CC BY
897
ЛИТЕРАТУРА
1. Балахонов С. В., Воронова Г. А., Шестопалов М. Ю. и др. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2000; 3: 29-31.
2. Куличенко А. К., Норкина О. В., Гинцбург А. Л. и др. Генетика. 1994; 30 (7): 167-71.
3. Методические указания по отлову, учету и прогнозу численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах инфекций. М.: Информационно-издательский центр Минздрава России; 2001. 88 с.
4. МУ 3.1.2007-01. Методические указания по сбору, учету и подготовке к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций. М.: Информационно-издательский центр Минздрава России; 2001. 63 с.
5. Трухачев А. Л., ИвановаB. C., Арсеньева Т. Е. и др. Клиническая лабораторная диагностика. 2008; 12: 49-52.
6. Campbell J., Lowe J., Walz S. et al. J. Clin. Microbiol. 1993; 31 (2): 758-9.
7. Hinnebusch J., Schwan T. G. J. Clin. Microbiol. 1993; 31 (6): 1511-4.
8. Matero P., Pasanen Т., Laukkanen R. et al. APMIS. 2009; 117 (1): 34-44.
9. Neubauer H., Meyer H., Prior J. et al. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Publ. Health. 2000; 47 (8): 573-80.
10. Radnedge L., Gamez-Chin S., McCready P. M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67 (8): 3759-62.
11. WoronA. M., NdzarianE. J., Egan C. et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2006; 56 (3): 261-8.
Поступила 11.05.12
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2013
УДК 616.155.392.2-036.12-07]:577.21.08
Т. Е. Сизикова, Е. в. мельникова, А. в. маношкин, А. А. Петров, Д. Г. мельников, в. Б. Пантюхов, в. Н. Лебедев, С. в. Борисевич
использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции
Научно-исследовательский центр ФБУ 33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
При постановке полимеразной цепной реакции для обеспечения достоверности полученных результатов используют внешние или внутренние контрольные образцы. С помощью внешних контрольных образцов устанавливают работоспособность реагентов, входящих в состав диагностического набора. Внутренние контрольные образцы позволяют контролировать не только все стадии реакции, но и ход амплификации в каждой индивидуальной пробирке с реакционной смесью.
Ключевые слова: положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, внутренний контрольный образец, обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция
T.Ye. Syzykova, Ye.V. Melnikova, A.V. Manoshkin, A.A. Petrov, D.G. Melnikov, V.B. Pantyukhov, V.N. Lebedev, S.V. Borisevitch THE APPLICATION OF EXTERNAL AND INTERNAL CONTROL OBJECTS IN CASE OF USING OF POLYMERASE CHAIN REACTION AND REVERSE TRANSCRIPTION OF POLYMERASE CHAIN
REACTION
The external and internal control samples are used in case ofpolymerase chain reaction application to ensure validity of results. The external control samples are used to establish operability of reagents included into diagnostic kit. The internal control samples make it possible to check not only all the stages of reaction but also the process of amplification in each individual test tube with reaction mixture.
Key words: positive control .sample, negative control .sample, internal control sample, reverse transcription, polymerase chain reaction
К любому используемому в лабораторной практике диагностическому набору для выявления и идентификации того или иного возбудителя в биологических пробах предъявляют ряд универсальных требований. Это чувствительный специфичный метод выявления возбудителя; удобство и простота использования; стабильность всех компонентов, необходимых для проведения анализа, в течение длительного времени; воспроизводимость результатов анализа независимо от используемой серии
Для корреспонденции: Сизикова Т. Е., канд. биол. наук
Адрес: 141306, Московская обл., Сергиев Посад, ул. Октябрьская, 6 Телефон: (496)552-12-06
набора реагентов; минимизация влияния так называемого человеческого фактора [3].
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для РНК-содержащих вирусов, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью, предъявляет определенные требования к выполнению всех этапов постановки анализа, начиная от взятия клинического материала и заканчивая регистрацией продуктов амплификации. Ошибка на любом из этих этапов может привести к неправильному результату анализа и как возможное следствие к ошибочному диагнозу [3, 15, 16].
Использование как внешних, так и внутренних контрольных образцов позволяет контролировать не только все стадии прохождения реакции, но и ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Изложен-
ное определяет актуальность настоящей работы, целью которой является использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке ПЦР и ОТ-ПЦР.
При проведении ПЦР и ОТ-ПЦР для получения достоверных результатов, а также для стандартизации диагностических наборов в целом необходимо наличие положительного и отрицательного контрольных образцов
[3].
В качестве положительного контрольного образца (ПКО) выявляемого возбудителя используют препарат, содержащий выявляемые нуклеотидные последовательности (ген-эквиваленты) [8].
В качестве отрицательного контрольного образца используют препарат, не содержащий ни специфические нуклеиновые кислоты, ни компоненты реакционной смеси [8].
Имея данные о том, как прошла ПЦР с указанными контрольными образцами, можно судить о том, насколько правильно была поставлена реакция амплификации, существует ли контаминация реагентов продуктами амплификации и т. д.
Используемые в настоящее время при постановке ПЦР контрольные образцы можно разделить на две группы. Это внешние контрольные образцы (которые используют в параллельных экспериментах одновременно с исследуемой пробой) и внутренние контрольные образцы (которые добавляют непосредственно в реакционную смесь вместе с исследуемой пробой) [8, 10].
Рассмотрим различные виды внешних контрольных образцов, используемых при постановке ПЦР.
ПКО является одним из специфических компонентов наборов реагентов. Оптимальным вариантом внешнего ПКО является использование в качестве последнего сертифицированной культуры выявляемого возбудителя. Вместе с тем в наборах, предназначенных, например, для выявления и идентификации возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, такой вариант ПКО значительно уменьшает возможность использования указанных наборов реагентов вне специализированных лабораторий, имеющих соответствующий уровень безопасности. В связи с этим в общем случае использование в качестве ПКО нативных возбудителей нецелесообразно [1, 6].
В ранее разработанных на базе ФБУ 33 ЦНИИИ МО РФ ОТ-ПЦР-наборах реагентов для выявления РНК возбудителей аренавирусных и филовирусных геморрагических лихорадок в качестве ПКО использовали инактивированные 0,05% формальдегидом антигены [7]. Присутствие, однако, при постановке ОТ-ПЦР в исследуемой пробе даже незначительных концентраций формальдегида негативно влияет на специфичность реакции. Кроме того, использование такого рода ПКО предполагает периодическую (с учетом срока хранения ранее разработанных наборов 6 мес не реже двух раз в год) работу с биологически активными возбудителями, включающую такие биологически опасные процедуры, как наработка биомассы, концентрирование и очистка вируса.
Возможно также использование в качестве ПКО собственно ампликонов с выявляемых консервативных генов, однако нестабильность таких препаратов ограничивает срок их применения до нескольких недель.
Успехи молекулярной биологии и генной инженерии способствуют появлению на рынке все новой соответствующей продукции, отвечающей разнообразным требованиям исследователей. Ведущими фирмами-производителями в этой области являются "Promega" (США),
"sigma" (США), "Invitrogen" (США) и др. Векторные плазмиды в настоящее время применяют в широком диапазоне молекулярно-биологических, генетических и биотехнологических исследований (для клонирования генов цитокинов, последовательностей других белков, для проверки силы действия различных регуляторных элементов и т. д.).
Использование плазмид, содержащих соответствующие нуклеотидные последовательности, в качестве ПКО для комплектации диагностических наборов получило в последнее время широкое распространение. Например, специалистами ФБУ 33-й ЦНИИИ МО РФ была показана возможность получения ПКО на основе коммерческого вектора pGlow ТОРО ("invitrogen") [4]. Набор ТОРО Reporter Kits обеспечивает высокоэффективное быстрое одношаговое клонирование для прямой встройки последовательностей, амплифицируемых Таq-полимеразой в векторе. Таq-полимераза имеет независимую от фрагмента терминальную трансферазную активность и добавляет единичный диоксиаденозин к 3'-концу ПЦР-продуктов. Линейный вектор pGIow ТОРО имеет единичные выступающие 3'-диокситимидиновые остатки. Это позволяет ПЦР-продуктам эффективно сшиваться с вектором. В указанной системе используется лигазная активность топоизомеразы i при активации [2].
Использование этой системы для ПКО позволяет получать конструкцию, содержащую необходимую последовательность при проведении несложных процедур в обычных условиях в течение минимального времени (лигирование вектора с ПЦР-продуктом происходит в течение 5 мин при комнатной температуре). К тому же работа с активным материалом при получении ПКО на основе плазмид проводится единовременно лишь на первом этапе инактивации вируса и получения его кДНК для выделения в ПЦР консервативного гена. После получения самой конструкции, которое по времени занимает около 3 сут, и ее трансформации в бактериальные клетки Escherichia coli выделение плазмидной ДНК «классическими» методами занимает 2 сут, а хранение клеток осуществляется при добавлении 50% глицерина при температуре -20oc в течение 2 лет без пересева. Освежение же культуры необходимо производить каждые 2 года. Таким образом, культура может храниться неограниченное время, что делает удобным получение требуемого количества ПКО за короткий промежуток времени [9].
ПКО позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. В то же время препарат ДНК, подготовленный к ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Таким образом, наличия только ПКО и отрицательного контрольного образца недостаточно для того, чтобы определить степень эффективного выделения ДНК в каждом варианте опыта. Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этой цели используют дополнительный так называемый внутренний контроль. Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных наборов реагентов иногда используют, например, Р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций «пришивают» участки ДНК, гомологичные прайме-рам, входящим в состав тест-системы [9].
Добавление внутреннего контрольного образца на стадии выделения ДНК позволяет определить, насколько эффективно произошло выделение ДНК в каждой конкретной пробирке. Использование внутреннего контрольного образца именно на стадии выделения ДНК позволяет получить максимально полную информацию о возможной ошибке в работе. Так, при использовании его только на этапе амплификации можно судить лишь о присутствии или о наличии ингибиторов ПЦР в реакционной смеси, тогда как неэффективное выделение ДНК не будет обнаружено [9, 10].
Если внутренний контрольный образец внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контрольного образца подбирают таким образом, чтобы он был в 2 раза и более больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате при внесении ДНК внутреннего контрольного образца реакционную смесь вместе с испытуемым образцом независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце внутренний контрольный образец станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если амплико-ны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контрольного образца, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК [9, 10].
К сожалению, несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный недостаток. Если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с внутренним контрольным образцом за праймеры. Это принципиально важно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце, что может приводить к ложноотрицательным результатам [3, 8, 10, 18]. Тем не менее при условии решения проблемы конкуренции за праймеры этот способ контроля эффективности амплификации, безусловно, будет весьма полезен.
Внутренний контрольный образец подбирают с учетом конкретного предназначения ПЦР и модификации реакции.
Например, при выявлении РНК-содержащих вирусов с помощью ОТ-ПЦР (при использовании в качестве ПКО кДНК амплифицируемого фрагмента) отсутствует возможность контроля стадии обратной транскрипции. Для обеспечения контроля этой стадии необходимо использовать препарат, содержащий специфическую РНК.
Препараты геномной РНК не могут быть эффективно использованы в указанном качестве в силу их низкой стабильности [10]. Поэтому в качестве внутреннего контрольного образца при выявлении и идентификации РНК-содержащих вирусов с помощью ПЦР в последнее время широко используют так называемую армированную РНК [11, 14, 15, 17, 18].
В работе Х.-Е Уи и соавт. [18] описано приготовление «армированной» РНК, используемой в качестве внутреннего ПКО в мультиплексной тест-системе для выявления вирусов гриппа и вируса тяжелого острого респираторного синдрома с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.
Методика приготовления «армированной» РНК включает следующие этапы:
• получение выбранного кДНК-фрагмента геномной РНК возбудителя;
• получение ДНК-фрагмента, содержащего информацию о синтезе белка оболочки фага MS2;
• амплификацию указанных фрагментов и встраивание их в плазмиду pMS27;
• трансформацию рекомбинантной плазмиды клеток Е. coli, штамм BL21 (DE3);
• индукцию экспрессии белка оболочки фага MS2 изопропил-Р^-тиогалактопиранозидом;
• осаждение клеток Е. coli;
• инкубацию супернатанта с избытком ДНКаз и/или РНКаз;
• проверку полученного продукта с помощью электрофореза;
• очистку полученного комплекса РНК-белок с помощью электроэлюции в агарозном геле;
• проверку конечного продукта в ОТ-ПЦР в реальном времени.
Конечный продукт представляет собой фрагменты специфических РНК, упакованные в белок оболочки фага Ms-2 («армированную» РНК).
Ввиду того что вторичная структура «армированной» РНК является более упорядоченной, чем у нативной РНК, полученной в ходе проведения пробоподготовки, пределом разрешения мультиплексной ОТ-ПЦР является концентрация 10 ген-эквивалентов «армированной» РНК в миллилитрах [17].
J. Dreier и соавт. [12] в качестве внутреннего контрольного образца при постановке ОТ-ПЦР для выявления вируса гепатита С использовали бактериофаг Ms2, представляющий собой икосаэдрический бактериофаг диаметром 27-34 нм, относящийся, согласно принятой в настоящее время классификации, к группе IV вирусов [вирусы с одноцепочечной (+) РНК], семейству Leviviridae, роду Levivirus. Бактериофаг MS2 имеет геном размером 3569 нуклеотидов [13].
В работе использовали штамм DSM13767 фага MS2. Фаг выращивали в E. coli (штамм XL10-Gold, продуцирующий F-плазмиды) в агаре по методу бляшек. Полученная культура фага имела концентрацию 6,0 • 1010 БОЕ • мл-1, что соответствует 6,0 • 1012 молекул РНК • мл-1. Полученную культуру в качестве внутреннего контроля вводили в исследуемые пробы плазмы крови.
При постановке ПЦР в реакционную смесь добавляли специфические праймеры для вируса гепатита С и бактериофага MS2. Внутренний контроль использовали в качестве варианта сравнения при анализе клинических проб. Использованный авторами внутренний контрольный образец стабилен при хранении даже при комнатной температуре.
Фирмой «АмплиСенс» разработан универсальный внутренний контрольный образец [5]. Его универсальность заключается в том, что в одной пробирке содержится сразу несколько отдельных внутренних контрольных образцов, каждый из которых работает с одной из семи различных тест-систем для выявления Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Herpes simplex virus, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis.
Особенностью препарата является возможность включения в его состав внутренних контрольных образцов для любого количества наборов реагентов, что позволяет решить проблему добавления в пробы, которые в дальнейшем будут подвергаться процедуре выделения ДНК, различных внутренних контрольных образцов в зависимости от выявляемых возбудителей [5].
Отличительной особенностью препарата является то, что он представляет собой не плазмидную ДНК, а модифицированный с помощью генно-инженерных манипуляций фаг X. Использование фага X позволяет предъявлять более низкие требования к условиям хранения препарата по сравнению с плазмидной ДНК. Препарат, в котором ДНК защищена от действия нуклеаз белковой оболочкой вириона, может храниться гораздо более длительное время, чем обычная ДНК [5].
Каждый отдельный внутренний контрольный образец, входящий в состав препарата, имеет строго выверенную структуру, GC-состав, длину и концентрацию. Таким образом, даже при низких концентрациях выделенной ДНК возбудителя внутренний контрольный образец не уменьшает образования специфического продукта. Вместе с тем количество добавляемого при выделении ДНК препарата достаточно для того, чтобы при правильном выделении внутренний контрольный образец выявлялся бы во всех анализируемых пробах.
Для точного определения количества копий ДНК (геномных эквивалентов) был использован метод лимитирующих разведений, который в сочетании с рядом аналитических математических методик позволяет получать точные значения количества копий ДНК в пробе. Методика описана в литературе и с успехом используется для определения количества ДНК-матрицы в ПЦР. Перед началом работы проводят последовательные разведения ДНК-матрицы, которые используют для постановки реакции амплификации. Полученные ампликоны используют в качестве матрицы в «гнездовой» ПЦР, чувствительность которой достигает 1 молекулы ДНК в реакции. Затем данные обрабатывают с помощью статистической аналитической программы Quality, которая позволяет определить количество копий ДНК в реакции, а также ряд параметров, позволяющих оценить достоверность полученного результата: стандартную ошибку, критерий сопряженности %2 и т. д.
Разработанная методика позволяет изготовлять препарат - универсальный внутренний контрольный образец со стандартизованным количественным и качественным составом в каждой партии [5].
Универсальный внутренний контрольный образец добавляют в количестве 10 мкл препарата в 300 мкл лизирующего раствора непосредственно перед добавлением пробы. Дальнейшее выделение ДНК происходит по обычной методике. После регистрации продуктов амплификации полоса, соответствующая внутреннему контрольному образцу, должна проявиться во всех пробах, в которые был добавлен препарат. Отсутствие этой полосы может свидетельствовать об ошибках на стадии выделения ДНК либо на стадии амплификации ДНК. В таких случаях необходимо поставить ПЦР с ДНК, выделенной из той же пробы еще раз, при повторном отсутствии полосы внутреннего контрольного образца необходимо провести повторное выделение пробы [5].
Таким образом, одной из тенденций повышения достоверности результатов ПЦР-анализа, а также стандар-
тизации диагностических наборов в целом в настоящее время является использование как внешних, так внутренних контрольных образцов, которые позволяют контролировать не только все стадии прохождения реакции, но и ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Микробиология. Воробьев А. В., Быков А. С., Пашков Е. П. и др. 2-е изд. М.: Медицина; 2003.
2. Инструкция по применению набора pGlow ТОРО ТА Expression kit, cat. N К 4830-01, Invitrogen.
3. Нетесов С. В., МарковичН. А. Сравнительная оценка современных методов диагностики вирусных инфекций. Молекулярная медицина. 2008; 5: 41-7.
4. Пат. 2300564, RU 2300564 С1. Штамм А/БАК/Россия/05 вируса птичьего гриппа, подтип H5N1, предназначенный для разработки средств и методов биологической защиты. Марков В. И., Меркулов В. А., Лыков М. В., Кулиш В. С., Степанов Н. Н., Ко-конова М. С., Бережной A. М., Мельников Д. Г., Онищенко Г. Г., Васильев Н. Т., Максимов В. А. (Россия).
5. Разработка внутреннего контроля для ПЦР. Интерлабсервис Ам-лисенс. URL: http://www.amlisence.control.7174 htlm (дата обращения 30.09.2010).
6. Сайт «Методические руководства по генетической инженерии (США). URL: http://www.molbio.net/ (дата обращения: 29.02.2010).
7. Степанов Н. Н., Лукин Е. П., Меркулов В. А. и др. Опыт применения молекулярно-биологических методов выявления возбудителей опасных вирусных инфекций, редких для территории России. Военно-медицинский журнал. 2007; 328 (9): 57-63.
8. Brown D., Pasloske B. L. Ribonuclease-resistant RNA controls and standarts. Meth. Enzymol. 2002; 3410: 648-54.
9. Cheng Y. et al. Preparation of His-tagged RNA phage particles as a control for real time RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 3557-61.
10. Das A. E. et al. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influence virus by real time RT-PCR. J. Clin. Mi-crobiol. 2006; 44: 3065-73.
11. DoniaD. Use of armored RNA as a standart to construct a calibration curve for by real time RT-PCR. J. Virol. Meth. 2005; 126: 157-63.
12. Drier J. et al. Use of bacteriophage MS2 as internal control in viral RT-PCR assays. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 4551-7.
13. Fiers W. et al. Complete nucleotide sequence of bacteriophage MS2 RNA: primary and secondary structure of the replicase gene. Nature. 1976; 260: 500-7.
14. Hietala S. K. et al. Crossley В. M. Armored RNA as virus surrogate in real time RT-PCR assay proficiency panel. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 67-70.
15. Hoorfar J. B. Practical considerationsin design of international amplification controls for diagnostic PCR assays. J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 1863-8.
16. NeustersH. G. M. Clinical virology in real time. J. Clin. Virol. 2002; 25: 3-12.
17. Rosenstraus M. Z. et al. An internal control for routine diagnostic PCR: design, properties, and effect on clinical performance. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 191-7.
18. Yu X.-F. et al. Preparation of armored RNA for multiplex real time RT-PCR detection of influencevirus and sARs coronavirus. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 837-41.
Поступила 13.06.12
