CC BY
39
Пробл. особо опасных инф. 2017; 2:84-86. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-2-84-86
УДК 616.98:579.852.11
Т.А.севских, Ю.о.селянинов, и.Ю.Егорова
протективные свойства вакцинного штамма 55-внииввиМ и БЕСКАПСульного штАММА BACILLUS ANTHRACIS 363/11
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии, Владимирская обл., п. Вольгинский, Российская Федерация
Основной целью работы было определение протективных свойств и безопасности для животных естественно аттенуированного бескапсульного штамма B. anthracis 363/11 и оценка возможности его использования в качестве кандидатного для разработки и совершенствования средств специфической профилактики сибирской язвы. Для сравнительного изучения протективных свойств использовали вакцинный штамм 55-ВНИИВВиМ, применяемый для обеспечения благополучия по сибирской язве животных на территории России. С использованием стандартных методик на модели лабораторных (белые мыши, морские свинки) и целевых животных (овцы) определяли показатели ЛД50, ИмД50 и протективную эффективность. Установлено, что авирулентный для белых мышей штамм B. anthracis 363/11 обладает иммуногенной и протективной эффективностью, превышающими таковые для штамма 55-ВНИИВВиМ. Штамм стабилен и не реверсирует к вирулентному варианту при пассировании на питательных средах и через организм восприимчивых животных. Это дает основание для того, чтобы рассматривать штамм B. anthracis 363/11 в качестве кандидатного вакцинного, применение которого будет способствовать улучшению эпизоотической ситуации по сибирской язве в РФ.
Ключевые слова: сибирская язва, иммуногенная активность, протективность, кандидатная вакцина.
Корреспондирующий автор: Севских Тимофей Александрович, e-mail: sefskih@mail.ru.
1A.Sevskikh, Yu.O.Selyaninov, I.Yu.Egorova
Protective Properties of the Vaccine Strain 55-VNIIVViM and Acapsular Strain Bacillus anthracis 363/11
National Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology, Russian Academy of Agricultural Science, Vladimir region, Volginsky, Russian Federation
Objective of the work was to determine protective potential and safety for animals of the naturally attenuated B. anthracis 363/11 monoplazmid non-capsular strain to be used as a new candidate vaccine strain for the development and enhancement of specific prophylaxis of anthrax. Materials and methods. Vaccine strain 55-VNIIVViM that is used for welfare provision as regards anthrax in animals in the territory of Russia was employed for the comparison of protective properties. Identification of LD50, ImD50 and protective efficacy was carried out using standard protocols for modeling the infection on laboratory (white mice, guinea pigs) and targeted (sheep) animals. Results and conclusions. It is established that avirulent for white mice B. anthracis 363/11 strain demonstrates higher protective and immunogenic activity than 55-VNIIVViM strain. It does not reverse to the virulent variant after passaging on the nutrient media and in the organism of susceptible animals. Thus it allows for considering B. anthracis 363/11 strain as a promising candidate vaccine strain, the utilization of which will improve epizootic situation on anthrax in the Russian Federation.
Key words: B. anthracis, immunogenic activity, protectivity, candidate vaccine.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Funding: The study is financially supported by the Federal Agency for Scientific Organizations within the frames of the research project under the No 0615-2016-0001.
Corresponding author: Timofei А. Sevskikh, e-mail: sefskih@mail.ru.
Citation: Sevskikh Т.А., Selyaninov Yu.O., Egorova I.Yu. Protective Properties of the Vaccine Strain 55-VNIIVViM and Acapsular Strain Bacillus anthracis 363/11. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 2:84-86. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2017-2-84-86
Основным требованием, предъявляемым к сибиреязвенным вакцинным штаммам, является обеспечение ими 80-100 % уровня защиты привитых лабораторных животных против заражения референтными вирулентными культурами сибиреязвенного микроба [4]. Вакцинные штаммы В. anthracis СТИ-1 и 55-ВНИИВВиМ, используемые для вакцинации в медицинской и ветеринарной практике, соответствуют данным требованиям. Однако, согласно литературным и экспериментальным данным, отдельные штаммы, выделяемые из почвы скотомогильников или во время вспышек болезни у человека и животных [2], а также рекомбинантные штаммы, приобретшие новые свойства в результате генетиче-
ских манипуляций, обладают способностью преодолевать иммунитет, индуцированный этими вакцинами [3] и, соответственно, снижать эффективность противосибиреязвенных мероприятий. Для повышения защитных свойств сибиреязвенных вакцин и формирования ими более выраженного иммунного ответа необходимо, чтобы в составе новых вакцинных препаратов был наиболее полно представлен спектр антигенов, антитела к которым принимают участие в формировании напряженного иммунитета против изолятов, способных преодолевать иммунитет. Решить эту проблему можно несколькими путями: созданием рекомбинантных штаммов и штаммов-продуцентов антигенов с использованием
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
генно-инженерных технологий, конструированием бивалентных вакцин, аттенуацией вирулентных штаммов, способных преодолевать иммунитет, с сохранением их антигенных особенностей и поиском новых кандидатных штаммов, отличающихся от известных набором фенотипических свойств и продуцируемых антигенов. В связи с изложенным нами было проведено сравнительное изучение про-тективных свойств нового бескапсульного штамма B. anthracis 363/11 и известного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с целью определения возможности использования первого из них в качестве кандидат-ного для разработки и совершенствования средств специфической профилактики сибирской язвы.
В работе использовали споровые культуры вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и бескапсульного штамма B. anthracis 363/11, выделенного от павшего подсвинка. Сравнительную оценку протек-тивных свойств и напряженности индуцируемого иммунитета изучали в экспериментах на морских свинках и овцах с использованием капсулообра-зующих референс-заражающих штаммов (II вакцина Ценковского - B. anthracis 71/12, II вакцина Пастера - B. anthracis 17JB, вирулентный штамм B. anthracis 76), капсулообразующего вакцинного штамма (Carbovax) и полевых изолятов (B. anthracis 81, 304, 364), выделенных в Казахской АССР, Алтайском крае и Тульской области в 1974, 1989 и 2011 гг. соответственно. Изменение показателя ЛД50 в процессе пассирования штамма B. anthracis 363/11 in vitro изучали в опытах на белых аут-бредных мышах. Все штаммы/изоляты получены из Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
Иммуногенную активность штаммов оценивали на клинически здоровых морских свинках массой 350-400 г количественным методом (ИД50). Из споровых суспензий штаммов B. anthracis 55-ВНИИВВиМ и 363/11 готовили разведения с содержанием 107, 2106, 4105, 8104, 1,6104 живых спор в 0,5 см3. Материал каждого из разведений инокулиро-вали подкожно в область живота в объеме 0,5 см3 7-8 особям. Через 21 сут после иммунизации по 6 голов животных из каждой группы и 6 интактных морских свинок заражали культурами сибиреязвенных штаммов в дозе 200 ЛД50. Расчет показателей ИД50 проводили в соответствии с ГОСТ Р 52616-2006 «Вакцина против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ живая».
протективную эффективность штаммов изучали на клинически здоровых морских свинках массой 300-400 г. Животных 7 групп по 12 голов в каждой иммунизировали споровой суспензией вакцинного штамма B. anthracis 55-ВНИИВВиМ и аналогичное количество морских свинок - испытуемого штамма B. anthracis 363/11 в дозе 107 спор. Через 21 сут после иммунизации животных различных групп (по 10 голов в каждой) заражали капсулообразующими вакцинными штаммами и полевыми изолятами в дозе
200 ЛД50. Наблюдение за животными и учет их гибели проводили в течение 10 дней после заражения.
Показатель вирулентности (ЛД50) для культур исследуемого штамма определяли на белых аутбред-ных мышах массой 18-20 г. Из мышей формировали 5 групп по 6 голов в каждой. Животным опытных групп подкожно вводили по 0,5 см3 споровых суспензий штамма с концентрациями 2108, 4107, 8106, 1,6106, 3,2105 спор в 1 мл. Наблюдение за мышами и учет их гибели проводили в течение 10 дней. Величину ЛД50 рассчитывали по формуле Кербера в модификации И.П.Ашмарина и A.A. Воробьева.
Работу с животными проводили в соответствии с «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1987).
ранее при проведении работ по паспортизации сибиреязвенных штаммов было установлено, что культура бескапсульного штамма B. anthracis 363/11 обладает высокой иммуногенностью, низкой реак-тогенностью и отличается по фенотипическим признакам от отечественных вакцинных штаммов (обладает высокой протеолитической и гемолитической активностями, поглощает конго красного из среды, синтезирует протокатеховую кислоту) [1], что и обусловило выбор объекта исследований.
при последующем проведении сравнительного изучения на морских свинках иммуногенной активности штаммов B. anthracis 55-ВНИИВВиМ и 363/11 установлено, что значение ИД50 для штамма 55-ВНИИВВим против заражения споровыми культурами капсулообразующих штаммов B. anthracis 71/12 и Carbovax в дозе 200 ЛД50 составило 2,9105 и 3,4 105 спор, в то время как аналогичные показатели ИД50 для штамма B. anthracis 363/11 были значительно ниже и составили 2,95104 и 1,55105 спор соответственно.
На следующем этапе изучен спектр протек-тивной эффективности штаммов B. anthracis 55-ВНИИВВиМ и 363/11 в экспериментах на различных биологических моделях (морские свинки и овцы) с использованием как культур референс-заражающих штаммов, так и полевых изолятов. Установлено, что введение морским свинкам суспензий спор вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и кандидатного штамма 363/11 в дозе 107 спор предохраняло от гибели 80-100 % животных, зараженных споровыми культурами капсулообразующих штаммов B. anthracis 71/12, 76, 17JB и Carbovax в дозе 200 ЛД 50. Однако в экспериментах с использованием в качестве заражающих культур вирулентных полевых изолятов B. anthracis была выявлена существенная разница в уровнях протективной эффективности исследуемых штаммов. Иммунизация животных штаммом B. anthracis 363/11 защищала 100, 50 и 40 % морских свинок от заражения штаммами B. anthracis 81, 304, 364 соответственно, но при этом процент защиты животных, вакцинированных штаммом B. anthracis 55-ВНИИВВиМ, для указанных полевых изолятов
2017, issue 2
85
составил 40, 25 и 10 % соответственно.
Различие в протективной эффективности штаммов было подтверждено и в опытах на овцах в возрасте 1-1,5 года, ранее не привитых против сибирской язвы. Введение овцам споровых суспензий штамма B. anthracis 363/11 в дозе 12,5 106 спор защищало животных от заражения высоковирулентными полевыми штаммами B. anthracis 76, 81 и 364 не менее чем в 10 безусловно смертельных дозах для этого вида животных. Вакцинация овец штаммом 55-ВНИИВВиМ защитила от гибели только животных, зараженных штаммом B. anthracis 76. В остальных группах животные заболели и пали на 3-5-е сутки с симптомами острой формы сибирской язвы.
Оценку стабильности сохранения штаммом B. anthracis 363/11 биологических, протективных свойств и вероятности реверсии проводили с использованием метода последовательных пассажей на питательных средах. Установлено, что после 3-го пассажа у культуры начинает снижаться ферментативная активность, остаточная вирулентность и им-муногенность. Так, к 7-му пассажу вирулентность штамма для белых аутбредных мышей снизилась в 23 раза - показатель ЛД50 возрос с 3,16105 до 7,28 106 спор. Иммуногенная активность против штаммов B. anthracis 71/12 и СагЬоуах также снизилась более чем в 30 раз - показатели ИД50 возросли с 2,9104 до 1,0106 спор и с 1,55 105 до 8,4106 спор соответственно. Полученные результаты свидетельствуют не только о безопасности кандидатного штамма, но и о необходимости проведения дальнейших исследований по оптимизации системы его культивирования и поддержания в активном состоянии.
таким образом, в результате исследований, направленных на поиск новых сибиреязвенных штаммов, обладающих более широким спектром защитного действия, чем применяемые в настоящее время, и пригодных для разработки эффективных средств специфической профилактики, установлено, что природный естественно аттенуированный моноплаз-мидный бескапсульный штамм B. anthracis 363/11, выделенный от павшего подсвинка, обладает про-тективными свойствами, позволяющими отнести его к кандидатным для разработки и совершенствования средств специфической профилактики сибирской
язвы. Данные экспериментов с использованием биологических моделей свидетельствуют о его высоких иммуногенных свойствах, превышающих таковые вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, и его перспективности в качестве кандидата для разработки вакцины для нужд ветеринарии.
финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО в рамках выполнения научной темы № 0615-2016-0001.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Егорова И.Ю., Севских Т. А., Селянинов Ю.О. Иммунобиологические свойства нового бескапсульного штамма Bacillus anthracis 363/11. Биотехнология. 2015; 5:34-41.
2. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А., Маничев А.А., Бастаров С.И., Саленко Л.С., Яковлева Т.Н., Степанова В.В., Шморгун Б.И., Киселев Ю.Т., Сайиткулов Б.С. Опыт профилактики сибирской язвы у сельскохозяйственных животных в России. Ветеринария. 1995; 5:27-30.
3. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов A.B., Старицын H.A., Померанцев А.П., Алешкин B.A. Микробиологическая диагностика сибирской язвы. М.: ВУНМЦ МЗ РФ; 1999. 224 с.
4. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th Edition. 2012. Vol. 1, Chapter 2.1.1. Anthrax. P. 87-97.
References
1. Egorova I.Yu., Sevskikh T.A., Selyaninov Yu.O. [Immunobiological properties of a new non-capsular Bacillus anthracis 363/11 strain]. Biotekhnologiya. 2015; 5:34-41.
2. Ipatenko N.G., Gavrilov V.A., Manichev A.A., Bastarov S.I., Salenko L.S., Yakovleva T.N., Stepanova V.V., Shmorgun B.I., Kiselev Yu.T., Sayitkulov B.S. [Experience in prophylaxis of anthrax in livestock animals in Russia]. Veterinariya. 1995; 5:27-30.
3. Marinin L.I., Onishchenko G.G., Stepanov A.V., Staritsyn N.A., Pomerantsev A.P., Aleshkin V.A. [Microbiological Diagnostics of Anthrax]. M.; 1999. 224 p.
4. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th Edition. 2012. Vol. 1, Chapter 2.1.1. Anthrax. P. 87-97.
Authors:
Sevskikh ТА., Selyaninov Yu.O., Egorova I.Yu. National Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology, Russian Academy of Agricultural Science. 1, Akademika Bakulova St., Settlement Volginsky, Vladimir Region, 601125, Russian Federation. E-mail: VNIIVViM@niiv. petush.elcom.ru.
об авторах:
Севских Т.А., Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю. Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии. Российская Федерация, 601125, Владимирская обл., Петушинский р-н, пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, стр. 1. E-mail: VNIIVViM@niiv.petush.elcom.ru.
Поступила 29.12.16.
