, FursovaN. K.1, DentovskayaS. V.1, ErshovaM. G.2, Shepelin A. P.1
TRIALS OF THE DOMESTICALLY PRODUCED NUTRIENT MEDIUM «AGAR MULLER-HINTON II - OBOLENSK»
1State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology of Rospotrebnadzor, 142279, Obolensk, Moscow region,
Russia;
2State Healthcare Institution of the Yaroslavl Region «Infectious Clinical Hospital No. 1», Yaroslavl, Russia
The results of the comparative tests of the «Agar Muller-Hinton II - Obolensk» nutrient medium developed in SRCAMB, Obolensk, and the control nutrient medium imported «Mueller Hinton II Agar» are presented in the study. The susceptibility of bacterial clinical strains to antimicrobial agents (AMP) was determined by the disc diffusion method and the method of gradient diffusion (E-test). The carbapenemase activity of the strains carrying the carbapenemase genes was determined by CIM-test. Total 173 characterized bacterial strains of species Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli; Photorhabdus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. were used in the study, including producers of OXA- andNDM-types carbapenemases for gram negative bacteria. A high degree of coincidence of the results obtained on both nutrient media was shown. The consistency index of the strain sensitivity categories to AMPs (S, I, and R) was 98.2% for the disc diffusion method, and 94.4-1000% -for E-test and CIM-test methods. Thus, within the framework of the Import Substitution Program, the domestic nutrient medium «MHA II-Obolensk» has been successfully developed. The nutrient medium meets the requirements of GOST R ISO 20776-2-2010 «Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems - Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices».
Keywords: nutrient medium; Muller-Hinton agar; disc diffusion method; E-test; CIM-test; gram-negative bacteria; grampositive bacteria.
For citation: Kosilova I. S., Domotenko L. V., Fursova N. K., Dentovskaya S. V., Ershova M. G., Shepelin A. P. Trials of the domestically produced nutrient medium «Agar Muller-Hinton II - Obolensk». Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics).2019; 64 (6): 360-367 (inRuss.) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-6-360-367 For correspondence: Kosilova I.S., Junior Researcher, Laboratory of Nutrient Medium Development; e-mail: kosilova.irina@ gmail.com
Information about authors:
Kosilova I.S., http://orcid.org/ 0000-0003-4020-0894 Fursova N.K., https://orcid.org/ 0000-0001-6053-2621
Domotenko L.V., http://orcid.org/0000-0002-4785-6418 Dentovskaya S.V., http://orcid.org/0000-0002-1996-8949
Shepelin A.P., http://orcid.org/0000-0002-8253-7527 Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsorship.
Received 25.04.2019 Accepted 30.04.2019
Для корреспонденции: Косилова Ирина Сергеевна, мл. науч. сотр. лаб. разработки питательных сред; e-mail: [email protected]
Введение. Инфекционные болезни, вызываемые бактериальными патогенами, во всем мире представляют серьёзную угрозу здоровью и жизни людей. Ситуация усугубляется угрожающим распространением антибио-тикорезистентных бактерий. По результатам масштабного исследования только в Европе и США каждый год до 50 тыс. жизней уносят инфекции, вызванные возбудителями, устойчивыми к лекарственной терапии, к 2050 г. прогнозируется рост летальных исходов до 10 млн. в год [1]. Устойчивость к антимикробным препаратам (АМП) - многогранная проблема, которая определяется многими взаимосвязанными факторами и требует слаженных действий от всего общества [2]. Ключевыми задачами, стоящими перед клиническими микробиологами, являются выделение, идентификация возбудителя инфекции и проведение тестов по определению чувствительности к АМП.
Для определения чувствительности микроорганизмов к АМП используют различные методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Наиболее часто применяемыми являются метод микроразведений в бульоне, диско-диффузионный метод, метод градиентной диффузии, так называемый метод Е-тестов. Метод микроразведений в бульоне, являющийся референтным, в основном, выполняется в автоматизированном варианте с использованием коммерческих автоматизированных анализаторов. Диско-диффузионный метод и метод градиентной диффузии относятся к «ручным» методам. Перечисленные методы обеспечивают качественную оценку чувствительности микроорганизмов к АМП с использованием трёх клинически ориентированных категорий: чувствительные, условно-резистентные, устойчивые (резистентные). Методы микроразведений и градиентной диффузии дают количественные результаты оценки чувствительности к АМП, выражаемые в значениях минимальной подавляющей концентрации (МПК). Все три метода преследуют одну цель, которая заключается в обеспечении надёжного прогнозирования эффективности лечения конкретного пациента с помощью конкретного АМП1. Результаты тестирования должны быть надежными и достоверными.
Достоверность результатов, получаемых при использовании методов определения чувствительности к АМП, зависит от качества питательных сред и реагентов, выбора метода тестирования и соблюдения стандартной процедуры исследования, регулярного проведения контроля качества и др. Для выполнения диско-диффузионного метода и метода градиентной диффузии используют агар Мюллера-Хинтон, к качеству которого предъявляют строгие требования. В стандартах Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), экспертных правилах European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), клинических рекомендациях «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» приведены данные интегрального метода оценки качества агара Мюллера-Хинтон, основанного на анализе соответствия размеров зон подавления роста АМП для контрольных штаммов целевым значениям или нахождения этих показателей в установленных пределах. Современные критерии пригодности питательной среды для оценки антимикробной
Юпределение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Клинические рекомендации. Версия 2018-03.
microbiology
чувствительности изложены в новом международном стандарте ISO/TS 16782:2016 «Clinical laboratory testing
- Criteria for acceptable lots of dehydrated Mueller-Hinton agar and broth for antimicrobial susceptibility testing», не имеющем пока российского аналога в виде ГОСТа. В документе содержатся физико-химические критерии, среди которых содержание марганца, цинка, тимидина, и интегральные критерии, а именно допустимые значения диаметров зон подавления роста контрольных штаммов для конкретных комбинаций микроорганизм
- АМП, являющиеся своеобразными индикаторами качества питательной среды. Несоответствие критериям пригодности может быть причиной ошибок при определении чувствительности к АМП [3-5].
В ФБУН ГНЦ ПМБ разработана технология и организовано производство отечественного агара Мюллера-Хинтон II. Римская цифра II исторически введена в название питательной среды, свидетельствуя о том, что при её производстве все компоненты используются в сухом виде [6]. Со временем цифра из названия среды некоторых фирм-производителей исчезла и сохранилась только у BioMerieux, BD BBL, HiMedia.
Разработанная среда удовлетворяет современным требованиям нормативов EUCAST, Клинических рекомендаций «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», Стандарта ISO/ TS 16782:2016, в том числе по содержанию элементов кальция, магния, марганца, цинка, влияющих на результаты определения чувствительности микроорганизмов. Диаметры зон подавления роста всех использованных тест-штаммов соответствовали рекомендованным целевым значениям или незначительно отличались от них, находясь в рекомендованных диапазонах.
Цель исследования - оценить качество агара Мюллера-Хинтон II отечественного производства при определении чувствительности к АМП микроорганизмов, относящихся к различным видам и родам, включая новые, с помощью диско-диффузионного метода, метода градиентной диффузии, при выявлении карбапенемаз-продуцирующих штаммов грамотрицательных микроорганизмов с помощью CIM-теста.
Материал и методы. Биоэтические требования. Материалы, использованные в работе, не содержат персональных данных пациентов, т. к. полученные от них клинические изоляты промаркированы без указания фамилии, даты рождения, адреса проживания, номера истории болезни, личных документов и других именных материалов. В соответствии с требованиями биоэтического комитета Российской Федерации, каждый пациент при поступлении в клинику заключал договор с лечебным учреждением, содержащий согласие на проведение лечения и лабораторного обследования.
Питательные среды. В работе использованы питательные среды «Агар Мюллера-Хинтон II» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия, РУ № РЗН 2017/5962) - далее по тексту «МХА II-Оболенск», в качестве контрольной среды -«Mueller Hinton II Agar» (Becton Dickinson, США) - далее по тексту «МХА II-BD».
Штаммы. В работе использованы охарактеризованные музейные штаммы грамотрицательных возбудителей внутрибольничных инфекций (n=18): Klebsiella pneumoniae (n=8), Pseudomonas aeruginosa (n=2), Acinetobacter baumannii (n=3), Proteus mirabilis (n=2), Serratia marcescens (n=1), Enterobacter aerogenes (n=1), Escherichia coli (n=1); музейные штаммы нового патоге-
микробиология
на Photorhabdus spp. (n=8), клинические изоляты бактерий (n=147), включая K. pneumoniae (n=49), A. baumannii (n=49), Staphylococcus aureus (n=14), Enterococcus spp. (n=14), E. coli (n=12), P. aeruginosa (n=9).
Диски с АМП. При определении чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом использованы диски с 50 АМП (BD, США), относящиеся к 17 функциональным группам: пенициллины, включая пенициллины, защищенные ингибиторами ß-лактамаз, (ампициллин, ампициллин/сульбактам, амоксициллин/ клавулановая кислота, бензилпенициллин, карбени-циллин, мециллинам, пиперациллин, пиперациллин/ тазобактам, тикарциллин, тикарциллин/клавулановая кислота), цефалоспорины (цефуроксим, цефокситин, цефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим, цефоперазон/ сульбактам, цефепим, цефтаролин), монобактамы (аз-треонам), карбапенемы (эртапенем, меропенем, имипе-нем, дорипенем), аминогликозиды (канамицин, тобра-мицин, гентамицин, амикацин, нетилмицин), хинолоны/ фторхинолоны (налидиксовая кислота, норфлоксацин, офлоксацин, перфлоксацин, ципрофлоксацин, левоф-локсацин, моксифлоксацин), макролиды (эритромицин, кларитромицин, азитромицин), тетрациклины (тетрациклин, доксициклин, миноциклин, тигециклин), липо-пептиды (колистин, полимиксин), гликопептиды (ван-комицин), рифамицины (рифампицин), линкозамиды (клиндамицин), сульфаниламиды (триметоприм/сульфа-метоксазол), нитрофураны (нитрофурантоин), амфени-колы (хлорамфеникол), фузидиевая кислота.
Е-тесты. При определении чувствительности микроорганизмов методом градиентной диффузии использованы Е-тесты (BioMerieux, Франция) 13 наименований: амоксициллин 0,016-256 мг/л, ампициллин 0,016256 мг/л, цефотаксим 0,016-256 мг/л, цефтазидим 0,016256 мг/л, имипенем 0,002-32 мг/л, меропенем 0,002-32 мг/л, гентамицин 0,016-256 мг/л, стрептомицин 0,0641024 мг/л, ципрофлокасин 0,02-32 мг/л, левофлоксацин 0,002-32 мг/л, тетрациклин 0,016-256 мг/л, доксициклин 0,016-256 мг/л, хлорамфеникол 0,016-256 мг/л.
Диско-диффузионный метод. Чувствительность микроорганизмов к АМП определяли в соответствии с Клиническими рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» и стандартами EUCAST (Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам)2. Культивирование бактерий осуществляли при температуре 350 С в течение 18-20 ч, за исключением штаммов Photorhabdus spp., которые выращивали при двух температурах (25 и 3 70 С) в течение 18-20 ч (P. asymbiotica subsp. asymbiotica US86, P. asymbiotica subsp. asymbiotica US88, P. asymbiotica subsp. asymbiotica AU46, P. asymbiotica subsp. asymbiotica AU97, P. asymbiotica CbKj163, P. luminescens subsp. luminescens HbT) и в течение 42-44 ч (P. luminescens subsp. akhurstii FRG04, P. luminescens subsp. laumondii TT01T).
Диаметр зон подавления роста бактерий измеряли в мм, регистрируя клиническую категорию чувствительности: чувствительный (S), умеренно-резистентный (I), устойчивый (R) штамм. Интерпретацию результатов проводили в соответствии с критериями, изложенными в клинических рекомендациях, за исключением резуль-
2European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EU-
CAST) Version 8.1, 2018.
татов по тестированию A. baumannii к пиперациллину, пиперациллин/тазобактаму, цефтазидиму, ампициллин/ сульбактаму, P. aeruginosa к колистину, полимиксину, E. coli к налидиксовой кислоте, K. pneumoniaе к нали-диксовой кислоте, миноциклину, S. aureus к норфлок-сацину, Enterococcus spp. к левофлоксацину, тетрациклину, которые интерпретировали по стандарту CLSI3. Результаты, полученные при тестировании A. baumannii к азтреонаму, тигециклину, цефоперазон/сульбакта-му, Enterococcus spp. к гентамицину, K. pneumoniaе и P aeruginosa к цефоперазон/сульбактому, оценивали только путём сравнения абсолютных значений с таковыми для контрольных штаммов.
Определение чувствительности методом Е-тестов проводили в соответствии с инструкцией производителя. Минимальные подавляющие концентрации антимикробных препаратов в мг/л определяли визуально, идентифицируя клиническую категорию штамма: чувствительный (S), умеренно-резистентный (I), резистентный (R), в соответствии с актуальной версией стандарта EUCAST.
CIM-тест (Carbapenem Inactivation Method) проводили в соответствии с рекомендациями W. Song и соавт. [7]. Диски, содержащие 10 мкг меропенема, выдерживали в бактериальной суспензии исследуемого штамма, плотность которой соответствовала 0,5 по стандарту мутности МакФарланда, при температуре 350 С в течение 2 ч. Обработанные и контрольные (необработанные) диски помещали на поверхность питательных сред «МХА II-Оболенск» и «МХА II-BD», со свежезасеян-ным газоном тест-штамма E. coli АТСС 25922. Посевы инкубировали при температуре 350 С в течение 16-18 ч. При отсутствии зоны подавления роста тест-штамма фиксировали наличие карбапенемазной активности в исследуемом клиническом штамме (положительный результат), при наличии зоны подавления роста с диаметром >20 мм - отсутствие карбапенемазной активности в исследуемом штамме (отрицательный результат).
Детекция генов антибиотикорезистентности. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в классическом режиме со специфичными праймерами определяли гены карбапенемаз blaoxA-48, ^OXA^^ bla0XA-40-like,
bla , как описано ранее [8-10].
Результаты. Для оценки качества питательной среды «МХА II-Оболенск» выбраны грамположительные и грамотрицательные бактерии - возбудители ИСМП, новый патоген - Photorhabdus spp., тестирование проводили в несколько этапов.
Чувствительность возбудителей ИСМП. На I этапе проводили испытания новой питательной среды в лаборатории разработки питательных сред ФБУН ГНЦ ПМБ с использованием 18 музейных штаммов грамотрицательных бактерий, охарактеризованных по чувствительности к АМП и наличию генетических детерминант антибиотикорезистентности (табл. 1). Выбор тест-штаммов обусловлен клинической значимостью бактерий видов K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii, P. mirabilis и др. в качестве возбудителей ИСМП [11]. Определяли чувствительность штаммов к 28 антибиотикам на среде «МХА II-Оболенск» диско-
Clinical and Laboratory Standards Institute (M100-S24 Performance Standards For Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty - Fourth Informational Supplement, January, 2014 r.).
microbiology Таблица 1
Характеристика нозокомиальных штаммов, использованных для тестирования среды «МХА II-Оболенск»
Вид микроорганизма Штамм Резистентность к АМП Генетические детерминанты антибиотикорези-стентности
K. pneumoniae В-1822/14 AMC, CEF, CTA, CAZ, FEP, EPM, GEN, TOB, AMI, CIP, TET, TGC, CTZ, NIT, CM blaSHV blaCTX-M, blaOXA-48
В-1969/14 AMC, CEF, CTA, CEX, EPM, IMI, TOB, CIP, CTZ, NIT, CM blaSHV blaOXA-48
В-352К/15 AMC, CEF, CEX, CTA, CAZ, FEP, EPM, GEN, TOB, CIP, NIT, CM blaSHV ^^TX-M-^ blaOXA-244
В-369/15 AMC, CEF, CEX, CTA, CAZ, FEP, EPM, GEN, TOB, CIP, TGC, CTZ, NIT, CM blaSHV blaCTX-M-15, blaOXA-244
410 AMC, CEF, CEX, CTA, CAZ, FEP, EPM, GEN, TOB, CIP, CTZ, NIT, CM blaNDM
409 AMC, CEF, CEX, CTA, CAZ, FEP, EPM, GEN, TOB, CIP, CTZ, NIT, CM blaNDM
I-1627 AMP, TCA blasHV
I-2135 AMP, TCA blasHV
A. baumannii В-740/14 AMC, CEF, CEX, CTX, CTA, CAZ, FEP, IMI,GEN, TOB, AMI, CIP, CTZ, NIT, CM blaTEM, blacTX-M-2, blaoXA-40-like, blaOXA-51-like
В-2137/14А AMC, CEF, CEX CTX, CTA, CAZ, FEP, IMI, GEN, TOB, AMI, CIP, TET, CTZ, NIT, CM blaTEM, blaCTX-M-15, blaOXA-23-like, blaOXA-51-like, int2
В-774/15А AMC, CEF, CEX, CTX, CTA, CAZ, FEP, IMI, GEN, TOB, AMI, CIP, NIT, CM blaTEM, blacTX-M-115, blaoXA-40-like, ^^XA^b^ int1
P. aeruginosa В-458/14 AMC, CAZ, TCA, TCC, PIP, FEP, IMI, MER, GEN, TOB, CIP, PEF, CTZ blaVIM-2, int1
В-519/14Р AMC, CAZ, TCA, TCC, PIP, FEP, IMI, MER, GEN, TOB, CIP, PEF, CTZ blaVIM-2
P. mirabilis В-757М CEF, CTA, FEP, TET, TGC, GEN, TOB,CIP, NIT, CM blaTEM, blaCTX-M-15, blaOXA-244, int2
В-912/14 CEF, TET, TGC, CIP, NIT, CM ^CTX-M-^ int1, int2
S. marcescens В-208/15 CEF, CTA, FEP, GEN, TOB, CIP, NIT, CM blaTEM, blaCTX-M-3
E. aerogenes В-658/15 CEF, CEX, CTX, FEP, AZR, GEN, AMI, NET, CTZ blaTEM, blaCTX-M-3, int1
E. coli В-529/15 AMC, CEF, CTX, CAZ, FEP, CIP, CTZ blaCTX-M-15
Примечание. AMC - амоксициллин/клавулановая кислота, AMP - ампициллин, CEF - цефуроксим, CEX - цефокситин, CTX - це-фотаксим, CTA - цефтриаксон, CAZ - цефтазидим, TCA - тикарциллин, TCC - тикарциллин/клавулановая кислота, PIP - пиперациллин, FEP - цефепим, EPM - эртапенем, AZR - азтреонам, IMI - имипенем, MER - меропенем, TET - тетрациклин, TGC - тигециклин, CIP - ци-профлоксацин, PEF - пефлоксацин, CM - хлорамфеникол, GEN - гентамицин, TOB - тобрамицин, AMI - амикацин, CTZ - триметоприм/ сульфаметоксазол, NET - нетилмицин, NIT - нитрофурантоин; blaSHV blaClX_M bla A, blaNDM blaT¡¡M blay¡M- гены бета-лактамаз SHV, CTX-М, OXA, NDM, TEM, и VIM типов; intl - интегрон класса 1, int2 - интегрон класса 2.
диффузионным методом (см. рисунок на обложке). Параллельно оценивали чувствительность этих штаммов к тем же АМП на контрольной питательной среде - «МХА II-BD». Значения диаметров зон подавления роста всех исследованных штаммов микроорганизмов, полученные на обеих питательных средах, совпадали между собой практически для всех АМП, отличаясь максимально на ±3 мм, что не влияло на результаты интерпретации в соответствии с клиническими критериями чувствительности (табл. 2). В ходе испытаний выполнили по 1512 тестов на разработанной и контрольной питательных средах. В 1506 тестах (99,6%) получили совпадающие результаты, в шести (0,4%) - результаты не совпадали. Штамм P. aeruginosa В-519/14Р классифицирован на среде «МХА II-BD» как резистентный к цефтазидиму, на среде «МХА П-Оболенск» - как чувствительный. Штамм K. pneumoniae В-1969/14 определен на среде «МХА II-BD» как резистентный к миноциклину, на среде «МХА II-Оболенск» - как умеренно-резистентный.
Сравнение данных диско-диффузионного метода с данными, полученными при тестировании штаммов на приборе Vitek 2 Compact, показали совпадение интерпретации чувствительности с данными, полученными на контрольной среде «МХА II-BD».
Чувствительность клинических изолятов. На II этапе проводили клинические испытания разработанной питательной среды на базе Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Ярославской области «Инфекционная клиническая больница» диско-диффузионным методом. Использовано 147 клинических изолятов бактерий, из которых K. pneumoniae
- 49, A. baumannii - 49, S. aureus - 14, Enterococcus spp.
- 14, E. coli - 12, P. aeruginosa - 9, выделенных от пациентов нескольких отделений больницы. Значения диаметров зон подавления роста тест-культур на двух средах отличались максимально на 1-2 мм для всех использованных дисков с АМП. Полученные различия не влияли на определение клинических категорий чувствительно-
микробиология
Таблица 2
Результаты определения чувствительности музейных штаммов и клинических изолятов грамотрицательных бактерий на питательных средах «МХА П-Оболенск» и «МХА П-BD» (I и II этапы испытаний)
I этап испытаний II этап испытаний
Музейные штаммы Количество Всего про- Количество Клинические изоляты Количество Всего про- Коли-
АМП к которым деланных совпавших АМП к которым деланных чество со-
проводили тестов* тестов** проводили тестов* впавших
тестирование тестирование тестов**
K. pneumoniae (n=8) 28 672 669 K. pneumoniae (n=49) 28 4116 4116
A. baumannii (n=3) 28 252 252 A. baumannii (n=49) 28 4116 4116
P. aeruginosa (n=2) 28 168 165 S. aureus (n=14) 8 336 336
P. mirabilis (n=2) 28 168 168 Enterococcus spp.(n=14) 9 378 378
S. marcescens (n=1) 28 84 84 E. coli (n=12) 12 432 429
E. aerogenes (n=1) 28 84 84 P. aeruginosa (n=9) 11 297 297
E. coli (n=1) 28 84 84
Итого 28 1512 1506 Итого 28 9675 9672
Примечание. * - определение чувствительности к каждому АМП выполняли в трех повторах; ** - данные в сравнении с результатами тестов на контрольной питательной среде «МХА II- BD».
сти, за исключением одного несовпадающего результата для изолята E. coli Х 623, который чувствителен к амок-сициллину/клавулановой кислоте на контрольной среде «МХА II-BD» и устойчив к этому препарату на среде «МХА II-Оболенск» (табл. 2).
В соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 207762-20 1 04 изделия, применяемые для испытаний антибактериальной чувствительности, считаются пригодными, если показатель согласования категорий клинической чувствительности с референтным методом превышает 90%, при этом допустимый процент больших расхождений и очень больших расхождений - менее 3%. В соответствии с приведёнными показателями проведён анализ результатов определения чувствительности 165 штаммов возбудителей ИСМП и внегоспитальных инфекций к АМП на разработанной питательной среде «МХА II-Оболенск» и контрольной питательной среде «МХА II-BD» надёжного производителя Becton Dickinson с помощью диско-диффузионного метода. Показатель согласования клинических категорий (S, I, R), полученных на разработанной и контрольной средах, составил 98,2% (162 из 165 штаммов). Поскольку все три несовпадающих результата фиксировали при тестировании грамо-трицательных бактерий, дальнейший расчёт показателей расхождений проводили только для них (n=137).
Первое расхождение, касающееся определения чувствительности штамма P. аeruginosa В-519/14Р к цефта-зидиму, отнесли к категории «очень большие расхождения». Доля «очень больших расхождений», рассчитываемая как отношение количества штаммов с «очень большим расхождением» (n=1) к количеству проанализированных устойчивых к цефтазидиму грамотрица-тельных бактерий (n=87), составила 1,1%. Такой уровень расхождений не превышает допустимых значений, изложенных в ГОСТ Р ИСО 20776-2-2010 (3%).
Второе выявленное расхождение, полученное при тестировании чувствительности штамма K. рneumoniae
4Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. https:// allgosts.ru/11/100/gost_r_iso_20776-2-2010.pdf
В-1969/14 к миноциклину, отнесли к категории «малые расхождения». Доля «малых расхождений», определенная как отношение количества штаммов с «малым расхождением» (n=1) к общему количеству проанализированных на чувствительность к миноциклину грамотрицательных бактерий (n=137), составила 0,7%. Требования к данному показателю в ГОСТ Р ИСО 20776-2-2010 отсутствуют.
Третий случай несовпадения результатов чувствительности бактерий к АМП на разработанной питательной среде «МХА II-Оболенск» и контрольной питательной среде «МХА II-BD», отмеченный для клинического изолята E. coli Х 623 по отношению к амоксициллину/ клавулановой кислоте, отнесли к категории «большие расхождения». Доля «больших расхождений», определенная как отношение количества штаммов с «большим расхождением» (n=1) к количеству проанализированных чувствительных к амоксициллину/клавулановой кислоте грамотрицательных бактерий (n=42), составила 2,7%, что не превышало допустимых значений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 20776-2-2010 (3%).
Чувствительность штаммов Photorhabdus spp. На III этапе испытаний оценивали питательную среду «МХА II-Оболенск» при определении чувствительности к АМП диско-диффузионным методом восьми музейных штаммов Photorhabdus spp., нового патогена человека [12]. Грамотрицательные почвенные бактерии рода Photorhabdus (сем. Enterobacteriaceae) известны как симбионты энтомопатогенных нематод семейства Heterorhabditidae и паразиты личиночных форм насекомых, их применяют в сельском хозяйстве в качестве биологических инсектицидов. Установлена этиологическая роль представителя этого рода P. asymbiotica при развитии инфекционно-воспалительных заболеваний у иммунокомпрометированных пациентов [13-18]. Для тестирования питательной среды «МХА II-Оболенск» использованы пять патогенных для человека штаммов P. asymbiotica и три непатогенных штамма P. luminescens. По данным литературы чувствительность Photorhabdus spp. к АМП зависит от температуры культивирования [18], тестирование проводили при двух температурах: 25 и 370 С, имитирующих условия в организме нематод и личинок насекомых или в организме человека, соответственно (табл. 3).
microbiology Таблица 3
Результаты определения чувствительности штаммов Photorhabdus spp. к АМП диско-диффузионным методом на питательных средах «МХА II-Оболенск» и «МХА II-BD» (III этап испытаний)
Диски с антимикробны- Штаммы Photorhabdus spp. / Температура культивирования, °С
ми препаратами P. asymbi- P. asymbiotica P. asymbiotica P. asymbiotica P. asymbiotica P. luminescens P. luminescens P. luminescens
otica US86 US88 AU46 AU97 CbKj163 HbT FRG04 TT01T
25 37 25 37 25 37 25 37 25 37 25 37 25 37 25 37
Амоксициллин/ R S R S R S R R R R R S R R R R
клавулановая к-та
Ампициллин R S R S R S R R R R R S S S R R
Бензилпенициллин R S R S R S R R R R R S R R R R
Гентамицин S S S S S S S S S S S S S S S S
Доксициклин S S S S S S S S S S S S S S S S
Имипенем S S S S S S S S S S S S S S S S
Канамицин S S S S S S S S S S S S S S S S
Карбенициллин S S S S S S R R R R R R S S R R
Кларитромицин R R R R R R I I R R I I R R R R
Хлорамфеникол S S S S S S S S S S S S S S S S
Левофлоксацин S S S S S S S S S S S S S S S S
Пеперациллин S S S S S S S S S S S S S S S S
Тобрамицин S S S S S S S S S S S S S S S S
Триметоприм/ S S S S S S S S S S S S S S S S
сульфаметоксазол
Цефепим S S S S S S S S S S S S S S S S
Цефокситин R R R R R R R R R R S S R R S S
Цефотаксим S S S S S S S S S S S S S S S S
Цефтазидим S S S S S S S S S S S S S S S S
Цефтриаксон S S S S S S S S S S S S S S S S
Ципрофлоксацин S S S S S S S S S R R S S S
Примечание. S- чувствительный, I умеренно-резистентный и R устойчивый штаммы.
Таблица 4
Определение чувствительности возбудителей ИСМП к АМП методом Е-тестов на питательных средах «МХА П-Оболенск» и «МХА
П-BD» (IV этап испытаний)
Тест-штаммы Всего проделанных тестов* Количество совпавших тестов** Количество тестов, для которых значение МПК отличалось на одно двукратное разведение (наименования АМП)** Количество тестов, для которых значение МПК отличалось на два двукратных разведения (наименования АМП)**
K. pneumoniae (n=8) 312 177 54 (АМ, СТ, TZ, Щ МЕ^ а, LE, GM, 81 (АМ, СТ, Т^ Щ МЕ^ а, LE, GM,
A. baumannii (n=3) 117 69 30 (Щ МЕ^ LE, GM, а) 18 (Щ МЕ^ LE, GM, а)
P. aeruginosa (n=2) 78 51 15 (Щ МЕ^ LE, а, GM) 12 ^М, Щ МЕ^ TZ)
P. mirabilis (n=2) 78 60 18 (СТ, Щ МЕ^ а, LE, GM) 0
S. marcescens (n=1) 39 27 12 (Щ МЕ^ а, LE) 0
E. aerogenes (n=1) 39 24 15 (АМ, СТ, TZ, Щ MER) 0
E. coli (n=1) 39 15 24 (АМ, СТ, TZ, GM) 0
Итого 702 423 168 111
Примечание. * - определение чувствительности к каждому АМП выполняли в трех повторах; ** - данные в сравнении с результатами тестов на контрольной питательной среде «МХА II - BD». АМ - ампициллин, СТ - цефотаксим, TZ - цефтазидим, 1Р - имипенем, MER -меропенем, GM - гентамицин, С1 - ципрофлоксацин, LE - левофлоксацин, ^ - хлорамфеникол.
Обнаружено влияние температуры культивирования на результаты определения чувствительности к ампициллину, бензилпенициллину, амоксициллину/ клавулановой кислоте для трёх штаммов Р. asymbiotica ^86, Р. asymbiotica ^88, Р. asymbiotica Аи46 и одного штамма Р. luminescens НЬТ: при температуре 250 С их регистрировали как резистентные, при 370 С - как чувствительные. При определении чувствительности этих штаммов к остальным АМП не наблюдали зависимости результатов от температуры, но регистрировали устойчивость к некоторым АМП при обеих температурах (табл. 3). Четыре штамма Р. asymbiotica
Аи97, Р. asymbiotica СЬК)163, Р. luminescens FRG04, Р. luminescens ТТ01Т проявляли чувствительность к большинству АМП. Исключение составил штамм Р. asymbiotica Аи97: штамм был резистентный к пяти АМП и умеренно-резистентный к одному АМП. Аналогичные результаты получили для штамма Р. asymbi-оЫса СЬК)163, за исключением устойчивости к клари-тромицину. Штамм Р. luminescens FRG04 резистентен к четырём АМП, штамм Р. luminescens ТТ01Т - к пяти АМП. Различий в антибиотикограммах штаммов, полученных на питательной среде «МХА 11-Оболенск» и на контрольной среде «МХА II-BD», не выявлено.
микробиология
Таблица 5
Детекция карбапенемазной активности штаммов методом CIM-теста на питательных средах «МХА П-Оболенск» и «МХА П-BD»
(V этап испытаний)
Вид бактерий Штамм Гены карба- Результаты Вид бактерий Штамм Гены карбапе- Результаты
пенемаз С1М-метода немаз С1М-метода
K. pneumoniae 410 bla^„, NDM-1 Положительный K. pneumoniae YKP203 bla0XA-48 Положительный
K. pneumoniae 409 blaNDM-1 Положительный K. pneumoniae I-1627 - Отрицательный
K. pneumoniae В-352К/15 bla0XA-244 Положительный K. pneumoniae I-2135 - Отрицательный
K. pneumoniae В-369/15 bla0XA-244 Положительный K. pneumoniae YKP1648 - Отрицательный
K. pneumoniae В-1822/14 bla0XA-48 Положительный K. pneumoniae YKP2111 - Отрицательный
K. pneumoniae В-1969/14 bla0XA-48 Положительный A baumannii В-740/14 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP201 bla0XA-48 Положительный A baumannii В-774/15А bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP202 bla0XA-48 Положительный A baumannii В-2137/14А bla0XA-23-like Положительный
K. pneumoniae YKP200 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB43 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP16 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB61 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP2160 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB66 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP1645 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB118 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP1747 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB127 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP1643 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB179 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP1646 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB144 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP1644 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB121 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP902 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB140 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP533 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB220 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP2395 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB224 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP498 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB246 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP522 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB268 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP87 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB56 bla0XA-40-like Положительный
K. pneumoniae YKP669 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB199 - Отрицательный
K. pneumoniae YKP2291 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB122 - Отрицательный
K. pneumoniae YKP1142 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB246 - Отрицательный
K. pneumoniae YKP178 bla0XA-48 Положительный A baumannii YAB245 - Положительный
Примечание: blaOXA и
blaNDM- гены карбапенемаз OXA- и NDM- типов, «-» - отсутствие гена карбапенемазы.
Метод Е-тестов. На IV этапе проводили оценку качества разработанной питательной среды «МХА II-Оболенск» при определении чувствительности штаммов возбудителей ИСМП, использованных на первом этапе испытаний (см. табл. 1) методом градиентной диффузии (Е-тестов). Данный метод позволяет определять значение минимально подавляющей концентрации (МПК) антимикробных препаратов, что сопоставимо с данными метода разведений (см. рисунок). В ходе исследования на разработанной и контрольной питательных средах провели по 702 теста. Значения МПК антимикробных препаратов на обеих средах полностью совпали в 423 тестах (60,2%), различались на одно двукратное разведение, не выходя за рамки точности метода, - в 168 тестах (23,9%), различались на два двукратных разведения - в 111 тестах (15,8%). Только один штамм (K. рneumoniae В-1969/14) интерпретировали на разработанной и контрольной питательных средах по-разному: как чувствительный к доксициклину на среде «МХА II-BD» и как умеренно-резистентный - на среде «МХА II-Оболенск» (табл. 4).
Показатель согласования категорий чувствительности 18 музейных штаммов бактерий к АМП при определении значений МПК для амоксициллина, ампициллина, гентамицина, стрептомицина, тетрациклина, имипе-нема, меропенема, хлорамфеникола, левофлоксацина, ципрофлокасина, цефотаксима, цефтазидима составил
100%, для доксициклина - 94,4%, что соответствует требованиям ГОСТ Р ИСО 20776-2-2010.
CIM-тест. На V этапе испытаний оценивали экспериментальные данные по инактивации карбапене-мов клеточными лизатами штаммов-продуцентов кар-бапенемаз на разработанной питательной среде «МХА II-Оболенск» в сравнении с контрольной питательной средой «МХА II-BD». Этот тест позволяет идентифицировать штаммы, продуцирующие карбапенемазы. Использованы штаммы, несущие гены карбапенемаз OXA-48-типа (n=23), OXA-244-типа (n=2), OXA-40-типа (n=16), OXA-23-типа (n=1), NDM-1 (n=2) и не имеющие гены карбапенемаз (n=8). Все штаммы K. pneumoniae и A. baumannii, содержащие гены карбапенемаз, продемонстрировали положительный результат в CIM-тесте. Штаммы, не имеющие гены карбапенемаз, показали отрицательный результат в CIM-тесте, кроме одного штамма (A. baumannii YAB245), который продемонстрировал положительный результат, возможной причиной которого может являться наличие в этом штамме не выявленного с помощью использованного набора праймеров для ПЦР гена карбапенемазы (табл. 5). Несовпадений результатов, полученных на разработанной питательной среде «МХА II-Оболенск» и на контрольной питательной среде «МХА II-BD», не зафиксировано.
Обсуждение. Испытания разработанной в ФБУН ГНЦ ПМБ питательной среды «МХА II-Оболенск» в
сравнении с контрольной питательной средой «МХА II-BD» продемонстрировали высокую степень совпадений полученных результатов тестирования чувствительности грамположительных и грамотрицательных штаммов бактерий к АМП разных функциональных классов. Подавляющее большинство использованных тест-штаммов и клинических изолятов отнесены к категориям чувствительных, умеренно-резистентных, устойчивых бактерий идентично на обеих использованных питательных средах. Отмеченные единичные случаи расхождений результатов соответствуют требованиям ГОСТ Р ИСО 20776-2-2010 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам». Возможность получения адекватных результатов микробиологических экспериментов продемонстрирована при использовании диско-диффузионного метода, метода градиентной диффузии, CIM-теста, что подтверждает фенотипическое выражение генетических детерминант антибиотикорезистентности.
В рамках Программы импортозамещения в России успешно разработана питательная среда «МХА II-Оболенск», пригодная для получения надёжных и достоверных результатов определения чувствительности клинически значимых бактерий к антимикробным препаратам.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
ЛИТЕРАТУРА (1, 3-4, 7-11, 13-17 см. REFERENCES)
2. Миронов А.Ю., Крапивина И.В., Мудрак Д.Е., Иванов Д.В. Молекулярные механизмы резистентности к Р-лактамам патогенов внутрибольничных инфекций. Клиническая лабораторная диагностика. 2012; 1: 39-43.
5. Шепелин А.П., Морозова Т.П., Косилова И.С., Глазкова Г.П., До-мотенко Л.В. Оценка качества питательных сред для определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Дезинфекция. Антисептика. 2013; 1: 43-8.
6. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. СПб.: Издательство «ЭЛБИ-СПб»; 2008.
12. Авдошин В.П., Макаров О.В., Киричек А.А. Photorhabdus asymbiotica — новый представитель грамотрицательной микрофлоры в инфекции мочевых путей. Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: медицина. 2013; 4: 94-9. 18. Киршева Н.А., Ганина Е.А., Комбарова Т.И., Шайхутдинова Р.З., Дентовская С.В, Анисимов А.П. Инфекционная чувствительность мышей линии BALB/c к заражению Photorhabdus asymbiotica и Photorhabdus temperate. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; 3(113): 64-6.
REFERENCES
1. Jim O'Neill. Tackling drug-resistant infections globally: Final report and recommendations. London: The review on antimicrobial resistance. 2016. URL: https://amr-review.org/sites/default/ files/160525_Final%20paper_with%20cover.pdf.
2. Mironov A.YU., Krapivina I.V., Mudrak D.E., Ivanov D.V. Molecular mechanisms of the antibacterial resistance of nosocomial infection pathogens to P-lactams. Klinicheskaya laboratornaya diagnos-tika. 2012; 1: 39-43. (in Russian)
microbiology
3. Veenemans J., Mouton J.W., Kluytmans J.A., Donnely R., Verhulst C., van Keulen P.H. Effect of manganese in test media on in vitro susceptibility of Enterobacteriaceae and Acinetobacter bauman-nii to tigecycline. Journal of Clinical Microbiology. 2012; 50(9): 3077-9.
4. Daly J. S., Dodge R. A., Glew R. H., Soja D. T., Deluca B. A., Hebert S. Effect of zinc concentration in Mueller-Hinton Agar on susceptibility of Pseudomonas aeruginosa to imipenem. Journal of Clinical Microbiology. 1997; 35(4): 1027-9.
5. Shepelin A.P., Morozova T.P., Kosilova I.S., Glazkova G.P., Domo-tenko L.V. Assessment of the quality of nutrient media for determining sensitivity to antibacterial drugs. DezinfektsiyaAntiseptika . 2013; 1: 43-8. (in Russian)
6. Polyak M.S. Nutrient media for medical and sanitary microbiology. St.Petersburg: ELBI-SPb; 2008. (in Russian)
7. Song W., Kim H.-S., Kim J.-S., Kim H. S., Shin D. H., Shin S., Park M.-J. Carbapenem Inactivation Method: Accurate Detection and Easy Interpretation of Carbapenemase Production in Enterobacte-riaceae and Pseudomonas spp. Ann. Clin. Microbiol. 2016; 19(4): 83-7.
8. Fursova N.K., Astashkin E.I., Knyazeva A.I., Kartsev N.N., Leonova E.S., Ershova O.N., Alexandrova I.A., Kurdyumova N.V., Sazikina S.Y., Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Dyatlov I.A. The spread of blaOXA-48 and blaOXA-244 carbapenemase genes among Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis and Enterobacter spp. isolated in Moscow, Russia. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2015; 14(1): 46.
9. Dyatlov I., Astashkin E., Kartsev N., Ershova O., Svetoch E., Fir-stova V., Fursova N. Novel blaCTX-M-2-type gene coding extended spectrum beta-lactamase CTX-M-115 discovered in nosocomial Acinetobacter baumannii isolates in Russia. In: Multidisciplinary Approaches for Studying and Combating Microbial Pathogens. Ed. A. Mendez-Vilas. Brown Walker Press. Boca Raton, Florida, USA. 2015; 107-110. ISBN-10: 1-62734-544-2. ISBN-13: 978-1-62734544-6.
10. Ageevets V.A., Partina I.V., Lisitsyna E.S., Ilina E.N., Lobzin Y.V., Shlyapnikov S.A., Sidorenko S.V. Emergence of carbapenemase-producing Gram-negative bacteria in Saint Petersburg, Russia. Int. J. Antimicrob. Agents. 2014; 44(2): 152-5.
11. Rodrigo-Troyano A., Sibila O. The respiratory threat posed by multidrug resistant Gram-negative bacteria. Respirology. 2017; 22: 1288-99.
12. Avdoshin V.P., Makarov O.V., Kirichek A.A. Photorhabdus asymbiotica is a new representative of gram-negative microflora in urinary tract infections. Bulleten'Rossiyskogo UniversitetaDruzhby narodov. Seriya :Meditsina. 2013; 4: 94-9. (in Russian)
13. Costa S.C., Chavez C.V., Jubelin G. et al. Recent insight into the pathogenicity mechanisms of the emergent pathogen Photorhabdus asymbiotica. Journal Microbes andlnfection. 2010; 12: 182-9.
14. Gerrard J., Waterfield N., Vohra R. et. al. Human infection with Photorhabdus asymbiotica: an emerging bacterial pathogen. Journal Microbes and Infection. 2004; 6: 229-37.
15. Gerrard J.G., McNevin S., Alfredson D. et al. Photorhabdus species: bioluminescent bacteria as1emerging human pathogens? Journal Emerging Infectious Diseases. 2003; 9: 251-4.
16. Peel M.M., Alfredson D.A., Gerrard J.G. et al. Isolation, identification, and molecular characterization of strains of Photorhabdus luminescens from infected humans in Australia. Journal of Clinical Microbiology. 1999; 37: 3647-53.
17. Weissfeld A.S., Halliday R.J., Simmons D.E. et al. Photorhabdus asymbiotica, a pathogen emerging on two continents that proves that there is no substitute for a well-trained clinical microbiologist. Journal of Clinical Microbiology. 2005; 43(8): 4152-55.
18. Kirsheva N.A., Ganina E.A., Kombarova T.I., SHajhutdinova R.Z., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. Infectious sensitivity of BALB / c mice to infection with Photorhabdus asymbiotica and Photorhabdus temperate. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; 3(113): 64-6. (in Russian)
Поступила 25.04.19 Принята к печати 30.04.19
