Чувствительность нозокомиальных штаммов K. pneumoniae, p. aeruginosa, A. baumannii и p. mirabilis к антисептику на основе хлоргексидина Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Чувствительность нозокомиальных штаммов K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii и P. mirabilis к антисептику на основе хлоргексидина

Е. В. Детушева1, В. Б. Родин1, П. В. Слукин1, О. Н. Ершова2, И. А. Александрова2, Н. В. Курдюмова2, С. Ю. Сазыкина 2, И. А. Дятлов1, Н. К. Фурсова1

1ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Оболенск, Россия 2ФГБУ «НИИ нейрохирургии им. акад. Н. Н. Бурденко» РАМН, Москва, Россия

Изучено действие антисептика «Дезин», препарата на основе хлоргексидина (ХГ), на изоляты возбудителей госпитальных инфекций дыхательной системы (ДС): и мочевыделительнойсистемы (МС) Klebsiella pneumoniae (n=8), Pseudomonas aeruginosa (n=3), Acinetobacter baumannii (n=4) и Proteus mirabilis (n=3), выделенных в отделении нейрореанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) г. Москвы в 2013 г., а также на референс-штаммы K. pneumoniae (n=1), P. aeruginosa (n=1), Escherichia coli (n=1) и Staphylococcus aureus (n=1). Антибактериальную активность антисептика оценивали по степени ингибирования размножения культур бактерий, находящихся в планктонной форме (микрокапля) и в форме, приближенной к протобиопленке (на целлюлозном аппликаторе). По степени чувствительности планктонных клеток к ХГ, выраженной в среднем значении минимальной бактерицидной концентрации (МБКХГ), исследуемые культуры распределились в следующем порядке в сторону

увеличения: P. mirabilis (0,025%), P. aeruginosa (0,009%), K. pneumoniae (0,006%), A. baumannii (0,006%), E. coli (0,005%) и S. aureus (0,005%). Чувствительность к ХГ ассоциаций клеток данных штаммов на аппликаторах оказалась значительно меньше: в 23 раза для P. aeruginosa (МБКХГ — 0,2%), в 28 раз для A. baumannii(МБКХГ — 0,16%), в 48 раз для K. pneumoniae (МБКХГ — 0,3%), в 50 раз для P. mirabilis (МБКХГ — 1,3%), в 128 раз для E. coli (МБКХГ — 0,6%) и в 255 раз для S. aureus (МБКХГ — 1,3%). На основе полученных данных для защиты кожи и слизистых пациентов нейрохирургического ОРИТ, в целях профилактики госпитальных инфекций ДС и МС, может быть рекомендовано использование 1,5% раствора хлоргексидина.

Ключевые слова: хлоргексидин, антисептик, нозокомиальные штаммы, устойчивость; инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), планктонные бактерии, биопленки.

Контактный адрес:

Елена Владимировна Детушева

Эл. почта: [email protected]

Susceptibility of Nosocomial K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii, and P. mirabilis Strains to a Chlorhexidine-Based Antiseptic Preparation

E. V. Detusheva1, V. B. Rodin1, P. V. Slukin1, O. N. Ershova2, I. A. Aleksandrova2, N. V. Kurdyumova2, S. Yu. Sazykina2, I. A. Dyatlov1, N. K. Fursova1

1 State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russia

2 Research Institute of Neurosurgery named after N.N. Burdenko, Moscow, Russia

This study was performed to investigate activity of chlorhexidine-based antiseptic preparation «Dezin» against the following pathogens causing nosocomial respiratory tract infections (RTI) and urinary tract infections (UTI): Klebsiella pneumoniae (n=8), Pseudomonas aeruginosa (n=3), Acinetobacter baumannii (n=4) and Proteus mirabilis (n=3) isolated from patients in neurosurgery ICU in 2013, as well as reference strains of K. pneumoniae (n=1), P. aeruginosa (n=1), Escherichia coli (n=1), and Staphylococcus aureus (n=1). Antimicrobial activity of the antiseptic preparation was evaluated by microbial growth inhibition in planktonic state (microdrop) and pro-tobiofilm-like state (cellulose patch). Distribution of tested strains by susceptibility of planktonic cells to chlorhexi-dine (expressed in minimal bactericidal concentration [MBC]) was the following (in order of increasing suscep-

tibility): P. mirabilis (0.025%), P. aeruginosa (0.009%), K. pneumoniae (0.006%), A. baumannii (0.006%), E. coli (0.005%) u S. aureus (0.005%). Susceptibility of biofilm-like associations (on the surface of cellulose patches) to Chlorhexidine was significantly decreased: 23 times in P. aeruginosa (MBC - 0.2%), 28 times in A. baumannii (MBC — 0.16%), 48 times in K. pneumoniae (MBC -0.3%), 50 times in P. mirabilis (MBC — 1.3%), 128 times in E. coli (MBC — 0.6%), and 255 times in S. aureus (MBC — 1.3%). Based on the results, 1.5% chlorhexidine solution may be recommended as a measure to prevent nosocomial RTIs and UTIs in neurosurgery ICU patients.

Key words: chlorhexidine, nosocomial, resistance, healthcare-associated infections, planktonic bacteria, biofilm.

Введение

Качество оказания медицинской помощи на современном этапе развития здравоохранения постоянно возрастает, увеличивается спектр диагностических и лечебно-профилактических манипуляций, внедряются новые технологии сохранения здоровья людей, но, несмотря на это, риски, связанные с возникновением нозокомиальных инфекций в организациях здравоохранения, увеличиваются. По данным ВОЗ, во всем мире в любой отдельно взятый момент свыше 1,4 млн человек страдают от инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП). При этом от 5 до 10% пациентов, поступающих в стационары, получают одну или большее число инфекций [1]. ИСМП представляют серьезную проблему общественного здравоохранения в силу своей распространенности, отрицательного влияния на показатели заболеваемости, смертности и степени тяжести состояния пациентов, а также опасности для медицинских работников и значительного экономического ущерба. Такие инфекции являются мировой проблемой, затрагивая все страны вне зависимости от степени их развития [2].

Краеугольным камнем сдерживания распространения ИСМП является использование дезинфицирующих и антисептических средств для деконта-минации объектов окружающей среды (помещений,

инструментария) в близком окружении пациента, а также для защиты кожных покровов и слизистых оболочек больных, уход за которыми осуществляют медицинские работники. Успех профилактики в значительной степени зависит от оптимального выбора антисептика [3]. В настоящее время в клинической практике, как правило, не проводится предварительных испытаний, связанных с определением чувствительности возбудителей ИМСП к применяемым антисептикам, а выбор препарата проводится на основании данных о природной (естественной) чувствительности выделенного или предполагаемого возбудителя, без учёта его возможной приобретённой устойчивости [4]. Ранее подобная тактика практического здравоохранения была оправданной, поскольку частота встречаемости устойчивых к антисептикам вариантов микроорганизмов была низкой. В 1980-1990 гг. положение изменилось: в научной литературе появились многочисленные публикации о выделении устойчивых к антисептикам вариантов бактерий от больных с различными нозологическими формами гнойно-септических заболеваний, а также из объектов больничной среды, в том числе — из рабочих растворов антисептиков [5-7], о снижении в ряде случаев эффективности антисептиков, вплоть до полного ее отсутствия [8, 9]. Кроме того, показано, что неу-

Рис. 1. Структурная формула хлоргексидина (http://dxdy.ru/topic25394-15.html).

дачи при использовании антисептиков для гигиены кожи и слизистых оболочек пациентов ОРИТ могут быть связаны с неадекватным тестированием активности препаратов: оценку антимикробного действия антисептиков традиционно проводят на бульонных культурах возбудителей, в то время как на практике патогены чаще всего находятся в составе биопленок — на поверхностях различных инвазивных устройств, обеспечивающих протезирование различных функций организма у критически больных пациентов — катетеров, дренажей и т. д. [10-13].

Одним из широко используемых в ОРИТ антисептиков является хлоргексидин (ХГ). С точки зрения химической структуры ХГ представляет собой амфипатическую молекулу с гидрофильными и гидрофобными группами, находящуюся в состоянии катиона при физиологических значениях рН. Молекула ХГ состоит из двух симметричных хлор-феноловых колец (4-хлорофенил) и двух бигуани-довых групп, объединённых в центре гидрофобной гексаметиленовой цепочкой, являясь симметричной молекулой — 1,6-ди-4-хлорофенил-дигуанидо-гексаном (рис. 1) [14, 15]. Как правило, ХГ используется в виде солей, главным образом — диацетата, биглюконата или дигидрохлорида [16]. Механизм антимикробного действия ХГ заключается в повышении проницаемости клеточной мембраны [17]. Он быстро адсорбируется на микробной стенке [18] благодаря наличию двух основных и симметричных групп хлорфенилгуанида, прикреплённых к липо-фильной цепочке гексаметилена, которые образуют бикатионную молекулу [19]. При этом происходит утечка из клетки ионов калия, фосфат-ионов и протонов;тормозятся дыхательные процессы,

изменяется осмотическая активность клеточных ферментов [20]. ХГ в низких концентрациях является бактериостатическим агентом, при удалении его из окружающей среды функции клетки восстанавливаются [17, 21]. При более высоких концентрациях ХГ является бактерицидным веществом: вызывает кристаллизацию клеточной мембраны, потерю её структурной целостности, катастрофическую потерю внутриклеточного вещества и гибель клетки [22].

Хлоргексидин является препаратом достаточно широкого спектра действия: при разных концентрациях активен против грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, а также имеет некоторую активность в отношении липид-ных оболочек вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусы герпеса сероти-пов 1 и 2, вирус гриппа серотипа А [23, 24], но не действует на кислотоустойчивые бактерии [18, 25]. Одним из преимуществ ХГ является возможность его пролонгированного действия благодаря способности связываться с различными биологическими субстратами, а затем медленно высвобождаться в окружающую среду при сохранении антибактериальной активности. Достаточно эффективно ХГ используется в стоматологии: 0,1-0,2% раствор для обработки полости рта, 2% раствор или гель — для обработки зубных каналов перед пломбированием, несмотря на то, что 2% раствор этого препарата может вызывать раздражение кожи [26]. В то же время, использование 0,1% раствора хлоргексидина для обработки полости рта в целях профилактики нозокомиальной пневмонии у пациентов неврологических (сосудистых) отделений стационаров г. Смоленска, не выявило статистически достоверных отличий от групп сравнения в длительности госпитализации, частоте развития нозокомиальной пневмонии и уровне летальности [27]. Аналогично этому использование 0,5% раствора хлоргексиди-на для профилактики бактериальной колонизации трахеи у пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, не позволило выявить существенных различий с группой сравнения, в которой антисептик не применялся [28].

Использование биоцидов в медицинской практике, товарах личной гигиены и потребительских товарах может оказывать влияние на формирование устойчивости микроорганизмов как к биоцидам, так и к антибиотикам, поскольку определяется общими механизмами: изменением проницаемости клеточной стенки [29], активацией эффлюксных насосов [30] и др. В ряде исследований такие факты описаны для хлоргексидина [31, 32]. Установлено, что биоцидные препараты, при их использовании

в заниженных концентрациях, индуцируют бактериальные механизмы резистентности, связанные с модификацией проницаемости клеточной стенки (порины) и с активацией эффлюксных насосов [8, 33]. Запуск названных механизмов является реакцией микроорганизмов на стрессовое воздействие биоцидных препаратов [34, 35]. Для ряда микроорганизмов (E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus и Streptococcus agalactiae) показано, что использование ХГ в сублетальных для них концентрациях (0,182, 0,177, 0,2 и 0,2 мг/л соответственно) ингибирует рост планктонных клеток, но индуцирует рост биопленок данных видов бактерий [34, 36]. При этом показатель МПК биоцида для планктонных клеток был в четыре раза ниже, чем для биопленок. С другой стороны, в ряде исследований показано, что существенных различий в МПК дезинфектантов для клеток и биопленок, культивируемых при сублетальных концентрациях ХГ, нет, поэтому использование завышенных концентраций данного антисептика нецелесообразно [34].

Целью нашего исследования явилось сравнение эффективности действия монокомпонентного антисептика «Дезин» — коммерческого препарата, содержащего ХГ в концентрации 20%, на лабораторные и клинические штаммы Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus. Клинические изоляты бактерий были выделены от пациентов отделения нейрореанимации в 2013 г. и охарактеризованы как патогены с высоким уровнем устойчивости к большинству используемых в терапии антибактериальных препаратов разных функциональных групп: бета-лактамам (цефалоспоринам, карбапенемам), аминогликози-дам, хинолонам, сульфаниламидам. В данной работе проведено сравнение чувствительности бактерий к ХГ в условиях, моделирующих планктонное состояние клеток (бульонная культура) и состояние протобиопленки (агаровая культура).

Материал и методы

Штаммы микроорганизмов. В работе использованы штаммы K. pneumoniae (n=8), P. aeruginosa (n=4), A. baumannii (n=4) и P. mirabilis (n=3), выделенные от пациентов отделения нейрореанимации в 2013 г. [37, 38], а также референс-штаммы, рекомендованные ФБУН «Научно-исследовательский институт дезинфектологии» Роспотребнадзора для оценки активности дезинфектантов и антисептиков [39, 40], полученные из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск»: K. pneumoniae ATCC 700603, E. coli ATCC 25922, S. aureus АТСС 25923 и P. aeruginosa ATCC 27853.

Питательные среды. Для культивирования микроорганизмов использовали агар и бульон Мюллера-Хинтон (Himedia, Индия) и среду ГРМ (Оболенск, Россия).

Препарат антисептика. В качестве тестируемого антисептического препарата использовали антисептик «Дезин» (ООО «Дезиндустрия», Россия), представляющий собой 20% водный раствор хлор-гексидина.

Антибактериальную активность антисептика

определяли тремя методами.

Метод серийных разведений в бульоне (МУК 4.2.1890-04) [39]: пробирки, содержащие 4 мл питательного бульона и двукратные разведения в диапазоне 0,00005-0,250% ХГ, засевали 0,02 мл бактериальной культуры в концентрации 107 КОЕ/мл, инкубировали при температуре 37 °С. Наличие бактериального роста учитывали визуально по наличию мутности в пробирке. За минимальную подавляющую концентрацию (МПК) принимали минимальную концентрацию препарата, при которой рост отсутствовал через 24 ч инкубации, за минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) — через 72 ч.

Метод серийных разведений на агаре (микрокаплями): на поверхность питательного агара, содержащего серийные разведения в диапазоне 0,0002-1,25% ХГ, наносили 10 мкл бактериальной суспензии в концентрации 107-108 КОЕ/мл. Результаты учитывали по наличию роста культуры в месте нанесения микрокапли через 24 ч (МПК) и через 72 ч (МБК) инкубирования при температуре 37 °С.

Метод аппликаторов: поверхность питательного агара, не содержащего ХГ, засевали 0,1 мл суспензии исследуемой тест-культуры в концентрации 109 КОЕ/мл. Посевы культивировали при температуре 37 °С в течение 24 ч, после чего на поверхность бактериального газона накладывали при помощи стерильного пинцета стерильный целлюлозный аппликатор (7x7 мм) на 2-3 мин. Затем аппликатор с отпечатком культуры переносили стерильным пинцетом в другую чашку Петри и помещали на поверхность агара, содержащего серийные разведения (0,0002-1,25%) ХГ, в ориентации «вниз бактериальным отпечатком». Результаты учитывали по наличию роста тест-культуры на аппликаторе и вокруг него через 72 ч инкубирования при температуре 37 °С. За МБК принимали минимальную концентрацию антисептика, на которой отсутствовал рост культуры. МПК не определяли, поскольку через 24 ч культивирования на поверхности аппликатора наблюдался «инерциальный» рост тест-культуры.

Чувствительность штаммов бактерий к хлоргексидину, определенная методами серийных разведений в питательном бульоне (I), серийных разведений на агаре (II), и на аппликаторах (III)

Штамм

Год выде-

Источник

Устойчивость к антибактериальным

Kонцентрация антисептика ХГ, %

I

II

III

ления препаратам МПK МБK МПK МБK МПK МБK

K. pneumoniae B-1814 2013 Моча AMC AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP GEN NIT THRTOB 0,0008 0,0031 0,0063 0,0063 0,05 0,1563

K. pneumoniae B-1802 2013 Моча AMC 0,0008 0,0016 0,0008 0,0008 0,05 0,1563

K. pneumoniae B-1739 2013 Моча AMC AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP GEN NIT THRTOB 0,0031 0,0031 0,0063 0,0063 0,05 0,1563

K. pneumoniae B-1759 2013 Моча AMC AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP GEN NIT TET THR TOB 0,0016 0,0063 0,0063 0,0063 0,0063 0,625

K. pneumoniae B-1104 2013 Эндотрахе- альный аспират AMC AMI AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP GEN NIT TET THR TOB 0,0002 0,0004 0,0063 0,0063 0,0125 0,1563

K. pneumoniae B-335 2013 Моча AMC AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP NIT TET TGCTHR 0,0004 0,0016 0,0063 0,0063 0,0125 0,3125

K. pneumoniae B-1224 2013 Мокрота AMC AMI AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP GEN NIT TET THR TOB 0,0002 0,0004 0,0098 0,0098 0,1563 0,625

K. pneumoniae B-38 2013 Моча AMC AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP NIT TET THR 0,0004 0,0016 0,0063 0,0063 0,0125 0,1563

A. baumannii B-1745 2013 Эндотрахе- альный аспират AMC AMI AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP GEN NIT TET TGC THR TOB 0,0002 0,0016 0,0063 0,0063 0,0063 0,1563

A. baumannii B-1691 2013 Бронхиальный лаваж AMC AMI AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP GEN NIT THR 0,0008 0,0016 0,0031 0,0031 0,0063 0,1563

A. baumannii B-120 2013 Эндотрахе- альный аспират AMC AMI AMS CAZ CEF CEX CIP CM CPS CTA CTZ ERM FEP GEN NIT THR TOB 0,0004 0,0008 0,0031 0,0063 0,0063 0,1563

A. baumannii B-5 2013 Эндотрахе- альный аспират AMC AMI AMS CAZ CEF CEX CIP CM CTA CTZ ERM FEP GEN NIT THRTOB 0,0002 0,0016 0,0031 0,0063 0,0063 0,1563

P. mirabilis B-1901 2013 Эндотрахе- альный аспират AMC CEF CIP CM CPS CTA ERM IMI NIT TET TGC 0,0063 0,0063 0,0125 0,0125 0,025 >1,25

P. mirabilis B-123 2013 Моча AMC AMI CAZ CEF CEX CIP CM CTA CTZ ERM FEP GEN IMI NIT TET THRTOB 0,0063 0,0125 0,0125 0,0125 0,025 >1,25

P. mirabilis 2013 Операци- AMC AMI AMS CAZ 0,0125 0,025 0,05 0,05 0,0125 1,25 В-318 онная рана CEF CEX CIP CM CPS

CTA CTZ ERM FEP GEN IMI NIT TET TGC THR TOB

P. aeruginosa 2013 Эндотрахе- CAZ CIP CTZ ERM FEP 0,0016 0,0063 0,0063 0,0063 0,0063 0,1563 В-1560 альный GEN IMI IZE MER NIT

аспират PEF PIP PIT TCA TCC TET TGC THR TOB

P. aeruginosa 2013 Эндотрахе- AMI CAZ CIP CTZ ERM 0,0008 0,0016 0,0008 0,0031 0,0063 0,3125 В-431 альный FEP GEN IMI IZE MER

аспират NIT PEF PIP PIT TCA

TCC TET TGC THR TOB

P. aeruginosa 2013 ^hkbop AMI CAZ CIP CTZ ERM 0,0008 0,0016 0,0008 0,0063 0,0031 0,025 B-2249 FEP GEN IMI IZE MER

NIT PEF PIP TCA TCC TET TGC THR TOB

P. aeruginosa 1971 Кровь ND 0,0004 0,0008 0,0195 0,0195 0,1563 0,3125

ATCC 27853

K. pneumoniae 1994 Моча ND 0,0016 0,0031 0,0063 0,0063 0,0125 0,3125 ATCC 700603_

E. coli ATCC 1946 Клини- ND 0,0002 0,0002 0,0049 0,0049 0,6250 0,625

25922 ческий

изолят

S. aureus 1945 Клини- ND 0,0002 0,0002 0,0049 0,0049 0,6250 1,25

ATCC 25923 ческий

изолят

Примечание: AMC — амоксициллин/клавулановая кислота; AMI — амикацин; AMS — амоксициллин/сульбактам; CAZ — цефтазидим; CEF — цефуроксим; CEX — цефокситин; CIP — ципрофлоксацин; CM — хлорамфеникол; CTX — цефотаксим; CPS — цефоперазон/сульбактам; CPZ — цефоперазон; CTA — цефтриаксон; CTZ — ко-тримоксазол; ERM -эртапенем; FEP — цефепим; GEN — гентамицин; IMI — имипенем; IZE — изепамицин; NIT — нитрофурантоин; PEF — пефлоксацин; PIT — пиперациллин/тазобактам; PIP — пиперациллин; TET — тетрациклин; TGC — тигециклин; THR — триметоприм; TOB — тобрамицин; ND — нет данных

Результаты и обсуждение_

ИСМП связаны с особенностями лечебно-диагностического процесса. В каждой группе пациентов складываются свои уникальные характеристики эпидемического процесса ИСМП. Это относится к этиологии заболеваний, их превалирующим нозологическим формам, факторам повышенного риска инфицирования. Подавляющее большинство этих инфекций (до 80%) [41, 42] имеют эндогенное происхождение, т. е. микроорганизм-возбудитель, входящий в микробное сообщество кожи, слизистых и кишечника, в результате формирования искусственных входных ворот при медицинских вмешательствах может быть перемещен в другой локус и/или во внутренние стерильные среды организма, что приводит к развитию инфекционного процесса. Наиболее часто среди возбудителей ИСМП обнаруживают микроорганизмы, способные формировать резистентность к основным классам антимикробных препаратов. Соотношение их меняется в зависимости от многих факторов, в том

числе — сезонности, возможного проникновения в экосистему новых генетических линий патогенов, горизонтального переноса факторов резистентности и т. д. В связи с этим рутинная защита кожи и слизистых критически больных пациентов является важным гигиеническим стандартом в уходе за такими пациентами и существенно снижает число случаев ИСМП.

Применение антисептических препаратов для подавления избыточного бактериального роста на коже и слизистых пациентов в ОРИТ может оказаться недостаточно эффективным по ряду причин. Важно отметить, что при разработке рекомендаций для применения антисептиков лабораторную оценку их антимикробной активности традиционно проводят, используя бульонные культуры патогенов, в то время как в реальной клинической практике эти патогены чаще всего находятся в состоянии биопленок, которые, как известно, значительно более устойчивы ко многим воздействиям.

Анализ нозокомиальных изолятов, выделенных

в отделении нейрореанимации г. Москвы в 2013 г., показывает, что доля K. pneumoniae в этиологической структуре заболеваемости ДС и МС составляет около 17 и 45% соответственно; они проявляют устойчивость ко многим из применяемых для лечения пациентов антимикробным препаратам (АМП), в том числе к цефалоспоринам (100% изо-лятов), цефоперазону/сульбактаму (75%), карбапе-немам (56%), тигециклину (14%), аминогликози-дам (64%), сульфаниламидам (81%), фторхиноло-нам (89%), нитрофуранам (96%).

A. baumannii также является актуальным этиологическим агентом инфекций ДС и МС у пациентов отделения нейрореанимации (до 20 и до 5% от общего количества изолятов соответственно) и демонстрирует высокий уровень устойчивости к применяемым АМП: цефалоспоринам (100% изо-лятов), цефоперазону/сульбактаму (75%), карбапе-немам (100%), тигециклину (3%), аминогликози-дам (98%), сульфаниламидам (93%), фторхиноло-нам (100%) и нитрофуранам (100%).

P. aeruginosa как этиологический агент инфекций ДС и МС (до 10 и 11% от общего количества изолятов соответственно) характеризуется устойчивостью к цефалоспоринам (75% изолятов), защищенным цефалоспоринам (50%), карбапенемам (100%), аминогликозидам (75%), сульфаниламидам (100%) и фторхинолонам (75%).

Клинические изоляты P. mirabilis, выделенные от больных с инфекциями ДС и МС (до 4 и 17% от общего количества изолятов соответственно), также являются высокорезистентными к цефало-споринам (90% изолятов), карбапенемам (100%), тигециклину (84%), аминогликозидам (62%), сульфаниламидам (71%), фторхинолонам (75%) и нитрофуранам (100%).

На первом этапе работы была проведена предварительная оценка диапазонов МПКХГ и МБКХГ для исследуемых культур методом серийных разведений в питательном бульоне. По степени чувствительности (в сторону увеличения) к препарату антисептика исследуемые культуры распределились в следующем порядке: P. mirabilis, P. aeruginosa, K. pneumoniae, A. baumannii, E. coli и S. aureus (таблица).

На следующем этапе антибактериальную активность ХГ оценивали по степени подавления размножения тест-культур бактерий в планктонной форме (в микрокапле) и в форме, приближенной к протобиопленке (на аппликаторе). Проведенные эксперименты показали, что МБКХГ для клинических изолятов K. pneumoniae в планктонной форме составила в среднем 0,006%, а на поверхности аппликатора — 0,3%. Соответствующие показатели

0,2

№

nS»

е-

GО1'

J*

Рис. 2. МБК хлоргексидина для планктонных клеток в микрокапле (МК) и клеток в составе протобиопленки на аппликаторе (АП)

для изолятов A. baumannii составили 0,006 и 0,16%; для P. aeruginosa — 0,009 и 0,2%; для P. mirabilis — 0,03 и более 1,25%. Значения МБКХГ для рефе-ренс-штаммов составили: для P. aeruginosa ATCC 27853-0,02 и 0,3%, для K. pneumoniae ATCC 700603 — 0,006 и 0,3%, для E. coli ATCC 25922 - 0,005 и 0,6%, для S. aureus ATCC 25923 - 0,005 и 1,3% (см. таблицу). Средние значения МБКХГ для ассоциаций клеток, иммобилизованных на аппликаторах, значительно выше, чем таковые для планктонных клеток P. aeruginosa (в 23 раза), A. baumannii (в 28 раз), K. pneumoniae (в 48 раз), P. mirabilis (в 50 раз), E. coli (в 128 раз) и S. aureus (в 255 раз) (рис. 2).

Стоит отметить, что при использовании метода аппликаторов при низких концентрациях ХГ в питательном агаре (0,0002-0,0004%) наблюдали рост бактериальной тест-культуры не только на поверхности аппликатора, но и вокруг него (рис. 3), а при высоких концентрациях — только на поверхности аппликатора. Последнее, на наш взгляд, может быть объяснено наличием «инерционного» роста

0

Опыт работы

64 Е В. Детушева и соавт. Чувствительность возбудителей нозокомиальных инфекций к хлоргексидину

в персистентное состояние [13], свойственное для хронических форм инфекции [44] и т. п.

Полученные нами данные по разной степени чувствительности к ХГ у планктонных клеток бактерий и клеток в составе биопленки позволяют объяснить причину неэффективности клинического использования 0,1% и 0,5% растворов хлоргекси-дина в ряде исследований [27, 28]. Таким образом, представляется целесообразным использование более высоких концентраций данного антисептика, а именно 1,5% раствора.

Заключение

Изучена чувствительность к антисептику хлор-гексидину у нозокомиальных изолятов актуальных в настоящее время бактериальных патогенов (n=18) и референс-штаммов (n=4). В работе использованы бактериальные изоляты, выделенные в отделении нейрореанимации г. Москвы в 2013 г. и охарактеризованные с точки зрения устойчивости к широкому кругу антибактериальных препаратов. По степени чувствительности планктонных клеток исследуемых культур к препарату ХГ, выраженной в среднем значении МБКХГ, распределились в следующем порядке в сторону увеличения: P. mirabilis (0,025%), P. aeruginosa (0,009%), K. pneumoniae (0,006%), A. baumannii (0,006%), E. coli (0,005%) и S. aureus (0,005%). Устойчивость к ХГ клеток данных штаммов, иммобилизованных на аппликаторах, оказалась значительно выше: в 23 раза для P. aeruginosa (0,2%), в 28 раз для A. baumannii (0,16%), в 48 раз для K. pneumoniae (0,3%), в 50 раз для P. mirabilis (1,3%), в 128 раз для E. coli (0,6%) и в 255 раз для S. aureus (1,3%).

На основе полученных данных, для защиты кожи и слизистых пациентов отделения нейрореа-нимации от избыточной бактериальной колонизации, в целях профилактики инфекций ДС и МС, может быть рекомендовано использование 1,5% раствора хлоргексидина.

Финансирование работ. Данное исследование выполнено в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 20112015 гг.), утвержденной руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 21 декабря 2010 г.

ГЖ

Аппликаторы

% é

Аппликаторы

Микрокапли

Рис. 3. А — характер роста культур K. pneumoniae АТСС 700603 (1), K. pneumoniae 1224 (2), S. aureus 906 (3), P. aeruginosa ATCC 27853 (4), E. coli АТСС 25922 (5) на питательной среде Мюллера-Хинтон, содержащей 0,02% ХГ, на аппликаторах и в микрокаплях; Б — отсутствие роста тех же культур на питательной среде Мюллера-Хинтон, содержащей 1,0% ХГ.

тест-культуры вследствие замедленной диффузии препарата через аппликатор с отпечатком культуры. К моменту учета МБК (72 ч культивирования) «инерционный» рост прекращался и культура погибала, что подтверждалось отсутствием роста культуры при пересеве клеток с поверхности аппликатора на питательную среду, не содержащую ХГ.

Таким образом, планктонные клетки нозоко-миальных штаммов K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii и P. mirabilis оказались существенно чувствительнее к ХГ, чем бактериальные клетки в форме, приближенной к протобиопленке (иммобилизованные на аппликаторе). Увеличение резистентности к ХГ у бактерий, иммобилизованных на аппликаторе, по нашему мнению, может быть объяснено влиянием факторов, описанных в литературе для бактериальных биопленок: наличием защитного полисахаридного матрикса вокруг скопления клеток, значительными изменениями в экспрессии генов и метаболической активности [43-45] с последующим существенным повышением «выживаемости» бактерий и их устойчивости к антибактериальным препаратам [2, 43], переходом части клеток

Литература

1. Программа ВОЗ по обеспечению безопасности пациентов. Всемирный альянс за безопасность пациентов. Глобальная задача по обеспечению безопасности пациентов. Чистая помощь — безопасная помощь. ВОЗ, Женева, 2006.

2. Основные компоненты для программ профилактики инфекций и инфекционного контроля. Второе совещание неформальной сети по профилактике инфекций и инфекционному контролю в здравоохранении. Женева, Швейцария, 26-27 июня 2008 г.

3. Гудкова Е. И., Адарченко А. А., Ласточкина Т. М., Симоненко Л. И., Слабко И. Н. Чувствительность к новым дезинфектантам клинических штаммов микробов, методы определения. Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 80-летию Башкирского Государственного Медицинского Университета «Актуальные проблемы современной медицины» Под ред. С. Л. Кабака. Минск БГМУ 2001; 1:89-91.

4. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 4.0;2014;http://www. eucast.org

5. Gajadhar T., Lara A., Sealy P., Adesiyun A. A. Microbial contamination of disinfectants and antiseptics in four major hospitals in Trinidad. Rev Panam Salud Publica 2003; 14(3):193-200.

6. O'Rourke E., Runyan D., O'Leary J. Contaminated iodophor in the operating room. Am J Infect Control 2003; 31:255-6.

7. Weber D.J., Rutala W. A., Sickbert-Bennett E. E. Outbreaks associated with contaminated antiseptics and disinfectants. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51(12):4217-24.

8. Красильников А. П. Справочник по антисептике. Минск: Высш. шк. 1995.

9. Weuffen W. Handbuch der Antiseptik. In 3 Bd; Berlin: Veb. Verlag Volk und Gesundheit 1984-1987.

10. Aparna M. S., Yadav S. Biofilms: microbes and disease. Braz J Infect Dis 2008; 12(6):526-30.

11. Costerton J. W., Stewart P. S., Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 1999; 284(5418):1318-22.

12. Krzysciak W., Jurczak A., Koscielniak D., Bystrowska B, Skalniak A. The virulence of Streptococcus mutans and the ability to form biofilms. Clin Microbiol Infect Dis 2014; 33(4):499-515.

13. Patel R. Biofilms and antimicrobial resistance. Clin Orthop Relat Res 2005; (437):41-7.

14. Al-Tannir M.A., Goodman H. S. A review of clorhexidine and its use in special populations. Special Care in Dentistry 1994; 14:116-22.

15. Gilbert P., Moore L. E. Cationic antiseptics: diversity of action under a common epithet. J App Microbiol 2005; 99:703-15.

16. Ruppert M., Schlagenhauf U. La clorhexidina en Odontología. Aspectos generales. Quintessence (Ed. Española) 2005; 18:12-23.

17. Hugo W. B. Disinfection mechanisms. In: Russell A. D., Hugo W. B., Ayliffe G. A.J., eds. Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization. Oxford: Blackwell 1992:187-210.

18. Albertos J. M., Junquera L. M., Albertos M. T., Olay S., López-Arranz E. La clorhexidina. Perspectiva actual. En Odontoestomatología 1996; 5:217-23.

19. Musteata F. M., Pawliszyn J. Assay of stability, free and total concentration of chlorhexidine in saliva by solid phase microextraction. J Pharm Biomedical Analysis 2005; 37:1015-24.

20. Hugo W. B., Longworth A. R. The effect of chlorhexidine on the electrophoretic mobility, cytoplasmic constituents, dehydrogenase activity and cell walls of Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J Pharma Pharmacol 1966; 18:569-78.

21. Fardal O., Turnbull R. S. A review of the literature on use of chlorhexidine in dentistry. J American Dental Association 1986; 112:863-9.

22. Longworth A. R. Chlorhexidine. In: Hugo W. B., ed. Inhibition and destruction of the bacterial cell. New York, N.Y: Academic Press 1971:95-106.

23. Arévalo J. M., Arribas J. L., Calbo L., Hernández M.J., Lizán M., Herruzco R. Guía del grupo de trabajo sobre desinfectantes y antisépticos. Revisión 1998. Medicina Preventiva 1998; 4:38-43.

24. Bernimoulin J. P. Recent concepts in plaque formation. J Clin Periodontology 2003; 30:7-9.

25. Junco-Lafuente M.P, Baca-García P., Mesa-Aguado F. L. Utilización de la clorhexidina en la prevención oral de pacientes de la tercera edad. Revista del Ilustre Consejo General de Colegios de Odontólogos y Estomatólogos de España 2001; 6:81-9.

26. Rahimi S., Janani M., Lotfi M., et al. A review of antibacterial agents in endodontic treatment. Iran Endod J. 2014; 9(3):161-8.

27. Зверьков А. В., Зузова А. П. Актуальность обработки полости рта 0,1% раствором хлоргексидина и очищенной водой для профилактики нозокомиальной пневмонии у больных с острым нарушением мозгового кровообращения. Тезисы XVI Международного конгресса МАКМАХ по антимикробной терапии; 21-23 мая 2014 г.; Москва, Россия. КМАХ 2014; 16(2):20.

28. Bosca I. D., Berar C., Anton F. et al. The impact of 0.5% chlorhexidine oral decontamination on the prevalence of colonization and respiratory tract infection in mechanically ventilated patients. Preliminary study. Pneumologia 2013; 62(4):217-22.

29. Tattawasart U., Maillard J. Y., Furr J. R., Russell A. D. Development of resistance to chlorhexidine diacetate and cetylpyridinium chloride in Pseudomonas stutzeri and changes in antibiotic susceptibility. J Hosp. Infect. 1999 Jul; 42(3):219-29.

30. Randall L. P., Cooles S. W., Coldham N. G., et al. Commonly used farm disinfectants can select for mutant Salmonella enterica serovar Typhimurium with decreased susceptibility to biocides and antibiotics without compromising virulence. J Antimicrob Chemother 2007; 60:1273-80.

31. Russell A. D., Tattawasart U., Maillard J-Y., Furr J. R. Possible link between bacterial resistance and use of antibiotics and biocides. Antimicrob Agents Chemother, 1998; 42:2151.

32. Koljalg S., Naaber P., Mikelsaar M. Antibiotic resistance as an indicator of bacterial chlorhexidine susceptibility. J Hosp Infect 2002; 51:106-13.

33. Mah T. F., O'Toole G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol 2001; 9 (1):34-9.

34. Ebrahimi A., Hemati M., Habibian D. S. et al. Chlorhexi-dine digluconate effects on planktonic growth and biofilm formation in some field isolates of animal bacterial pathogens. Jundishapur J Nat Pharm Prod 2014; 9(2):e14298.

35. Wright N. E., Gilbert P. Influence of specific growth rate and nutrient limitation upon the sensitivity of Escherichia coli towards chlorhexidine diacetate. J Appl Bacteriol 1987; 62(4):309-14.

36. Houari A., Di Martino P. Effect of chlorhexidine and benzalkonium chloride on bacterial biofilm formation. Lett Appl Microbiol 2007; 45(6):652-6.

37. Асташкин Е. И., Карцев Н. Н., Пачкунов Д. М. и соавт. Характеристика клинических штаммов Acinetobacter baumannii. Тезисы XV Международного конгресса МАКМАХ по антимикробной терапии 22-24 мая 2013 г., Москва, Россия. КМАХ 2013; 15(2):46.

38. Карцев Н. Н., Асташкин Е. И., Пачкунов Д. М. и соавт. Экстремально лекарственно-устойчивые клинические изоляты Klebsiella pneumoniae и Proteus mirabilis. Тезисы XV Международного конгресса МАКМАХ по

антимикробной терапии 22-24 мая 2013 г.;Москва, Россия КМАХ 2013; 15(2):46.

39. Методические указания МУК 4.2.1890-04 от 4.03.2014 г. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.)

40. Руководство 4.2.2643-10. 3.5. Дезинфектология. Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности; утв. Роспотребнадзором 01.06.2010 г.

41. Kerver A. J. H., Rommes J. H., Mevissen-Verhage E. A. E., et al. Colonization and infection in surgical intensive care patients: a prospective study. Intensive Care Med 1987; 13:347-51.

42. Gastmeier P., Sohr D., Geffers C., Behnke M., Rüden H. Risk factors for death due to nosocomial infection in intensive care unit patients: findings from the Krankenhaus Infektions Surveillance System. Infect Control Hosp Epidemiol 2007; 28(4):466-72.

43. Dukan S., Touati D. Hypochlorous acid stress in Escherichia coli: resistance, DNA damage, and comparison with hydrogen peroxide stress. J Bacteriol 1996; 178:6145-50.

44. Greenway D. L.A., England R. R. The intrinsic resistance of Escherichia coli to various antimicrobial agents requires ppGpp and as. Lett Appl Microbiol 1999; 29:323-6.

45. H0iby N., Bjarnsholt T., Givskov M., Molin S., Ciofu O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents 2010; 35(4):322-32.