CC BY
32УДК: 619:616.98:579.852.11 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-6-5-11
ИСПЫТАНИЕ «НАБОРА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ВАКЦИНИРОВАННОГО ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ В РНГА» НА СООТВЕТСТВИЕ ТЕХНИЧЕСКИМ УСЛОВИЯМ
Артемьева Е.А. - кандидат ветеринарных наук, Мельникова Л.А. - кандидат ветеринарных наук, Родионов А.П.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», (420075, г. Казань, Научный городок-2, e-mail: vnivi@mail.ru)
В мире ежегодно регистрируется от 5 до 6 тысяч случаев данного заболевания, от которого погибает более миллиона животных и заболевает свыше 20 тысяч человек. Случаи проявления сибирской язвы обусловлены стационарным неблагополучием территорий по этому заболеванию. Для недопущения возникновения эпизоотий и передачи возбудителя людям, в ветеринарной практике используют специфическую профилактику данной инфекции, заключающуюся в вакцинации всего восприимчивого поголовья сельскохозяйственных животных, которая позволяет создать в организме напряженный иммунитет, и в случае попадания вирулентных форм возбудителя, сохранить жизнь и здоровье животного, в результате, чего не допусть новых случаев заражения. Оценка уровня напряженности иммунитета у животных, проводится серологическими методами [6]: имунно-ферментным анализом (ИФА), реакцией связывания комплемента (РСК), реакцией агглютинации (РА) и в частности реакцией непрямой гемагглютинации. Для постановки РНГА сотрудниками ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» предложен «Набор для определения титра антител в сыворотке крови животных, привитых против сибирской язвы в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)». Цель данной работы - провести доклиническое испытание компонентов, входящих в «Набор для определения титра антител в сыворотке крови животных, привитых против сибирской язвы в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» на соответствие разработанным техническим условиям.
Ключевые слова: реакция непрямой гемагглютинации, диагностикум, сибирская язва, неблагополучный пункт, анализ эпизоотической ситуации
Сибирская язва - особо опасное инфекционное заболевание, является зооантропонозом, проявляется массово или спорадически и регистрируется во всем мире
[8,9].
Несмотря на проводимые профилактические мероприятия против сибирской язвы, ни в одной стране мира данное заболевание не ликвидировано. Ежегодно сибирскую язву регистрируют почти в 100 странах мира у 54 видов животных. [7]. Согласно данным Международного эпизоотического бюро (МЭБ), организации объединенных наций (ООН), продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО), а также Международной организации здравоохранения (ВОЗ) ежегодно во всех странах мира регистрируется от 5 до 6 тыс. вспышек
сибирской язвы, от которой погибает более миллиона животных и заболевает свыше 20 тыс. человек.
Проведенными мониторинговыми исследованиями аналитического характера вспышек сибирской язвы установлено, что наибольшее распространение болезнь имеет в странах Азии, Африки и Америки (около 60% всех вспышек, зарегистрированных в мире). Так по данным анализа в 2019 году сибирская язва была зарегистрирована в 12 странах Африки - у крупного рогатого скота (КРС), мелкого рогатого скота (МРС), бизонов, свиней, лошадей; 6 странах Азии - у КРС, МРС, бизонов; 6 странах Америки - у КРС; 5 странах Европы - у КРС. Эпизоотии сибирской язвы среди диких животных регистрировалась в Ботсване (более 100 слонов), Зимбабве (6 слонов, 3 буйволов, львов, импалов), Индии
(слоны, олени), Кении (145 буйволов, водяной козел), Малави (48 гиппопотамов), Танзании (149 диких животных). В 2020 году заболевание регистрировали в Киргизстане, Азербай-джане, Румынии, Хорватии, Италии и Ботсване[4].
Самая крупная вспышка сибирс -кой язвы в РФ была зарегистрирована в июле 2016 года у северных оленей в Ямало -Ненецком автономном округе, где одной из основных причин явилось наличие многочисленных почвенных очагов сибирской язвы [5]. Многочисленные исследования других авторов также показали, что основным резервуаром возбудителя сибирской язвы и основным фактором, поддерживающим непрерывность эпизоотического процесса в очагах служит почва, которую можно считать вторым источником этого заболевания после инфицирования животных [2,8]. В Российской Федерации насчитывается около 35 тыс. стационарно неблаго -получных по сибирской язве пунктов с почвенными очагами. К сожалению, на многих территориях, до настоящего времени, не налажен должный учет скотомогильников и контроль за их состоянием, что создает потенциальную угрозу возникновения заболевания [3].
В современных условиях фактором возникновения сибирской язвы является народнохозяйственная деятельность человека, когда без учета эпизоотического состояния местности проводятся мелиоративные и ирригационные работы, строительство промышленных, жилых, животноводческих объектов, прокладка и строительство дорог, создание искусственных водоемов, бурение скважин и пр. [2].
В настоящее время, для недопущения возникновения эпизоотий и передачи возбудителя людям, в ветеринарной практике используют специфическую профилактику данной инфекции, заключающуюся в вакцинации всего восприимчивого поголовья сельскохозяйственных животных. Данный метод позволяет создать в организме напряженный иммунитет, который, в случае попадания вирулентных форм возбудителя, призван не допустить развития заболевания и сохранить жизнь и здоровье животному [1].
Считается, что одним из наиболее объективных способов определения напря-
женности иммунитета является инфицирование животных вирулентной культурой возбудителя сибирской язвы, что в настоящее время трудозатратно, длительно в исполнении и не пригодно для мониторинговых исследований эффективности специфической профилактики. Оценка уровня напряженности иммунитета у животных, проводится серологическими методами [6]: имунноферментным анализом (ИФА), реакцией связывания комплемента (РСК), реакцией агглютинации (РА) и в частности реакцией непрямой гемаг-глютинации. Для постановки РНГА сотрудниками ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» предложен «Набор для определения титра антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» (далее «Набор...»).
Выпуск биопрепаратов, используемых в ветеринарии для диагностики, профилактики и лечения, должен осуществляться согласно требованиям, предъявляемым при их производстве. Они должны быть: стандартными, эффективными, специфичными, безвредными, и безопасными. На наборы разрабатываются соответствующие нормативные документы. В соответствии с этим, нами разработаны технические условия и инструкция на «Набор...».
Цель работы: Провести доклиническое испытание компонентов, входящих в «Набор...», на соответствие разработанным техническим условиям (ТУ).
Материал и методы. Для проведения работы был взято по три набора из трех серий, включающих в себя: 3 флакона эритроцитарного сибиреязвенного антигена, контрольной позитивной сыворотки, контрольной негативной сыворотки (рис. 1).
Компоненты набора готовили в соответствии с Инструкцией утвержденной в установленном порядке. Качество проверяли по физико-химическим и биологическим показателям. Определение внешнего вида 3-х компонентов набора и целостность флаконов проводили визуальным осмотром внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей и трещин флаконов.
Ресуспендированность эритроци-тарного сибиреязвенного антигена определяли путем интенсивного встряхивания флакона в течение 1 минуты. Растворимость лиофилизированных негативной и
позитивной сывороток проводили путем внесения разбавителя в количестве 1см3 и встряхивания до растворения сухой массы.
Стерильность - посевом компонентов набора на питательные среды (МПА и Сабуро). Активность - постановкой РНГА в объеме 0,2 см3. Для этого во все лунки полистеролового планшета с помощью многоканальной пипетки вносят по 0,2 см3 разбавителя. Затем в первые лунки рядов одноканальной пипеткой вносят пробы
контрольных сывороток в объеме 0,2 см3 и последовательными переносами многоканальной пипеткой, получают двукратные разведения проб сывороток крови от 1: до 1:2048. В последние лунки рядов исследуемые сыворотки крови не вносят (контроль эритроцитарного антигена на самоагглютинацию). После приготовления соответствующих разведений контрольных сывороток во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 эритроцитарного антигена.
Рисунок 1 - Набор для определения титра антител в сыворотке крови животных привитых против сибирской язвы в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).
Планшет осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 12 -1,5 часа. Учет результатов проводят через 1,5 - 2 часа. Определение специфичности нпрепаратов для выявления антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы в РНГА, проводят одновременно с определением активности.
Результаты исследований. Испытание компонентов «Набора...», на соответствие требованиям настоящих ТУ, показало, что при определении их внешнего вида -
эритроцитарный сибиреязвенный антиген представляет собой прозрачную жидкость темно-коричневого цвета с осадком на дне (рис. 2). Позитивная и негативная сыворотки представляют собой сухую массу белого цвета с кремовым оттенком без посторонних примесей (рис. 3).
Целостность флаконов не нарушена.
Эритроцитарный сибиреязвенный антиген ресуспендируется при интенсивном встряхивании без образования конгломератов в течение 1 минуты (рис. 4).
Рисунок 2 - Сибиреязвенный антиген.
Рисунок 3 - Позитивная и негативная лиофилизированные сыворотки.
Рисунок 4 - Ресуспендированный сибиреязвенный антиген.
Содержимое флаконов с лиофи-лизированными позитивной и негативной сыворотками при добавлении 1 см3
полностью растворяются в течение 1-3 минут с образованием прозрачных растворов (рис. 5).
Рисунок 5 - Ресуспендированные положительная и отрицательная сыворотки.
Исследование эритроцитарного антигена на активность с позитивной сывороткой крови, дает в РНГА титр 1:2048 +++ (агглютинированные эритро-циты ровным слоем покрывают все дно лунки, образуя
перевернутый «зонтик», с негативной сывороткой эритроциты оседают в виде точки, начиная с первой лунки ряда. Титр позитивной контрольной сыворотки крови не ниже 1:64 (рис. 6).
Рисунок 6 - Результаты изучения активности и специфичности «Набора...»: 1-4 -результаты реакции с сыворотками крови крупного рогатого скота, вакцинированного против сибирской язвы;5 - результаты реакции с негативной сывороткой крови кроликов (отрицательный контроль); 6 - результаты реакции с позитивной сывороткой крови кроликов (положительный контроль); 7 - результаты реакции на самоагглютинацию.
Заключение: Проведение доклинических испытаний компонентов, входящих в «Набор.», по физико-химическим и биологическим показателям, показало их соответствие требованиям ТУ. По результатам лабораторных и производственных испытаний мы установили: 1) набор активен и специфичен (позволяет проводить оценку титра антител у животных привитых против сибирской язвы); 2) безопасен в применении (исключает использование вирулентных культур возбудителя сибирской язвы); 3) прост
в применении (используется минимальное количество компонентов и оборудования для постановки РНГА); 4) позволяет получить результаты исследования в короткие сроки (время проведения - в течение 1,5 - 2 часов). Проведение мониторинговых исследований «Набором.» сывороток крови животных, привитых против сибирской язвы обесп-чивает своевременный контроль за достаточным титром антител, обеспечивающий защиту животных от заражения сибирской язвой.
Литература
1. Васина, Н.К. Серологический мониторинг эффективности специфической профилактики сибирской язвы в ЦФО РФ / Н.К. Васина, Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова // Ветеринарная патология. - 2012. - № 1. - С. 36.
2. Гаврилов, В.А. Почвенные очаги сибирской язвы: реалии и проблемы / В.А. Гаврилов, Т.Н. Грязнева, В.В. Селиверстов // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. - 2017. - № 8. - С. 17.
3. Родионов, А.П. Характеристика эпизоотической ситуации по сибирской язве в Республике Татарстан // А.П. Родионов, С.В. Иванова, Л.А. Мельникова и др. // Ветеринария. -2020. - № 3. - С. 8.
4. Рязанова, А.Г. Анализ ситуации по сибирской язве в 2019 г., прогноз на 2020 г. / А.Г. Рязанова, О.Н. Скударева, Д.К. Герасименко и др. // Проблемы особо опасных инфекций. -2020. - № 2. - С. 57.
5. Рязанова, А.Г. Оценка эпидемиологической и эпизоотологической обстановки по сибирской язве в 2016 г., прогноз на 2017 г. / А.Г. Рязанова, Е.И. Еременко, Л.Ю Аксенова и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2017. - № 1. - С. 21.
6. Селянинов, Ю.О. Сравнительное изучение серологических методов оценки поствакцинального противосибиреязвенного иммунитета / Ю.О. Селянинов, Н.К. Васина, И.Ю. Егорова и др. // Ветеринария. - 2011. - № 12. - С. 25.
7. Carlson, C.J. The global distribution of Bacillus anthracis and associated anthrax risk to humans, livestock and wildlife / C.J. Carlson, I.T. Kracalik, N. Ross et al. // Nat. microbiol. - 2019. - № 4. -р. 1337.
8. Mwakapeje, E. R. Anthrax outbreaks in the humans - livestock and wildlife interface areas of Northern Tanzania: a retrospective record review 2006-2016 / E.R. Mwakapeje, S. Hogset, R. Fyumagwa et al. // BVC public health. - 2018. - № 18 (1). - p. 106.
9. Pisarenko, S.V. Phylogenetic analysis of Bacillus anthracis strains from Western Siberia reveals a new genetic cluster in the global population of the species / S.V. Pisarenko, E.I. Eremenko, AG. Ryazanova et al. // BMC genomics. - 2019. - № 20 (1). - p. 692.
TEST OF THE "KIT FOR DETERMINATION TITER OF ANTIBODIES IN THE SERUM OF CATTLE VACCINATED AGAINST ANTHRAX BY IHR" FOR COMPLIANCE WITH TECHNICAL SPECIFICATIONS
Artemieva E.A. - candidate of veterinary sciences, Melnikova L.A. - candidate of veterinary sciences, Rodionov A.P.
FSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety» (420075, Kazan, Nauchny gorodok-2, e-mail: vnivi@mail.ru)
In the world annually from 5 to 6 thousand cases of anthrax are recorded, from which more than a million animals die, more than 20 thousand people fall ill. Cases of anthrax manifestation are due to territories nonwelfare for anthrax for this disease. To prevent the occurrence of epizootics and the transmission of the pathogen to people, in veterinary practice, specific prevention of this infection is used, which consists in vaccination of all susceptible livestock of farm animals, which allows creating a tense immunity in the body, and in case of ingestion of virulent forms of the pathogen, preserve the life and health of the animal, as a result, do not allow new infections. To date, the assessment of the level of immunity in animals is carried out by serological methods, in particular by the indirect hemagglutination reaction (IHR), using the "Kit for determining the titer of antibodies in the serum of blood of animals vaccinated against anthrax by indirect hemagglutination reaction (IHR)". The kit, developed by the employees of the Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, has passed laboratory and production tests, showing itself as an active and specific diagnosticum. The purpose of the work is to test the ""Kit for determining the titer of antibodies in the serum of blood of animals vaccinated against anthrax by indirect hemagglutination reaction (IHR)" for compliance with the developed specifications.
Keywords: indirect hemagglutination reaction (IHR), diagnosticum, anthrax, unfavorable point, analysis of the epizootic situation
References
1. Vasina, N.K. Serological monitoring of the effectiveness of specific prevention of anthrax in the Central Federal District of the Russian Federation / N.K. Vasina, Yu.O. Selyaninov, I. Yu. Egorova // Veterinary pathology. - 2012. - №. 1. - p. 36.
2. Gavrilov, V.A. Soil foci of anthrax: realities and problems / V.A. Gavrilov, T.N. Gryaznev, V.V. Seliverstov // Veterinary Medicine, Animal Science and Biotechnology. - 2017. - №. 8. - p. 17.
3. Rodionov, A.P. Characteristics of the epizootic situation for anthrax in the Republic of Tatarstan // A.P. Rodionov, S.V. Ivanova, L.A. Melnikova et al. // Veterinary Medicine. - 2020. - №.3.-p. 8.
4. Ryazanova, A.G. Analysis of the situation with anthrax in 2019, forecast for 2020 / A.G. Ryazanova, O. N. Skudareva, D.K. Gerasimenko et al. // Problems of especially dangerous infections. - 2020. - № 2. - p. 57.
5. Ryazanova, A.G. Assessment of the epidemiological and epizootic situation for anthrax in 2016, forecast for 2017 / A.G. Ryazanova, E.I. Eremenko, L.Yu Aksenova et al. // Problems of especially dangerous infections. - 2017. - № 1. - p. 21
6. Selyaninov, Yu.O. Comparative study of serological methods for assessing post-vaccination anthrax immunity / Yu.O. Selyaninov, N.K. Vasina, I. Yu. Egorova et al. // Veterinary medicine. -2011. - № 12. - p. 25.
7. Carlson, C.J. The global distribution of Bacillus anthracis and associated anthrax risk to humans, livestock and wildlife / C.J. Carlson, I.T. Kracalik, N. Ross et al. // Nat. microbiol. - 2019. - № 4. -p. 1337.
8. Mwakapeje, E. R. Anthrax outbreaks in the humans - livestock and wildlife interface areas of Northern Tanzania: a retrospective record review 2006-2016 / E.R. Mwakapeje, S. Hogset, R. Fyumagwa et al. // BVC public health. - 2018. - № 18 (1). - p. 106.
9. Pisarenko, S.V. Phylogenetic analysis of Bacillus anthracis strains from Western Siberia reveals a new genetic cluster in the global population of the species / S.V. Pisarenko, E.I. Eremenko, A.G. Ryazanova et al. // BMC genomics. - 2019. - № 20 (1). - p. 692.
УДК 636.085:577.17 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-6-11-15
ВЛИЯНИЕ ХИТОЗАНА, УЛЬТРАДИСПЕРСНЫХ ЧАСТИЦ СЕРЕБРА И ИХ КОМПЛЕКСА НА РУБЦОВОЕ СОДЕРЖИМОЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Ажмулдинов Е.А. - доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Кизаев М.А. - кандидат сельскохозяйственных наук, Титов М.Г. - кандидат сельскохозяйственных наук,
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук» (460000, г. Оренбург, 9-го Января, 29, e-mail: Titow.ru@mail.ru)
Проведены исследования по изучению влияния хитозана и УДЧ серебра и их комплекса на микрофлору рубца крупного рогатого скота. Эксперимент проводился в стандартных условиях вивария на искусственном рубце KPL 01. В качестве анализируемых образцов применялись препараты хитозана в дозе 12,5 мг (I образец), УДЧ серебра - в дозе 0,03 мг (II образец) и комплекс хитозана в - дозе 12,5 мг с УДЧ серебра 0,03 мг (III образец); 0,1 мг (IV образец) и 0,3 мг (V образец). Дозы определялись из расчета на 1 л рубцовой жидкости и задавались сразу в жидкость. Определялось влияние данных препаратов на микрофлору рубцовой жидкости in vitro. Использование хитозана, УДЧ серебра и их комплекса влияет на степень интенсивности микробиологических процессов рН, в III-V образцах имела небольшую разницу, которая находилась в пределах 0,3-0,4 %, а в I и II данный показатель отклонялся в кислую сторону на 2,3-2,7% (Р<0,05) по сравнению с комплексом хитозан и УДЧ серебра. Введение комплекса хитозан и УДЧ серебра способствовало снижению концентрации аммиака в рубцовой жидкости, а повышению азота - на 9,8% и 11,6% (Р<0,01). Таким образом, комплекс хитозан 12,5 мг и УДЧ серебра в дозе 0,1 мг способствует сохранению микрофлоры рубца.
Ключевые слова: искусственный рубец, хитозан, УДЧ серебра, рубцовая жидкость, бактерии, ЛЖК, азот.
Многие кормовые добавки были успешно использованы в рационах жвачных животных при технологических стрессах, которые способствовали увеличению продуктивности животных и снижению себестоимость продукции. Поиск наиболее эффективных антистрессовых добавок, улучшающих микрофлору рубцовой жидкости и снижающих количество патогенной микрофлоры и, в свою очередь, не накапливаются в продуктах животного происхождения, продолжается. Следовательно,
исследования альтернативных добавок и способов их доставки в организм, которые могли бы манипулировать микробной экосистемой рубца и снижать воздействие стресс-факторов на животного, актуальны [1, 2].
Как нетоксичный, биоразлагаемый углеводный полимер, хитозан получил большое распространение как переносчик лекарственных средств [3, 4]. О более длительном воздействии хитозана на
