CC BY
80УДК 619:616.98:579.852.11-097:636.2
изучение иммунологического статуса поголовья крупного
рогатого скота вакцинированного против сибирской язвы
А.П.Родионов - аспирант.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, Казань, Научный городок-2, тел. +7(843)239-53-37, e-mail: vnivi@mail.ru).
В работе представлены результаты изучения динамики изменений титра противосибиреязвенных антител и количества Т- и В-лимфоцитов в разные сроки после вакцинации. Работа проводилась в хозяйстве Высокогорского района Республики Татарстан, где были подобраны 30 голов крупного рогатого скота (КРС), которых иммунизировали против сибирской язвы. Пробы крови у опытных животных отбирали в день вакцинации (фоновый титр) и далее через 7, 14, 21, 35, 62, 90, 150, 181 суток. Титр антител определяли, используя «Набор определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)». Количественный состав лимфоцитов изучали согласно методическим рекомендациям «Иммуно-клеточная тест-система для оценки влияния ионизирующей радиации на организм животных». В результате проделанной работы выявлена необходимость проведения более масштабных исследований для изыскания оптимальных сроков ревакцинации восприимчивого поголовья. Установлено, что в процессе иммуногенеза при сибирской язве у животных устанавливался Т-клеточный иммунитет, который не зависел от количества В-лимфоцитов и титра антител.
КЛюЧЕВЫЕ СЛОВА: сибирская язва, иммуногенез, вакцинация, крупный рогатый скот, антитела, лимфоциты, РНГА.
Сибирская язва - зооантропонозное особо опасное заболевание, вызываемое споро-образующим почвенным микроорганизмом Bacillus anthracis, сохраняющее социально-экономическую значимость в связи с тяжестью его течения, стойкостью почвенных очагов, широким распространением во всех странах мира [1, 2, 3].
Сибирская язва тщательно изучена и подробно описана в специальной литературе, но, несмотря на проводимые профилактические мероприятия у восприимчивого поголовья, в Российской Федерации и за рубежом ежегодно регистрируются спорадические случаи заболеваемости животных [4]. Это связано, в первую очередь, со стойкостью почвенных очагов инфекции, а также пропусками при вакцинации, толерантностью и недостаточной напряженностью проти-восибиреязвенного иммунитета.
На сегодняшний день иммунитет против сибирской язвы (поствакцинальный и постинфекционный) рассматривают как антиинфекционный и антитоксический. Основой антибактериального иммунитета является фагоцитоз, а защитные антитела отождествляют с антитоксинами [5]. Защита организма от патогена обеспечивается функционированием взаимодополняющих звеньев иммунной системы: врожденной и адаптивной [6]. Известно, что Bacillus anthracis в процессе своей жизнедеятельности в организме восприимчивого животного выделяет три полипептида, которые объединяясь, образуют летальный (LT) и отечный (ET) токсины. Оба токсина имеют общий рецепторсвя-зывающий компонент: защитный антиген (PA). РА позволяет переносить летальный и отечный факторы в цитозоль клетки, где и происходит их токсическое воз-
действие [7]. Токсины сибирской язвы оказывают множественные эффекты, способствующие дисрегуляции иммунитета, презентации антигена, а также передачи сигналов Т- и В-клеток [8, 9]. Но при вовлечении в защиту организма адаптивной иммунной системы, вырабатываются специфические антитела (АТ), которые связывают токсины, и позволяют клеткам врожденного иммунитета уничтожить бактериальный патоген [10]. Многие исследования показали, что титр специфических антител коррелирует со степенью иммунной защиты животных против сибирской язвы [11, 12].
Таким образом, титр противосибиреязвенных антител является показателем, отслеживая который, можно судить об иммунном статусе животного и всего восприимчивого поголовья.
Цель работы - изучение динамики образования противосибиреязвенных антител и количественного состава Т- и В-лимфоцитов в крови крупного рогатого скота в разные сроки после вакцинации для изучения формирования поствакцинального иммунитета.
Материалы и методы. Исследования проведены в ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" сотрудниками лаборатории коллекции микроорганизмов. Исследовали пробы крови 30 коров, вакцинированных против сибирской язвы, принадлежащих КФХ "Ибрагимова Л.Л." Высокогорского района РТ.
Для иммунизации животных против сибирской язвы использовали ассоциированную вакцину против сибирской язвы (штамма №55-ВНИИВВиМ) и эмфизематозного карбункула. Вакцинацию проводили согласно инструкции по применению.
Кровь у исследуемых животных брали из подхво-стовой вены в пластиковые вакуумные пробирки без
наполнителя (для исследования титра антител) и в пластиковые вакуумные пробирки с антикоагулянтом этилендиаминтетраацетатом (для исследований Т- и В-лимфоцитов) в день вакцинации - фоновые показатели и далее через 7, 14, 21, 35, 62, 90, 153, 181 сут со дня вакцинации, согласно составленному календарному плану исследований.
Исследование динамики титра антител проводили, используя «Набор определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» разработанный и запатентованный специалистами лаборатории коллекции микроорганизмов ФГБ-НУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» [17].
Количественный состав иммуноцитов изучали
согласно методическим рекомендациям «Имму-но-клеточная тест-система для оценки влияния ионизирующей радиации на организм животных» разработанным специалистами ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» с использованием метода прямого спонтанного ро-зеткообразования (Е-РОК) с эритроцитами барана и мыши для Т- и В-лимфоцитов соответственно [14].
Учет количества иммуноцитов осуществляли иммерсионным способом, используя микроскоп «Микмед-5». Подсчитывали 200 лимфоцитов в каждом мазке и из них вычисляли процент розеткообразующих клеток.
Статистическую обработку результатов исследований проводили, используя программу Microsoft Excel.
Результаты исследований. В результате проведенных исследований были получены следующие данные:
Рис.1. Средний титр антител КРС в разные сроки после вакцинации.
Анализ полученных данных показал, что при взятии крови в день вакцинации (фоновый показатель) среднее количество антител в сыворотках крови исследуемых животных находилось на уровне нижней границы защитного титра, что может повлечь за собой риск возникновения заболевания.
После иммунизации титры антител у опытных животных возрастали и достигали своего пика на 90 сут, при этом их количество сильно разнилось среди исследуемой группы, что может быть связано с индивидуальными особенностями организма.
В последующие сроки после иммунизации (153 сут) регистрировали постепенное снижение титра антител до минимальных защитных значений, однако у 6 (20%) животных он по-прежнему находился на высоком уровне.
Исследования, проведенные на 181 сут после вакцинации, показали, что у животных титры проти-восибиреязвенных антител продолжили снижаться. Это свидетельствует о том, что по истечении 6 мес после вакцинации иммунитет против сибирской язвы находился на критическом уровне, что может являться потенциальной угрозой возникновения вспышки заболевания.
Результаты изучения количества иммунокомпе-тентных клеток в крови вакцинированных животных обобщены и представлены на рисунке 2.
Анализ полученных данных позволяет констатировать, что после вакцинации КРС против сибирской язвы, в процессе иммуногенеза, происходило более выраженное становление Т-клеточного иммунитета, процесс образования в организме Т-клеток имел волнообразный характер. Наивысшее количество Т-лим-фоцитов в образцах исследуемой крови наблюдалось в период с 35 по 62 сут после проведения вакцинации.
В тоже время количество В-лимфоцитов также повышалось, но их уровень был значительно ниже Т-клеток.
Данные сравнительной оценки количества Т- и В-лимфоцитов с титром противосибиреязвенных антител представлен на рисунке 3.
Из рисунка 3 видно, что содержание В-лимфоцитов в крови исследуемых животных имело прямую зависимость с титром противосибиреязвенных антител. В свою очередь Т-клетки не имели количественной корреляции с антителами, и их развитие происходило независимо от гуморального звена адаптивного иммунитета.
сутки сутки
Рис. 2. Количественный состав Т- и В-лимфоцитов в крови КРС в разные сроки после вакцинации.
Рис.3. Сравнительная оценка количественного содержания Т- и В-лимфоцитов с титрами противосибиреязвенных антител в крови КРС.
Заключение. Анализ полученных данных по содержанию Т- и В-лимфоцитов в исследуемых пробах крови КРС показал, что в процессе поствакцинального сибиреязвенного иммуногенеза происходит более выраженное становление Т-клеточного звена иммунитета, что может быть следствием персистирования вакцинного штамма №55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы в организме иммунизированного животного в течение длительного периода времени [15]. Количество Т-лимфоцитов не имеет зависимости с В-клетками и гуморальной адаптивной иммунной системой. При исследовании содержания В-лимфоцитов выявлялась их прямая количественная зависимость с титром противосибиреязвенных антител.
Полученные в эксперименте результаты свидетельствуют о том, что по истечении 6 мес после вакцинации крупного рогатого скота против сибирской язвы титр специфических антител и количество им-мунокомпетентных клеток постепенно снижаются до низких границ защитного уровня. Эти данные, несмотря на инструкцию по применению вакцины против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ [16], в которой рекомендована ежегодная однократная иммунизация восприимчивого поголовья, диктуют необходимость проведения более масштабных исследований по изысканию оптимальных сроков ревакцинации животных, с целью снижения рисков возникновения случаев заболевания сибирской язвой.
Литература
1. Макаров, В.В. Мировой нозоареал сибирской язвы / В.В.Макаров, О.И.Сухарев // Ветеринарная патология. - 2012. - № 1 (39). - С. 7-15.
2. Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по сибирской язве в Республике Татарстан. / А.К.Га-лиуллин, Р.Х.Юсупов, Р.А.Даутова, С.А.Климина // Ветеринарный врач. - 2004. - № 3-4. - С. 32-36.
3. Галиуллин, А.К. Старые сибиреязвенные захоронения - возможные источники распространения инфекции / А.К. Галиуллин, С.А. Климина. // Ветеринарный врач. - 2004. - № 3-4. - С. 36-38.
4. Эпидемиологическая и эпизоотологическая обстановка по сибирской язве в 2017 г., прогноз на 2018 г / А.Г.Рязанова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2018. - № 1. - С. 63-65.
5. Цыдыпов, В.Ц. Эпизоотология и специфическая профилактика сибирской язвы в регионе Сибири и Дальнего Востока./ В.Ц.Цыдыпов, Г.Д.Галсанова, Ю.Ж.Будаев. - Улан-Удэ: Издательство БГСХА, 2007. - 213 с.
6. Галиуллин, А.К. Сибирская язва сельскохозяйственных животных / А.К.Галиуллин, Р.Г.Госманов. - Казань: Издательство «Отечество», 2013. - 306 с.
7. Александрова, Н.М. Индикация возбудителя сибирской язвы в объектах санитарно-эпидемиологического надзора в формате реального времени (RealTime) / Н.М.Александрова, Т.Х.Фаизов // Ветеринарный врач. - 2013.
- № 3. - С. 24-26.
8. Anthrax lethal toxin-mediated killing of human and murine dendritic cells impairs the adaptive immune response / A.Alileche [et al.] // J. PLOS Pathog. - 2005. - № 1. - Р. 19.
9. Macrophage apoptosis by anthrax lethal factor through p38 MAP kinase inhibition / J.M. Park [et al.] // Science.
- 2002. - № 297. - Р. 2048-51.
10. The role of antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early stages of infection by anthrax spores / S.Welkos [et al.] // Microbiology. - 2001. - № 147. - Р. 1677-1685.
11. Галиуллин, А.К. Оценка сибиреязвенного иммунитета у животных через разные сроки после вакцинации / А.К.Галиуллин, А.А.Файзуллин, Д.А.Адиятуллина // Ветеринария. - 1994. - № 8. - С. 30-31.
12. Search for correlates of protective immunity conferred by anthrax vaccine / S.Reuveny [et al.] // Infect. Immun.
- 2001. - № 69. - Р. 2888-2893.
13. Natural Exposure to Cutaneous Anthrax Gives Long-Lasting T Cell Immunity Encompassing Infection-Specific Epitopes / J.Rebecca [et al.] // Immunol, - 2010. - № 184 (7), April. - Р. 3814-3821.
14. Иммуноклеточная тест-система для оценки влияния ионизирующей радиации на организм животных / А.В.Иванов, Г.В.Конюхов, Р.Н.Низамов [и др.]. - М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2006. - 16 с.
15. Бакулов, И.А. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении "старой болезни" / И.А. Бакулов, В.А Гаврилов, В.В. Селиверстов. - Владимир: Посад, 2001. - 281 c.
16. Инструкция по применению вакцины против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ живой жидкой. 08.07.2014. - Покров, 2014. - 6 с.
17. Патент 2599035 Российская Федерация, МПК G01N 33/531, C12N 1/20. Способ получения эритроцитар-ного сибиреязвенного антигена, способ получения контрольной положительной сыворотки для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гема-гглютинации и набор для определения антител / Х.Н.Макаев, Л.А.Мельникова, С.В.Иванова, А.Г.Хисамутдинов, А.В.Иванов, Л.А.Барбарова, Г.Х.Муртазина; заявитель и патентообладатель ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»). - № 2015128403/15; за-явл. 13.07.2015; опублик. 10.10.2016, Бюл. № 28.
studying the immunological status of headed cattle vaccinated against anthrax
Rodionov A.P. - postgraduate student.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
The paper presents the study results of changes in anthrax antibody titer and the number of T and B lymphocytes in different terms after vaccination. The work was conducted in a farm of the Vysokogorskiy district of the Republic of Tatarstan, where 30 head cattles immunized against anthrax were collected. Blood samples from experimental animals were taken on the day of vaccination (background titer) and then after 7,14,21,35,62,90,153, 181 days. Antibody titers were determined using the "Kit of determination of antibodies in the serum of animals vaccinated against anthrax in the reaction of indirect hemagglutination (RHA)". The quantitative composition of immunocytes was studied according to the methodological recommendations"Immuno-cell test-system for assessing the effect of ionizing radiation on animals". As a result of the work there was a need for more extensive studies to find the optimal terms for revaccination of susceptible head of livestock. Animals were found to have a T-cell immunity not depending on the number of B-lymphocytes and antibody titer in the process of immunogenesis at anthrax.
KEYWORDS: anthrax, immunogenesis, vaccination, cattle, antibodies, lymphocytes, RHA.
References
1. Makarov, V.V. Mirovoy nozoareal sibirskoy yazvy [World nozoareal of anthrax]. / V.V.Makarov,O.I.Sukharev. // Veterinarnaya patologiya. - 2012. - № 1 (39). - P. 7-15.
2. Retrospektivny analiz epizooticheskoy situacii po sibirskoy yazve v RespublikeTatarstan [The retrospective analysis of the epizootic situation for anthrax in the Republic of Tatarstan]. / A.K.Galiullin, R.H.Yusupov, R.A.Dautova, S.A.Klimina. // Veterinarny vrach. - 2004. - № 3-4. - P.32-36.
3. Galiullin A.K. Starye sibireyazvennye zakhoroneniya - vozmozhnye istochniki rasprostraneniya infekcii [Old anthrax burials - possible sources of infection]. / A.K.Galiullin, S.A.Klimina. // Veterinarny vrach. - 2004. - № 3-4. - P.36-38.
4. Epidemiologicheskaya I epizootologicheskaya obstanovka po sibirskoy yazve v 2017 g., prognozna 2018 g [Epidemiological and epizootological situation for anthrax in 2017, the prognosis for 2018] / A.G.Ryazanova [et al.] // Problemy osobo opasnykh infekciy. - 2018. -№ (1). - P. 63-65.
5. Tsydypov, V.C.Epizootologiya I specificheskaya profilaktika sibirskoy yazvy v regione Sibiri I DalnegoVostoka [Epizootological and specific prevention of anthrax in the region of Siberia and the Far East] / V.C.Tsydypov, G.D.Galsanova, Yu.Zh.Budaev. - Ulan-Ude: Izdatelstvo BGSKHA, 2007. - 213 p.
6. Galiullin, A.K.Sibirskaya yazva selskokhozyaystvennykh zhivotnykh [Anthrax of farm animals]. / A.K.Galiullin, R.G.Gosmanov. - Kazan: «Otechestvo», 2013. - 306 p.
7. Aleksandrova, N.M. Indikaciya vozbuditelya sibirskoy yazvy v obyektakh sanitarno-epidemiologicheskogo nadzora v formate realnogo vremeni (Real Time) [Indication of the anthrax pathogen in the objects of sanitary and epidemiological surveillance in real time (Real Time)] / N.M.Aleksandrova, T.H.Faizov // Veterinarny vrach. - 2013.
- № 3. - P. 24-26.
8. Anthrax lethal toxin-mediated killing of human and murine dendritic cells impairs the adaptive immune response / A.Alileche [et al.] // J. PLOS Pathog. - 2005. - № 1. - P. 19.
9. Macrophage apoptosis by anthrax lethal factor through p38 MAP kinase inhibition / J.M. Park [et al.] // Science.
- 2002. - № 297. - P. 2048-51.
10. The role of antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early stages of infection by anthrax spores / S.Welkos [et al.] // Microbiology. - 2001. - № 147. - P. 1677-1685.
11. Galiullin, A.K.Ocenka sibireyazvennogo immuniteta u zhivotnykh cherez raznye sroki poslevaktsinatsii [Assessment of anthrax immunity at animals in different terms after vaccination] / A.K.Galiullin, A.A.Fayzullin, D.A.Adiyatullina // Veterinariya. - 1994. - № (8). - P. 30-31.
12. Search for correlates of protective immunity conferred by anthrax vaccine / S.Reuveny [et al.] // Infect. Immun.
- 2001. - № 69. - P. 2888-2893.
13. Natural Exposure to Cutaneous Anthrax Gives Long-Lasting T Cell Immunity Encompassing Infection-Specific Epitopes / J.Rebecca [et al.] // Immunol, - 2010. - № 184 (7), April. - P. 3814-3821.
14. Immunokletochnaya test-sistema dlya ocenki vliyaniya ioniziruyushchey radiacii na organism zhivotnykh [Immuno-cellular test-system for assessment of influence of the ionizing radiation on animals' organizm] / A.V. Ivanov [et al.]. - M.: FGNU «Rosinformagrotekh», 2006. - 16 p.
15. Bakulov, I. A. Sibirskaya yazva (antraks): novye stranitsy v izuchenii "staroy bolezni" [Anthrax: new pages in studying of "an old disease"] / I.A.Bakulov, V.A.Gavrilov, V.V.Seliverstov. - Vladimir: Posad, 2001. - 281 p.
16. Instrukciya po primeneniyu vakciny protiv sibirskoy yazvy zhivotnykh iz shtamma 55-VNIIVViM zhivoy zhidkoy. 08.07.2014 [The instruction for using the vaccine against anthrax of animals from a strain 55-VNIIVVIM live liquid. 08.07.2014]. - Pokrov, 2014. - 6 p.
17. Patent 2599035 Rossiyskaya Federatsiya, MPK G01N 33/531, C12N 1/20. Sposob polucheniya eritrocitarnogo sibireyazvennogo antigena, sposob polucheniya kontrolnoy polozhitelnoy syvorotki dlya nabora opredeleniya antitel v syvorotke krovi zhivotnykh, vakcinirovannykh protiv sibirskoy yazvy, v reakcii nepryamoy gemagglyutinacii I nabor dlya opredeleniya antitel [The method of obtaining erythrocyte anthrax antigen, the method of obtaining control positive serum for a set of detection of antibodies in the serum of animals vaccinated against anthrax in the reaction of indirect hemagglutination and set for the determination of antibodies] / Kh.N.Makaev, L.A.Melnikovz, S.V.Ivanova, A.G.Khisamutdinov, A.V.Ivanov, L.A.Barbarova, G.Kh.Murtazina; applicant and patent possessor FGBNU "Federalny centr toksikologicheskoy, radiatsionnoy I biologicheskoy bezopasnostu (FGBNU "FCTRB-VNIVI"). - № 2015128403/15; ordered 13.07.2015; published 10.10.2016, Bulletin № 28.
