CC BY
35
DOI: 10.21055/0370-1069-2018-4-39-47
УДК 578.2
В.Г. дедков1, м.В. сафонова2, Е.В. найденова3, N.F. Magassouba4, А.А. Айгинин5, B. Soropogui4, F. Kourouma4, A.B. Camara4, J. Camara4, А.А. крицкий3, м.Ю. Щелканов6, В.В. малеев5
разработка и испытание метода выявления рнк вируса ласса на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
в режиме реального времени
1ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера», Санкт-Петербург, Российская Федерация; 2ФКУЗ «Противочумный центр», Москва, Российская Федерация; 3ФКУЗ «Российский научно-
исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация; 4Университет им. Гамаль Абдель Насера, Конакри, Гвинейская Республика; 5ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Москва,
Российская Федерация;6Дальневосточный Федеральный университет, Владивосток, Российская Федерация
цель. Разработка метода выявления и количественного анализа (ОТ-ПЦР в реальном времени) для выявления генетических маркеров вируса Ласса - LASV-Fl. материалы и методы. Для работы взяты все доступные в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) последовательности вируса Ласса, которые были выровнены для идентификации консервативных сайтов с использованием программного пакета BioEdit 7.2.5 (IbisBiosciences, США). Для апробации разработанного ПЦР-набора была использована контрольная панель РНК вируса Ласса и псевдовирусных частиц, 27 вирусных штаммов, относящихся к различным семействам, а также 37 образцов сывороток крови от пациентов с лихорадочными заболеваниями, отобранных в лечебных учреждениях Республики Гвинея в 2016-2018 гг., и 55 проб суспензий органов от многососковых мышей. результаты и обсуждение. Аналитическая чувствительность метода варьировала от 103 до 105 копий/мл и имела 96,4 % диагностическую чувствительность, тогда как аналитическая и диагностическая специфичность составляли 100 %. Показано, что разработанная методика может быть успешно применена на практике для обнаружения вируса Ласса в гвинейской Республике, с использованием различных типов материала от мелких млекопитающих, включая цельную кровь и суспензии органов M. natalensis, а также образцы сывороток крови людей, собранных через 3-7 дней после начала заболевания. Сделано также предположение, что данный метод может быть использован для штаммов вируса Ласса, распространенных не только в Гвинее, но и на других эндемичных территориях, но данный факт необходимо подтвердить в дальнейших исследованиях.
Ключевые слова: вирус Ласса, лихорадка Ласса, ОТ-ПЦР в реальном времени, Гвинейская Республика.
Корреспондирующий автор: Дедков Владимир Георгиевич, e-mail: vgdedkov@yandex.ru.
Для цитирования: Дедков В.Г, Сафонова М.В., Найденова Е.В., Magassouba N.F., Айгинин А.А., Soropogui B., Kourouma F., Camara A.B., Camara J., Крицкий А.А., Щелканов М.Ю., Малеев В.В. Разработка и испытание метода выявления РНК вируса Ласса на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; 4:39-47. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-4-39-47
V.G. Dedkov1, M.V. Safonova2, E.V. Naidenova3, N.F. Magassouba4, A.A. Ayginin5, B. Soropogui4, F. Kourouma4, A.B. Camara4, J. Camara4, A.A. Kritsky3, M.Yu. Shchelkanov6, V.V. Maleev5
Development and Testing of the Method for the Detection of Lassa virus RNA, Based on real-Time Polymerase Chain reaction with reverse Transcription
1 Saint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Saint-Petersburg, Russian Federation; 2Plague Control Center, Moscow, Russian Federation; 3Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation; 4Gamal Abdel Naser University, Conakry, Republic of Guinea; 5Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russian Federation; 6Far East Federal University, Vladivostok, Russian Federation
Abstract. Objective of the study was the development of a method for the detection and quantitative analysis (realtime RT-PCR) to identify genetic markers of Lassa virus - LASV-Fl. Materials and methods. We utilized all the available in the GenBank database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) Lassa virus sequences that have been aligned to identify conservative sites applying the BioEdit 7.2.5 software package (IbisBiosciences, USA). To test the developed PCR kit, the control panel of Lassa virus RNA and pseudo-viral particles, 27 viral strains belonging to different families, as well as 37 serum samples from patients with feverish diseases selected in medical institutions of the Republic of Guinea in 2016-2018 and 55 samples of organ suspensions from multi-spiked mice were used. Results and discussion. The analytical sensitivity of the method varied from 103 copies/ml to 105 copies/ml and had 96.4 % diagnostic sensitivity, while the analytical and diagnostic specificity was 100 %. It is shown that the developed technique can be successfully introduced into practice for the detection of Lassa virus in the Republic of Guinea, using various types of material from small mammals, including whole blood and organ suspensions of M. natalensis, as well as samples of human blood sera collected 3-7 days after the onset of the disease. It is also suggested that this method can be used for strains of Lassa virus, common not only in Guinea but also in other endemic areas, but this fact must be confirmed in further studies.
Keywords: Lassa virus, Lassa fever, real-time RT-PCR, Republic of Guinea.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Vladimir G. Dedkov, e-mail: vgdedkov@yandex.ru.
Citation: Dedkov V.G., Safonova M.V., Naidenova E.V., Magassouba N.F., Ayginin A.A., Soropogui B., Kourouma F., Camara A.B., Camara J., Kritsky A.A.,
Shchelkanov M.Yu., Maleev V.V. Development and Testing of the Method for the Detection of Lassa Virus RNA, Based on Real-Time Polymerase Chain Reaction with Reverse Transcription. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2018; 4:39-47. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-10692018-4-39-47
Received 03.12.18. Accepted 10.12.18.
Вирус Ласса (LASV) представляет собой одно-цепочечный вирус с амбивалентной РНК, принадлежащий к семейству Лгепаутёае. Известно, что данный возбудитель вызывает у людей острую геморрагическую лихорадку (лихорадка Ласса), которая характеризуется повышением температуры, миалгией, тошнотой, рвотой, болью в груди и брюшной полости [1, 2]. Не является редкостью мягкое проявление лихорадки Ласса и бессимптомное течение инфекции [3, 4]. Естественные хозяева вируса в природе - многососковые мыши (Mаstomis natalensis). Эти грызуны повсеместно распространены на Африканском континенте [5, 6], но лихорадка Ласса является эндемичной только для стран Западной Африки, включая Нигерию, Сьерра-Леоне, Либерию, Гвинею, Бенин, Мали и Кот-д'Ивуар [3, 7]. Годовая заболеваемость варьирует от 300000 до 500000 случаев, каждый год умирает около 5000 человек [2]. Чаще всего заражение происходит при вдыхании или проглатывании испражнений зараженных грызунов. Болезнь также может развиться при употреблении в пищу М. natalensis, поскольку они являются деликатесом в Западно-Африканском регионе [8]. Сообщалось также о передаче инфекции от человека человеку, особенно в условиях медицинских стационаров [9].
Лихорадка Ласса, учитывая высокую заболеваемость и смертность, является большой проблемой для регионального здравоохранения в Западной Африке. Более того, данная инфекционная болезнь является одной из наиболее частых импортируемых экзотических лихорадок [10], в связи с чем очень важна разработка быстрых и чувствительных методов для выявления ее возбудителя.
Традиционно диагностика лихорадки Ласса осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), иммуно-хроматографическим методом (ИХА) и методом им-муноферментного анализа (ИФА), однако на ранней стадии заболевания от-пцр является наиболее эффективной [11]. Таким образом, разработка методов для выявления рНк вируса Ласса - важный этап для улучшения диагностики вызываемого им заболевания, а также для наблюдения и эпидемиологического контроля данной инфекционной болезни [12].
Целью настоящей работы стало создание и испытание одношагового количественного метода, основанного на ОТ-ПЦР в режиме реального времени, для выявления РНК вируса Ласса. Данная методика позволяет выявлять разные генетические варианты возбудителя.
Материалы и методы
Образцы, использованные в исследовании. Образцы цельной крови от М. natalensis (20 индиви-
дуальных образцов, 8 пулов из 3 животных), а также сыворотки крови людей (37 образцов) предоставлены для исследования сотрудниками вирусологической лаборатории Университета им. Гамаль Абдель Насера (г. Конакри, Гвинейская Республика). Другая часть биологических образцов (суспензия легкого и селезенки) от M. natalensis (27 экземпляров) взята специалистами Российско-Гвинейского центра эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней. Сбор материала и подготовку проб проводили в соответствии с общепринятыми методиками.
Вирусную РНК из цельной крови M. natalensis экстрагировали с использованием набора QIAmp (Qiagen, Германия) согласно инструкциям производителя. Экстракцию нуклеиновых кислот из остальных образцов проводили с использованием комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия).
Идентификация консервативных участков. Для работы были взяты все доступные в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen-bank/) последовательности вируса Ласса, которые были выровнены для идентификации консервативных сайтов с использованием программного пакета BioEdit 7.2.5 (IbisBiosciences, США). В качестве мишени для амплификации с помощью программы PLOTCON (http://emboss.bioinformatics.nl/ cgi-bin/ emboss /plotcon) выбран фрагмент L-гена размером 119 н.п. (позиция 106-225 в контрольной последовательности вируса Ласса, штамм Josiah, JN650518) [13, 14, 15].
Реакционная смесь и режим амплификации. Реакцию ОТ-ПЦР в режиме реального времени проводили в объеме 25 мкл, из которых: 10 мкл - образец выделенной РНК; 0,2 мкМ каждого праймера и зондов (LVL-forw1, LVL-forw2, LVL-rev1, LVL-rev2, LVL-prb1a, lvl-prb1b, lvl-prb1c) и 0,12 мкМ каждого IC-forwA, IC-revA, IC-prbA, 2,5 мкл dNTP; 5 мкл RT-PCRmix2 FEP/FRT; 0,25 мкл обратной транскрипта-зы MMLV; 0,25 мкл RTG-mix2 и 0,5 мкл полимеразы TaqF. В работе использованы реактивы производства компании«AmpliSens» Россия.
Параметры амплификации следующие: 50 °С в течение 15 мин, 95 °С - 15 мин, а затем 95 °С - 10 с, 55 °С - 20 с - 42 цикла. Флуоресценция наблюдалась при 55 °C. Результаты реакции считались положительными, если был пересечен пороговый уровень флуоресценции.
Для контроля ПЦР и реакции обратной транскрипции сконструированы положительные контрольные образцы (К+) и (ПКО). Для мониторинга экстракции РНК использовали коммерческий внутренний контроль IC-Fl (AmpliSens, Россия). Кроме того, для исключения ложноположительных результатов предусмотрен отрицательный контроль ПЦР
(K-) и отрицательный контроль выделения (ОКО).
Создание положительных контрольных образцов. Фрагмент кДНК (126 п.о.), эквивалентный последовательности L-гена вируса Ласса (штамм Josiah), включающий последовательности прайме-ров и флуоресцентных зондов, получен с использованием ступенчатой амплификации по методике, описанной ранее [16]. Конечный продукт ПЦР очищали с использованием набора для экстракции из геля MinElute (Qiagen, Германия), лигировали в плазмидный вектор pGEM-T (Promega, США) и трансформировали в Escherichia coli (штамм XL1-Blue) [17]. Рекомбинантные плазмиды из отдельных клонов выделяли с набором PlasmidMiniprep (Axygen, США), ориентацию и отсутствие мутаций в клонированном фрагменте пцр определяли сек-венированием по методу Сэнгера. Растворенные плазмиды известных концентраций использовали в качестве положительного контроля для оценки эффективности стадии ПЦР.
Та же область кДНК применялась и для получения ПКО на основе ранее описанной процедуры для защищенных псевдовирусных частиц на основе MS2-фага [2] с некоторыми незначительными модификациями [18, 19]. Таким образом, фрагмент пцР, содержащий область мишени и дополнительные фланкирующие нуклеотиды, лигировали в линеаризованный плазмидный вектор, содержащий ген белка оболочки MS2. после проверки полученную рекомбинантную плазмиду трансформировали в E. coli (штамм B21) и экспрессию белка индуцировали изопропил^-тио^-галактопиранозидом (IPTG). После индукции клетки собирали, лизирова-ли, используя способ, включающий обработку лизо-цимом и замораживание-оттаивание, обрабатывали ДНКазой I и РНКазой А (Fermentas, США). Затем дериват очищали с помощью центрифугирования в градиенте CsCl, определяли количественно и разбавляли в стабилизирующем растворе (LifeTechnologies, США). Отсутствие остаточной ДНК в обработанном образце проверяли с использованием разработанного метода ПЦР в реальном времени без стадии обратной транскрипции. Концентрации К+ и ПКО измеряли с помощью системы QX100 с использованием набора PCM Supermix для зондов и одноступенчатого набора ddPCR Supermix для зондов (Bio-Rad, США), специфических праймеров и соответствующих зондов, согласно инструкциям изготовителя.
Внутренний контрольный образец. Для оценки эффективности экстракции РНК к смеси реагентов добавлен экзогенный внутренний контроль IC-Fl (AmpliSens, Россия), представляющий искусственную последовательность РНК (150-170 п.о., содержание GC - 50 %), окруженную полученным на основе MS2 фага защитным белковым слоем.
Аналитическая чувствительность. Для проведения работы использовали штамм Josiah вируса Ласса. Инактивацию и оценку концентрации вирусных частиц проводили в Центре вирусологии и био-
технологии «Вектор» (Кольцово, Новосибирская область). Защищенные псевдовирусные частицы синтезированы в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва).
Аналитическую чувствительность оценивали с использованием серии 10-кратных разведений псевдовирусных частиц и штамма Josiah вируса Ласса, для чего к известным разведениям добавляли интакт-ную человеческую сыворотку до конечного объема 100 мкл, экстрагировали с использованием набора для экстракции «Рибо-преп» (AmpliSens, Россия), а затем проверяли в трех повторах с использованием разработанной методики, чтобы определить стандартные кривые и пределы детекции [20].
Аналитическая специфичность. Потенциальную перекрестную реактивность оценивали с использованием высокотитражных растворов вирусной РНК и ДНК представителей 27 видов вирусов, принадлежащих к 13 семействам, которые входят в коллекцию ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Диагностическая чувствительность и специфичность. Чувствительность и специфичность метода определяли с использованием образцов сыворотки от пациентов с клиническими симптомами лихорадки, которые были определены как ласса-позитивные (18), а также изучены отрицательные на вирус Ласса образцы (19) и дополнительно образцы цельной крови и тканей от M. natalensis (37 положительных и 18 отрицательных).
Статистический анализ. Оценку 95 % доверительного интервала (Ди) значений аналитической специфичности и диагностической чувствительности оценивали по методике, описанной R. Newcombe и изложенной E.B. Wilson в 1927 г. [21, 22].
результаты и обсуждение
Лабораторная диагностика лихорадки Ласса осуществляется с использованием вирусологических, иммуносерологических и молекулярно-генетических методов. Вирусный антиген может быть обнаружен с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием специфичных антител [23-25]. Однако этот метод имеет относительно низкую чувствительность (от 102 до 105 ФОЕ/ мл) [26]. Эта особенность ограничивает его использование, особенно на ранней стадии заболевания, из-за низкой вирусной нагрузки в биологических жидкостях пациентов. метод иФА, основанный на обнаружении специфических антител, также не может быть использован в первые дни после начала заболевания, поскольку значительная концентрация антител класса IgM к возбудителю проявляется через 7-10 дней. Таким образом, метод ОТ-ПЦР наиболее подходит для выявления вируса Ласса в первые дни болезни и является необходимым для быстрой и ранней диагностики из-за высокой чувствительности и простоты реализации [27]. В этой парадигме
i rain G2197-SLE-2011 aeg»enc зею 3« ..AAGG...C..T 0 3630 3640 3650 3660 3670 3680 36»0 3 »00 3710 3720 3730 3740 37
rain G2222-SLZ-2011 aegnxnc rain C225>-SU:-2012 aegaenc rain G216S-SLT-2011 aegment rain G2147-SLE-2011 aegicent rain G2141-SLZ-2011 aegaenc rain G1S60-3LZ-2011 aegmenc rain G19S9-SLE-2011 aegaene rain G1647-SLE-2011 aegaent rain G1727-SLE-2011 aeg»ent rain G1774-SLE-20U aegmenc rain G1792-SLE-201X aeg»«r.c rain G803-5LE-20Í0 a«gnenc I rain G1160-SLC-2010 aegn*nt rain Gii50-3LE-:010 aegitenc rain G:442-SI.E-2011 aegaent rain G1S2»-SL£-2011 aegmenc rain G1618-SLZ-2011 aega*nc rain G1646-SLT-2011 aegaene rain G693-3LE-200& aegxent I rain G733-SLZ-2010 aegnenc I rain LASV052-NIG-2008 aegaer rain ISTH1069-NIG-2011 aegae rain XSTH1064-NXG-2011 aega* rain XSTR10Se-NXG-2011 a«g*< rain I5TH1048-NIG-2011 aeg» rain ISTH1038-HXG-2011 a«ga* rain ISTHX003-NIG-20XX sega« rain ISTH0S9S-NIG-20XX aegac rain ISTK0S3X-MIG-20XX aeg»e rain XSTH0230-NIG-201X aeg« rain XSTH0009-NIG-20U aegae rain ISTH0073-NIG-2011 aegae rain XSTHO0X2-NXG-2OXX aeg*e rain ISTH0047-NIG-201X aees* rain Nig08-A37 z procein (Z) rain Nig08-A41 Z proccin (Z) rain Nig08-A47 z procein (Z) rain Nig03-Al* Z procein (Z) rain Nig08-A18 Z procvin (Z) rain Nlg08-04 Z proteln (Z) aegiE«nt acram AV gencoiic gaer.C ccoplete aequer.ee. rain Joaiah aegaer.t - ccople rain Z148 segaene L ccatplet« rain Joaiah stgtctr.: L ccopl« rain Kacenea a«gs«nc L coicpl rain BA366 Z protem (Z) anc procein and L procein genea rain G12C0-LXB-2010 aegaenc rain Joaiah aegn*nc i. parci« rain N'l RING finger procein rain AV RING fmger procein
1.A..CAGCC.GA A.C.AGC. TAATC..AGATGC.A ACAT.T AG.. :.GCA.Т.CTGTA.GAGTTGCTG.Т.CGA.А.CAGG..С. 3 T. AGTGCA.CA.CCACTAT.TGTGT.TCA.CTGCCTC.C.' ГАСТ.ТТ
tí .7.......AA G.T.......AA GOT.......AA G.C.......AA G.T.......AA G.T.......AA .A..ACAT. .AG.G........A .A...CAT. .AG.G........A .A..TCAT. .AG.G........A .A..TCA.. .AG.G........A .A. .1СAT. .AG.G........A .A..TCAT. .AG.G........A .A..TCAT. .AG.G........A .А..ТСДТ. .AG.G........A .A..TCAT. . .G.G........G .А..ТСДТ. .AG.G. .G.....A .A..TCAT. .AG.G........A .A..TCAT. .AG.G........A .А..ТСЙ7. .AG.A........A .A..TCAT. ..G.G........A .A..TCAT. .AG.G........A .A..TCAT. .AG.G........A ■.с..ТТ. ... .с..Т.. ... .С..Т..... • Т..Т..... •Т..т.. ... .С..Т.. G.. I с 11 т 11 !!! .С..ТТ. G.. .С..Т.. ... .С..т.. ... .т..т.. ... .с..т.. ... • Т..Т..... .С.-Т.. G.. .С..Т.. G.. .С..Т.. ... г! !т!!!".!! !!!!!! '.i'.!!! !т! j :!!С!!!!!Т!!!!.А.!Т!!!!!!!!Т!! :!!с!!!!!!!!т!!!!!т!!!!!!!!т!! :..с........т.....т........т.. ----GA..G ----GA..G ----GA..G ........0 ----GA..G ----GA..G ____GA..G IIIIITIIIIICII-IITIIIIITIIIIIIII ..C.G . .C.G' . .C.G ..C.G ..C.G . .C.G . .C.G ..C.G ..C.G: . .C.G . .C.G ..C.G ..C.G ..G... ..G... ..G..T ..G... ..G..T ..G... ..G... ..G..T ..G. .T ..G..T ..G... ..G..T ..G... ..G... ..G...
G.T.......AA G.T.......AA G.T.......AA :!!с!!!!!!!!т!!.'!!т!!!!!!!!т!! :. .с.....т..^. .а..т........т.. :!!C!!Á!!!!!!!!!!!T!!!.!!.!T!. . . ..GA..G ----GA..G ....GA..G ----GA..G ........G ----GA..G ----GA..G ----GA..A ----GA..G
G.T.......AA ..C.G ..C.G
.TCC........с
....ТСД.Т ..G.A.....C..A .С.....G.. .A. . ...........С...........T...........C.G' r.G...
i j
A..TCAT. .AG.G........
_ _
LVL-forwl,2 LVL-prbl(a,b,c) LVL-revl,2
Рис. 1. Частичное выравнивание последовательностей L-генавируса Ласса, использованных для дизайна праймеров и зондов Fig. 1. Partial alignment of Lassa L-gene-virus sequences used for primers and probes designing
разработан и оценен ряд ОТ-ПЦР-методов для выявления РНК вируса Ласса. Большинство из них нацелены на S-сегмент, кодирующий предшественник гликопротеина ^РС) и нуклеопротеин (ОТ) [28, 29]. Это связано с ограниченной информацией о генетических последовательностях вируса Ласса. Однако, как выяснилось в последние годы, некоторые штаммы данного вируса не выявлялись разработанными ОТ-ПЦР методами [30]. По мере появления новой информации о последовательностях S-сегмента стало очевидным, что Ласса является вирусом с высокой генетической изменчивостью, и разработка надежных специфических праймеров и зондов является проблемой [28]. Появление достаточного количества последовательностей L-генов позволило разработать методику, которая могла бы быть более надежной для обнаружения маркеров вируса Ласса, поскольку РНК-полимеразы, которые кодируются L-геном, имеют консервативные аминокислотные мотивы даже между различными представителями семейства аренавирусов [31-33]. За последние десять лет секвенировано множество полных геномов вируса, и практика показала, что L-генные последовательности возбудителя также демонстрируют высокую генетическую изменчивость, даже в пределах одной генетической линии. Таким образом, генетическое разнообразие вируса Ласса является естественной особенностью, которая, скорее всего, будет являться ограничением для использования ОТ-ПЦР в диагностике вызываемого им заболевания.
Множественные выравнивания (рис. 1) вирус-
ных последовательностей, доступных в GenBank, позволили идентифицировать высоко консервативные области, необходимые для дизайна специфических праймеров и соответствующих зондов. На основании данных секвенирования были разработаны и синтезированы олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды, а также разработан специфический метод для выявления РНК вируса Ласса методом ОТ-ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Разработанная методика включала все компоненты, необходимые для проведения реакции, что позволило контролировать все этапы анализа, включая экстракцию РНК, обратную транскрипцию и ПЦР. За счет использования ОКО и К- риск ложноположительных результатов также был сведен к минимуму. Аналитическая чувствительность, оцененная с использованием разведений ПКО, была в диапазоне 103-105 копий/мл, а чувствительность, проверенная со штаммом Josiah вируса Ласса, составила 10 ФОЕ/мл (табл. 1, 2). Стандартная детекция была линейной в диапазоне от 106 копий/мл (пороговое значение реакции (О;) составило 25,5-28,1) до 5 102-102 копий/мл (С; 37,9-38,4) LASVПКО = 0,97-0,99) (рис. 2). Потенциал перекрестных реакций оценивали с использованием панели образцов высокотитражной РНК/ДНК представителей 27 вирусов. Ни один из образцов не зарегистрирован как положительный (табл. 3). следовательно, оцененная аналитическая специфичность составила 100 % (85-100 %, при 95 % ДИ).
В общей сложности с использованием разра-
Таблица 1/Table 1
Псевдовирусные частицы, использованные для оценки аналитической чувствительности метода Pseudo-viral particles utilized for evaluation of analytical sensitivity of the method
Название Штамм Номер в GenBank Источник изоляции Дата изоляции Страна Линия Предел детекции, копий/мл
LVL1 ISTH-2358-NIG-2012 KM821995 H. sapiens 2012 Nigeria н.д. 103
LVL2 LASV046-NIG-2009 KM822009 H. sapiens 2009 Nigeria н.д. 103
LVL3 LASV274-NIG-2010 KM822056 H. sapiens 2010 Nigeria н.д. 103
LVL4 LASV975-NIG-2009 KM822075 H. sapiens 2009 Nigeria н.д. 104
LVL5 G3151-SLE-2013 KM821893 H. sapiens 2013 Sierra-Leone IV 5-104
LVL6 Josiah JN650518 H. sapiens 1976 Sierra-Leone IV 103
LVL7 G3148-SLE-2013 KM821891 H. sapiens 2013 Sierra-Leone IV 105
LVL8 LM765-SLE-2012 KM822116 H. sapiens 2012 Sierra-Leone IV 104
Примечание: н.д. - нет данных.
Рис. 2. Оценка аналитической чувствительности разработанного метода с помощью псевдовирусных частиц
Fig. 2. Evaluation of analytical sensitivity of the developed method, using pseudo-viral particles
Таблица 2/Table 2
Аналитическая чувствительность метода, оцененная с помощью разведений штамма Josiah вируса ласса
Analytical sensitivity of the method, assessed using Lassa virus Josiah strain solutions
104 28,2 29,0 28,6
103 32,0 31,9 31,7
102 35,8 36,1 35,9
101 39,5 39,8 39,1
5 40,4 N/D N/D
ботанного метода в лаборатории вирусологии геморрагических лихорадок Университета им. Гамаль Абдель Насера (г. Конакри, Гвинея) и Российско-Гвинейском центре эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней (Киндия, Гвинея) проведено исследование 92 биологических образцов, причем 53 образца детектированы как положительные и 38 - как отрицательные (табл. 4, 5). Значения О;
положительных образцов находились в диапазоне 21,9-39,2 циклов. Таким образом, диагностическая чувствительность разработанного метода выявления РНК вируса Ласса составляла 86-99 %, при 95 % ДИ, а диагностическая специфичность - 100 %.
Таким образом, разработанная методика успешно применялась на практике для обнаружения вируса Ласса в Гвинейской Республике, используя различные типы материала от мелких млекопитающих, включая цельную кровь и суспензии органов М. па-talensis, а также образцы сывороток крови людей, собранных через 3-7 дней после начала заболевания. Сделано предположение, что данный метод может быть использован для штаммов вируса Ласса, распространенных не только в Гвинее, но и на других эндемичных территориях, но данный факт необходимо подтвердить в дальнейших исследованиях.
исследование выполнялось в рамках Распоряжения Правительства РФ от 22 декабря 2017 г. № 2904-р о Российско-Гвинейском научно-техническом сотрудничестве в области эпидемиологии, профилактики и мониторинга бактериальных
Концентрация, ФОЕ/мл Повторы
Ct Ct Ct
Таблица 3/Table 3
Виды вирусов, использованных для оценки аналитической специфичности Types of viruses used for analytical specificity evaluation
Вирус Акроним Семейство Род Тип нуклеиновой кислоты
Zaireebolavirus EBOV Filoviridae Ebolavirus РНК
Sudanebolavirus SUDV Filoviridae Ebolavirus РНК
Marburgvirus MARV Filoviridae Marburgvirus РНК
Tahynavirus TAHV Peribunyaviridae Orthobunyavirus РНК
Bataivirus BATV Peribunyaviridae Orthobunyavirus рнк
Inkoovirus INKV Peribunyaviridae Orthobunyavirus РНК
Crimean-Congo hemorrhagic fever virus CCHFV Nairoviridae Orthonairovirus РНК
Dhorivirus DHOV Orthomyxoviridae Thogotovirus РНК
FluA/H1N3 FLUAV(H1N3) Orthomyxoviridae Influenza virus A РНК
FluA/H3N2 FLUAV(H3N2) Orthomyxoviridae Influenza virus A РНК
FluB FLUBV Orthomyxoviridae Influenzavirus B РНК
Yellowfevervirus YFV Flaviviridae Flavivirus РНК
WestNilevirus WNV Flaviviridae Flavivirus РНК
Zikavirus ZIKV Flaviviridae Flavivirus РНК
Tickborneencephalitisvirus TBEV Flaviviridae Flavivirus РНК
Sindbisvirus SNDBV Togaviridae Alphavirus РНК
Chikungunyavirus CHIKV Togaviridae Alphavirus РНК
Rubellavirus RUBV Togaviridae Rubivirus РНК
Kemerovovirus, strain 21/10 KEMV-21/10 Reoviridae Orbivirus РНК
Tribecvirus, strain Tr19 TRBV-Tr19 Reoviridae Orbivirus РНК
HumanRotavirus A RVA Reoviridae Rotavirus РНК
Enteric Cytopathic Human Orphanvirus 11 ECHO11 Picornaviridae Enterovirus РНК
Humanimmunodeficiencyvirus 1 HIV-1 Retroviridae Lentivirus РНК
Rabiesvirus RABV Rhabdoviridae Lyssavirus РНК
HumanCytomegalovirus 5 HCMV-5 Herpesviridae Cytomegalovirus ДНК
Humanparvovirus B19 B19 Parvoviridae Erythroparvovirus ДНК
Middle East respiratory syndrome coronavirus MERS Coronaviridae Betacoronavirus РНК
Таблица 4/Table 4
образцы биологического материала от M. natalensis, использованные для оценки диагностической чувствительности Biological samples from M. natalensis, used for evaluation of diagnostic sensitivity
ID источник регион тип образца а результаты предыдущих исследований
21 M. natalensis Faranah цельная кровь 39,1 положительный
38 M. natalensis Faranah цельная кровь 35,6 положительный
39 M. natalensis Faranah цельная кровь 33,4 положительный
40 M. natalensis Faranah цельная кровь 38,9 положительный
44 M. natalensis Faranah цельная кровь 36,4 положительный
50 M. natalensis Faranah цельная кровь 29,7 положительный
81 M. natalensis Faranah цельная кровь 33,3 положительный
110 M. natalensis Faranah цельная кровь 32,9 положительный
Pool2 M. natalensis Faranah цельная кровь 35,9 положительный
103 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный положительный
104 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
105 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
161 M. natalensis Faranah цельная кровь 32,4 положительный
163 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
173 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
174 M. natalensis Faranah цельная кровь 38,0 положительный
175 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
104dl M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
195 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
106 M. natalensis Faranah цельная кровь 34,8 положительный
108 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
109 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный положительный
111 M. natalensis Faranah цельная кровь отрицательный отрицательный
107 M. natalensis Faranah цельная кровь 37,2 положительный
99 M. natalensis Faranah цельная кровь 25,4 положительный
63 M. natalensis Faranah цельная кровь 28,0 положительный
65 M. natalensis Faranah цельная кровь 37,2 положительный
94 M. natalensis Faranah цельная кровь 33,0 положительный
11276 M. natalensis Mamou суспензия органов 22,6 положительный
11102 M. natalensis Mamou суспензия органов 25,2 положительный
11309 M. natalensis Mamou суспензия органов 24,6 положительный
11092 M. natalensis Mamou суспензия органов 21,8 положительный
11095 M. natalensis Mamou суспензия органов 24,7 положительный
11087 M. natalensis Faranah суспензия органов 24,2 положительный
11269 M. natalensis Faranah суспензия органов 27,4 положительный
11098 M. natalensis Faranah суспензия органов 22,7 положительный
12356 M. natalensis Macenta суспензия органов 24,9 положительный
13251 M. natalensis Macenta суспензия органов отрицательный отрицательный
13252 M. natalensis Macenta суспензия органов 25,0 положительный
13253 M. natalensis Macenta суспензия органов 26,3 положительный
13254 M. natalensis Macenta суспензия органов отрицательный отрицательный
13255 M. natalensis Macenta суспензия органов 23,5 положительный
13256 M. natalensis Macenta суспензия органов 21,9 положительный
13257 M. natalensis Macenta суспензия органов отрицательный отрицательный
13258 M. natalensis Macenta суспензия органов 25,1 положительный
13259 M. natalensis Macenta суспензия органов отрицательный отрицательный
13260 M. natalensis Macenta суспензия органов 25,7 положительный
13261 M. natalensis Nzerekore суспензия органов 25,2 положительный
13262 M. natalensis Nzerekore суспензия органов отрицательный отрицательный
13263 M. natalensis Nzerekore суспензия органов отрицательный отрицательный
13283 M. natalensis Nzerekore суспензия органов отрицательный отрицательный
13284 M. natalensis Nzerekore суспензия органов отрицательный отрицательный
13285 M. natalensis Nzerekore суспензия органов отрицательный отрицательный
13280 M. natalensis Nzerekore суспензия органов 26,5 положительный
13286 M. natalensis Nzerekore суспензия органов 24,7 положительный
Таблица 5/Table 5
Образцы сывороток крови людей, использованные для оценки аналитической чувствительности метода Human blood sera samples used for evaluation of analytical sensitivity of the method
ID Пол Возраст Регион День от начала заболевания а Подтверждение
2136 F 40 Kankan 4 28,3 положительный
2137 M 60 Kankan 3 35,4 положительный
2140 M 60 Kankan 5 31,8 положительный
2143 F 42 Kankan 5 25,6 положительный
2144 F 61 Kankan 4 33,0 положительный
3334 M 56 Nzerekore 6 отрицательный отрицательный
3335 M 36 Nzerekore 7 отрицательный отрицательный
3336 M 36 Nzerekore 10 39,2 положительный
3337 F 61 Nzerekore 4 34,2 положительный
3338 M 40 Nzerekore 6 отрицательный отрицательный
3339 M 55 Nzerekore 2 36,9 положительный
3340 M 28 Nzerekore 5 отрицательный отрицательный
3341 M 28 Nzerekore 6 отрицательный отрицательный
3342 F 7 Mamou 4 28,3 положительный
3343 M 60 Mamou 3 30,8 положительный
3344 M 7 Mamou 5 27,6 положительный
3345 F 7 Mamou 6 24,3 положительный
3346 M 11 Mamou 7 отрицательный отрицательный
3347 M 39 Kindia 8 отрицательный отрицательный
3348 M 32 Kindia 4 отрицательный отрицательный
3349 M 39 Kindia 3 отрицательный отрицательный
3350 F 36 Mamou 7 отрицательный отрицательный
3351 F 25 Kankan 10 38,9 положительный
3352 F n/a Kankan 3 отрицательный отрицательный
3358 M 18 Faranah 5 25,9 положительный
3367 M 23 Faranah 4 36,4 положительный
3369 M 43 Faranah 3 28,6 положительный
3372 M 24 Faranah 5 отрицательный отрицательный
3373 M 15 Faranah 3 отрицательный отрицательный
3375 M 23 Faranah 5 27,9 положительный
3378 F n/a Faranah 6 26,2 положительный
3391 M n/a Faranah 8 отрицательный отрицательный
3392 M n/a Mamou 6 отрицательный отрицательный
3394 F 26 Mamou 9 отрицательный отрицательный
3396 F 35 Mamou 11 отрицательный отрицательный
3398 M 37 Mamou 4 отрицательный отрицательный
3400 M 41 Mamou 5 отрицательный отрицательный
и вирусных инфекций в Гвинейской Республике (2018-2020 гг.).
Благодарности. Авторский коллектив выражает свою благодарность Е. Фишет-Кальвет (Институт тропической медицины им. Бернхарда Нохта, Гамбург, Германия) за предоставление данных и образцов, вошедших в исследование.
Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
Список литературы / References
1. Virus taxonomy: the classification and nomenclature of viruses: the online (10th) report of the ICTV. [Internet]. (cited 03 Oct 2018). Available from: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ ictv_online report/.
2. Ogbu O., Ajuluchukwu E., Uneke C.J. Lassa fever in West African sub-region: an overview. J. Vector Borne Dis. 2007; 44(1):1-11. PMID: 17378212.
3. Safronetz D., Lopez J.E., Sogoba N., Traore' S.F., Raffel S.J., Fischer E.R., Ebihara H., Branco L., Garry R.F., Schwan T.G., Feldmann H. Detection of Lassa virus, Mali. Emerg. Infect. Dis. 2010; 16(7):1123—6. DOI: 10.3201/eid1607.100146.
4. Ajayi N.A., Nwigwe C.G., Azuogu B.N., Onyire B.N., Nwonwu E.U., Ogbonnaya L.U., Onwe EI., Ekaete T., Günther
S., Ukwaja K.N. Containing a Lassa fever epidemic in a resource-limited setting: outbreak description and lessons learned from Abakaliki, Nigeria (January-March 2012). Int. J. Infect. Dis. 2013; 17(11):e1011-6. DOI: 10.1016/j.ijid.2013.05.015.
5. Keenlyside R.A., McCormick J.B., Webb P.A., Smith E., Elliott L., Johnson K.M. Case-control study of Mastomys natalensis and humans in Lassa virus-infected households in Sierra Leone. Am. J. Trop. Med. Hyg_ 1983; 32: 829-37.
6. Monath T.P., Newhouse V.F., Kemp G.E., Setzer H.W., Cacciapuoti A. Lassa virus isolation from Mastomys natalensis rodents during an epidemic in Sierra Leone. Science. 1974; 185:263-5. PMID: 4833828.
7. Safronetz D., Sogoba N., Lopez J.E., Maiga O., Dahlstrom E., Zivcec M., Feldmann F., Haddock E., Fischer R.J., Anderson J.M., Munster V.J., Branco L., Garry R., Porcella S.F., Schwan T.G., Feldmann H. Geographic distribution and genetic characterization of Lassa virus in sub-Saharan Mali. PLoS Negl. Trop. Dis. 2013; 7(12):e2582. DOI: 10.1371/journal.pntd.0002582.
8. Richmond J.K., Baglole D.J. Lassa fever: epidemiology, clinical features, and social consequences.
DOI: 10.1136/bmi.327.7426.I271.
9. Monath T.P., Mertens P.E., Patton R., Moser C.R., Baum J.J., Pinneo L., Gary G.W., Kissling R.E. A hospital epidemic of Lassa fever in Zorzor, Liberia, March-April 1972. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1973; 22(6):773-9. DOI: 10.4269/ajtmh.1973.22.773.
10. Macher A.M., Wolfe M.S. Historical Lassa fever reports and 30-year clinical update. Emerg. Infect. Dis. 2006; 12:835-7. DOI: 10.3201/eid1205.050052.
11. Asogun D.A., Adomeh D.I., Ehimuan J., Odia I., Hass M., Gabriel M., Olschläger S., Becker-Ziaja B., Folarin O., Phelan E., Ehiane P.E., Ifeh V.E., Uyigue E.A., Oladapo Y.T., Muoebonam E.B., Osunde O., Dongo A., Okokhere P.O., Okogbenin S.A., Momoh M., Alikah S.O., Akhuemokhan O.C., Imomeh P., Odike M.A., Gire S., Andersen K., Sabeti P.C., Happi C.T., Akpede G.O., Günther S. Molecular diagnostics for Lassa fever at Irrua specialist teaching hospital, Nigeria: lessons learnt from two years of laboratory operation. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012; 6(9):e1839. DOI: 10.1371/journal. pntd.0001839.
12. Olschläger S, Lelke M, Emmerich P, Panning M, Drosten C, Hass M, Asogun D, Ehichioya D, Omilabu S, Günther S. Improved Detection of Lassa Virus by Reverse Transcription-PCR Targeting the 5' Region of S RNA. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(6):2009-13. DOI: 10.1128/JCM.02351-09.
13. Tyagi S, Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluo-resce upon hybridization. Nat Biotechnol. 1996; 14:303-8. DOI: 10.1038/nbt0396-303.
14. Van Pelt-Verkuil E., van Belkum A., Hays J.P. Principles and technical aspects of PCR amplification. NY: Springer Science; 2008. 332 p. DOI: 10.1007/978-1-4020-6241-4.
15. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 2007; 35(Suppl. 2):W43-46. DOI: 10.1093/nar/gkm234.
16. Dedkov V.G., Magassouba N.F., Safonova M.V., et al. 2016. Development and evaluation of a real-time RT-PCR assay for the detection of Ebola virus (Zaire) during an Ebola outbreak in Guinea in 2014-2015. J. Virol. Methods. 2016; 228:26-30. DOI:10.1016/j. jviromet.2015.11.007.
17. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratory. 2-ed. Cold Spring Harbor Lab. Press; 1989. 1885p.
18. Cheng Y., Niu J., Zhang Y., Huang J., Li Q. Preparation of his-tagged armored RNA phage particles as a control for real-time reverse transcription-PCR detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(10):3557-61. DOI: 10.1128/JCM.00713-06.
19. Pasloske B.L., Walkerpeach C.R., Obermoeller R.D., Winkler M., Du Bois D.B. Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards. J. Clin. Microbiol. 1998; 36(12):3590-4. PMID: 9817878.
20. Cherpillod P., Schibler M., Vieille G., Cordey S., Mamin A., Vetter P., Kaiser L. Ebola virus disease diagnosis by real-time RT-PCR: a comparative study of 11different procedures. J. Clin. Virol. 2016; (77):9-14. DOI: 10.1016/jjcv.2016II1.017.
21. Newcombe R.G. Two-Sided Confidence Intervals for the Single Proportion: Comparison of Seven Methods. Statistics in Medicine. 1998; 17:857-72.
22. Wilson E.B. Probable Inference, the Law of Succession, and Statistical Inference. Journal of the American Statistical Association. 1927; 22:209-12. DOI: 10.1080/01621459.1927.10502953.
23. Bausch D.G., Rollin P.E., Demby A.H., Coulibaly M., Kanu J., Conteh A.S., Wagoner K.D., McMullan L.K., Bowen M.D., Peters C.J., Ksiazek T.G. Diagnosis and clinical virology of Lassa fever as evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay, indirect fluorescent-antibody test, and virus isolation. J. Clin. Microbiol.
2000; 38(7):2670-77.
24. Niklasson B.S., Jahrling P.B., Peters C.J. Detection of Lassa virus antigens and Lassavirus-specific immunoglobulins G and M by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 1984; 20(2):239-44. PMID: 6386846.
25. Jahrling P.B., Niklasson B.S., McCormick J.B. Early diagnosis of human Lassa fever by ELISA detection of antigen and antibody. Lancet. 1985; 1(8423):250-2. PMID: 2857321.
26. Günther S., Lenz O. Lassa Virus. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2004; 41(4):339-90. DOI: 10.1080/10408360490497456.
27. Drosten C., GöttigS., Schilling S., Asper M., Panning M., Schmitz H., Günther S. Rapid detection and quantification o
of Ebola and Marburg viruses, Lassa virus, Crimean-Congo hemor-rhagic fever virus, Rift valley fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:2323-30. DOI: 10.1128/JCM40.7.2323-2330.2002.
28. Trappier S.G., Conaty A.L., Farrar B.B., Auperin D.D., McCormick J.B., Fisher-Hoch S.P. Evaluation of the polymerase chain reaction for diagnosis of Lassa virus infection. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1993; 49(2):214-21. PMID: 8357084.
29. Demby A.H., Chamberlain J., Brown D.W., Clegg C.S. Early diagnosis of Lassa fever by reverse
Microbiol. 1994; 32:2898-903. PMID: 7883875.
30. Trombley A.R., Wachter L., Garrison J., Buckley-Beason V.A., Jahrling J., Hensley L.E., Schoepp R.J., Norwood D.A., Goba A., Fair J.N., Kulesh D.A. Comprehensive Panel of Real-Time TaqMan™ Polymerase Chain Reaction Assays for Detection and Absolute Quantification of Filoviruses, Arenaviruses, and New World Hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2010; 82(5):954-60. DOI: 10.4269/ajtmh.2010.09-0636.
31. Bowen M.D., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Hustad H.L., Bausch D.G., Demby A.H., Bajani M.D., Peters C.J., Nichol S.T. Genetic Diversity among Lassa Virus Strains. J. Virol. 2000; 74(15):6992-7004. PMID: 10888638.
32. Poch O., Blumberg B.M., Bougueleret L., Tordo N. Sequence comparison of five polymerases (L proteins) of unsegment-ed negative-strand RNA viruses: Theoretical assignment of functional domains. J. Gen. Virol. 1990; 71:1153-62. DOI: 10.1099/00221317-71-5-1153.
33. Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Tordo N. Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. EMBO J. 1989; 8:3867-74.
Authors:
Dedkov V.G. Saint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology. 14, Mira St., Saint-Petersburg, 197101, Russian Federation.
Safonova M.V. Plague Control Center. 4, Musorgskogo St., Moscow, 127490, Russian Federation. E-mail: protivochym@nln.ru.
Naidenova E.V., Kritsky A.A. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
MagassoubaN.F., SoropoguiB., KouroumaF., CamaraA.B., Camara J. Gamal Abdel Naser University. Conakry, Republic of Guinea.
Ayginin A.A., Maleev V.V. Central Research Institute of Epidemiology. 3a, Novogireevskaya St., Moscow, 111123, Russian Federation. E-mail: crie@pcr.ru.
Shchelkanov M.Yu. Far East Federal University. Vladivostok, Russian Federation.
Об авторах:
Дедков В.Г. Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Российская Федерация, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, д. 14. E-mail: vgdedkov@ yandex.ru
Сафонова М.В. Противочумный центр. Российская Федерация, 127490, Москва, ул. Мусоргского, 4. E-mail: protivochym@nln.ru.
Найденова Е.В., Крицкий А.А. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@ microbe.ru.
Magassouba N.F., Soropogui B., Kourouma F., Camara A.B., Camara J. Университет им. Гамаль Абдель Насера. Гвинейская Республика, Конакри.
Айгинин А.А., МалеевВ.В. Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии. Российская Федерация, 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а. E-mail: crie@pcr.ru.
Щелканов М.Ю. Дальневосточный Федеральный университет. Российская Федерация, Владивосток.
Поступила 02.12.18.
Принята к публ. 10.12.18.
