CC BY
68
УДК Б15.831.4/.Б:Б12.111.3:Б15.015
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ИХ СПОСОБНОСТИ ДЕПОНИРОВАТЬ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Г.Я. Левин, Л.Н. Соснина,
ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии»
Левин Григорий Яковлевич - e-mail: levin@unn.as.ru
Предложен способ увеличения способности эритроцитов депонировать лекарственные вещества, основанный на ультрафиолетовом облучении (УФО) красных клеток крови. Доказана его эффективность при депонировании гепарина. Установлено, что как само УФО, так и депонирование
гепарина незначительно изменяют реологические свойства эритроцитов. УФО эритроцитов с ухудшенными реологическими свойствами значительно снижает их деформируемость и вызывает изменение морфологии эритроцитов.
Ключевые слова: гепарин, направленный транспорт лекарств, ультрафиолетовое облучение
крови, агрегация, деформируемость, морфология эритроцитов.
There has been proposed a method to increase the abilities of erythrocytes to deposit medicinal substances based on ultraviolet irradiation of blood red cells. There has been proved its efficiency in deposition of heparin. It has been determined that the ultraviolet irradiation as well as the deposition of heparin slightly change the rheological properties of erythrocytes. The ultraviolet irradiation of erythrocytes with inferior rheological properties significantly reduces their deformability and causes changes in erythrocyte morphology.
Key words: heparin, drug delivery, ultraviolet irradiation of blood, aggregation,
deformability, morphology of erythrocytes.
Введение
Ультрафиолетовое облучение (УФО) широко используется в медицине благодаря относительной простоте, безопасности, экономичности, многообразию положительных функциональных сдвигов, индуцированных в организме, отсутствию побочных явлений, высокой терапевтической эффективности [1, 2, 3]. Существуют данные о мембрано-тропном действии УФО на эритроциты, которое приводит к повышению проницаемости их мембран [4, 5].
На основании этих данных нами высказано предположение о том, что мембранотропное действие УФО может способствовать «загрузке» эритроцитами лекарственных веществ. Актуальность этого вопроса связана с тем, что при направленном транспорте лекарственных веществ в качестве контейнеров используются клетки крови, прежде всего эритроциты [6]. Основная особенность и преимущество аутоэритроцитов в качестве транспортной формы лекарства - абсолютная биосовместимость с организмом
человека. Так как объем эритроцитов относительно велик, а побочные эффекты практически отсутствуют, то доза депонированного в нем лекарства может быть доведена до уровня, значительно превышающего его переносимость при непосредственном, например внутривенном или внутримышечном, введении [7].
Целью исследования явилась разработка способа повышения проницаемости мембран эритроцитов для «захватывания» ими лекарственных веществ с помощью УФО, оценка его эффективности, а также исследование функциональных свойств эритроцитов, «загруженных» гепарином и подвергнутых действию УФО.
Материалы и методы. Работа проведена на 30 образцах крови здоровых доноров. В качестве лекарственного вещества, которым «заполняли» эритроциты, использовали гепарин. Способ повышения проницаемости мембраны эритроцитов для «захвата» ими лекарственных средств осуществляли следующим образом.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Клеточную массу получали путем центрифугирования стабилизированной цитратом натрия крови. Удаляли тромбоциты и лейкоциты, а в эритроцитарную массу добавляли гепарин. Данную смесь подвергали воздействию УФО с помощью аппарата ОВК-03-07. Затем отмывали эритроциты для удаления гепарина, оставшегося вне клеток. Для того чтобы понять, проник ли гепарин внутрь эритроцитов, их гемолизировали. Наличие гепарина в гемолизате определяли по его антитромбиновой активности путем измерения удлинения времени свертывания смеси гемолизата с плазмой, что свидетельствовало о присутствии гепарина в гемолизате. В контроле определяли время свертывания плазмы, в которую добавляли гемолизат эритроцитов, не подвергнутых УФО.
Кроме того проводили исследования реологических свойств свежевыделенных эритроцитов, а также эритроцитов, подвергнутых УФО в среде, содержащей и не содержащей гепарин. Агрегацию и дезагрегацию эритроцитов исследовали на приборе собственной конструкции [8], в котором использован принцип, предложенный Н. БсЬтС БсЬопЬа1п е1 а1. [9]. По полученной агрегатограмме рассчитывали максимальную амплитуду МА (показатель степени агрегации), амплитуду через 40 сек. после начала агрегации - А40 (показатель скорости агрегации), степень дезагрегации - при скоростях сдвига 10с-1(010), 15с-1 (Э15), 20с-1 (020). Деформируемость эритроцитов определяли в риги-дометре собственной конструкции [10]. Морфологию эритроцитов изучали в световом микроскопе. Определялось количество дискоцитов, эхиноцитов и стоматоцитов. Исследования проводили с эритроцитарной массой, выделенной в течение первых двух часов после забора крови, а также с эритроцитарной массой, хранящейся в течение двух суток при t +4°С.
Полученные данные обрабатывали с помощью метода непараметрической статистики с применением критерия парных сравнений Вилкоксона при помощи пакета прикладных программ БТДИБИСД 6.0. За уровень статистической значимости принято р<0,05.
Результаты и их обсуждение
Как показали проведенные исследования, время свертывания плазмы, в которую добавляли гемолизат отмытых эритроцитов, инкубированных с физиологическим раствором, или гемолизат эритроцитов, инкубированных с гепарином, практически одинаково. Это свидетельствует как о том, что гепарин не проникает внутрь интактных эритроцитов, так и о том, что трехкратное отмывание красных клеток крови полностью его удаляет с поверхности мембран. В пробе, где к плазме добавляли гемолизат эритроцитов, полученный после воздействия УФО на их суспензию с гепарином, время свертывания плазмы достоверно увеличивалось в среднем на 28%. Этот эффект сохранялся, несмотря на то, что после ультрафиолетового облучения эритроциты трижды отмывали от гепарина физиологическим раствором. Полученные данные свидетельствуют о том, что УФО увеличивает проницаемость мембран эритроцитов, что позволяет лекарственному препарату попадать внутрь клетки.
Как показали проведенные исследования эритроцитар-ной массы, выделенной в течение первых двух часов после забора крови, деформируемость эритроцитов снижалась,
хотя и незначительно, в пробах, которые обрабатывались УФО (таблица 1). При этом наблюдаемое повышение ригидности эритроцитов, «заполненных» гепарином, было обусловлено, в основном, уменьшением количества наиболее деформируемых клеток. Следует отметить, что деформируемость эритроцитов, «заполненных» гепарином, была на 4% ниже, чем у клеток, которые подвергались обработке только УФО.
ТАБЛИЦА 1.
Влияние УФО на деформируемость эритроцитов различных сроков хранения
Морфология эритроцитов
Дискоциты (%) Эхиноциты (%) Стоматоциты (%)
1-е 3-и 1-е 3-и 1-е 3-и
сутки сутки сутки сутки сутки сутки
1-я проба (контроль): эритроциты + физиологический раствор 81.50± 2.43 66.83± 8.29** 15.17± 3.24 14.67± 7.16 3.33± 2.49 18.17± 10.96**
2-я проба:эритроциты + гепарин 81.17± 2.54 67.83± 4.09** 14.83± 4.98 19.67± 3.73 3.83± 3.48 12.33± 3.90**
3-я проба: эритроциты + физиологический раствор + УФО 72.17± 6.36* 8.8 ± 23.50± 8.12* 18.50± 6.16 4.33± 3.50 22.17± 12.85**
4-я проба:эритроциты + гепарин + УФО 71.17± 7.17* 45.83± 8.83* • 24.33± 7.39* 18.5± 3.64 4.50± 2.22* 35.00± 11.89*
Примечание: * - р<0,05, сравнение с контролем, критерий Вилкоксона; • - р<0,05, сравнение 3-й и 4-й пробы, критерий Вилкоксона; ** - p<0,05, сравнение 1-ых и 3-их суток.
Исследование отмытых эритроцитов, хранящихся при 1 +4°С в течение двух суток, а затем прошедших ту же самую обработку, что и свежевыделенные, показало, что их деформируемость достоверно снижалась (таблица 1). По сравнению с контролем деформируемость эритроцитов, «заполненных» гепарином, снижалась на 45%, тогда как депонирование гепарина свежевыделенными эритроцитами снижало их деформируемость лишь на 12%.
ТАБЛИЦА 2.
Изменение морфологии свежевыделенных и консервированных эритроцитов при депонировании гепарина и УФО
Деформируемость эритроцитов (%)
общая максимальная сред стег ней ени
1-е сутки 3-и сутки 1-е сутки 3-и сутки 1-е сутки 3-и сутки
1-я проба (контроль): эритроциты + физиологический раствор 88.83± 5.78 67.00± 3.22** 62.00± 12.25 34.33± 5.89** 27.50± 9.83 32.67± 5.13
2-я проба:эритроциты + гепарин 87.16± 5.34 65.17± 4.36** 61.17± 12.46 30.33± 5.05** 26.00± 9.27 35.00± 4.47
3-я проба:эритроциты + физиологический раствор + УФО 80.83± 5.23* *0 * І+- 56.67± 11.13 17.17± 4.54* 24.17± 8.61 23.33± 2.50*
4-я проба: эритроциты + гепарин + УФО 78.33± 5.16* • 37.17± 4.79* • 46.33± 11.94* 12.83± 3.06* -н • я? 32 8. 24.33± 3.67* •
Примечание: * - р<0,05, сравнение с контролем, критерий Вилкоксона; • - р<0,05, сравнение 3-й и 4-й пробы, критерий Вилкоксона;
** - p<0,05, сравнение 1-ых и 3-их суток.
Было установлено, что морфология свежевыделенных эритроцитов изменялись под влиянием УФО и гепарина также незначительно (таблица 2). При этом наблюдалось небольшое увеличение количества эхиноцитов. Количество дискоидных форм эритроцитов в пробах, обработанных УФО с гепарином и без него, оставалось одинаковым. Более 80% эритроцитов, обработанных УФО, имели
форму дискоцитов, и лишь около 14% клеток - эхиноци-тов, которые, как известно, являются обратимой формой и могут при определенных условиях трансформироваться в дискоциты [11, 12]. После инкубации клеток в течение двух суток при t +4С° количество дискоцитов достоверно снижалось, а число стоматоцитов значительно увеличивалось во всех пробах (таблица 2). Хранение эритроцитов при t +4°С сопровождалось их выраженной диск-сферической трансформацией в сторону стоматоцитоза под влиянием УФО. Еще более усиливало этот процесс депонирование эритроцитами гепарина, что не происходило со свежевыделенными красными клетками крови (таблица 2).
Значительно в меньшей степени изменяется под влиянием УФО агрегация и дезагрегация эритроцитов. Это относится как к эритроцитам свежевыделенным, так и хранящимся в течении двух суток. Не происходит значительного изменения агрегационной способности эритроцитов также после депонирования ими гепарина. Было установлено снижение степени и скорости агрегации эритроцитов, хранившихся двое суток при t +4°С во всех пробах, по сравнению с соответственными пробами свежих эритроцитов.
Выводы
1. УФО эритроцитов, находящихся в среде, содержащей гепарин, приводит к депонированию последнего внутри клеток.
2. Применение УФО для депонирования эритроцитами гепарина сопровождается незначительным измененем их гемореологических свойств - повышением их ригидности и диск-сферической трансформацией.
3. УФО эритроцитов с ухудшенным путем хранения в течение двух суток при t +4°С реологическими свойствами приводит к значительному снижению их деформируемости и появлению большого количества стоматоцитов. Депонирование при этом клетками гепарина усиливает отрицательное действие УФО на деформируемость и морфологию эритроцитов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Козинец Г.И. Практическая трансфузиология. Москва: Триада-Х, 1997. 442 с.
2. Карандашов В.И., Петухов Е.Б. Ультрафиолетовое облучение крови. Москва: Медицина, 1997. 224 с.
3. Рагимов А.А. Трансфузиологическая гемокоррекция: учебное пособие для врачей / под ред. А.А. Рагимова. М.: Практическая медицина, 2008. 597 с.
4. Климович А.В., Олексюк О.Б., Сенькович О.А. и др. Изменение активности ферментов антиоксидантной системы в эритроцитах при УФ-облучении крови больных с септическими осложнениями. Тез. IV фотобиологов России. Саратов. 2005. С. 65-67.
5. Черний В.И., Шраменко Е.К., Степанюк В.А. Ультрафиолетовое облучение крови: современные представления. Бть, знеболювання i ненсивна тератя. 2003. № 3.
6. Сарбаш В.И., Тихонова А.Г., Вуймо Т.А., Дербов А.Л., Александрович Ю.Г., Бутылин А.А., Витвицкий В.М., Аттауллаханов Ф.И. Эритроциты - носители лекарственных препаратов. Рос. хим. ж. 2007. Т. LI. № 1. С. 143-149.
7. Николаев А. Л., Чичерин Д. С., Мелихов И. В.. Соносенсибилизация материалов для направленного транспорта лекарственных веществ. Рос. хим. ж. 2002. № 3. С. 75-79.
8. Пат. 22783 81 РФ, Устройство для исследования агрегации тромбоцитов. /Левин Г.Я., Модин А.П., Кудрицкий С.Ю., Соснина Л.Н. (РФ). № 2005100408/14; заявл. 11.01.05; опубл. 20.06.06. Бюл. № 17.
9. Schmid-Sch nbein H., Gosen J.V., Heinrich L. et al. Counter-rotating «rheoscope Camber» for the study of the microrheology of blood cell aggregation by microscopic observation and microphotometry. Microvasc Res. 1973. Vol. 6. P. 366-376.
10. А. с. № 1363065 Россия, МКИ J01N 33/14. Устройство для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке / Левин Г.Я., Яхно В.Г., Царевский Н.Н., Котяева Н.П.; опубл. 30.12.1987. бюл. № 48 (заявка № 3954988/28-14 от 16.09.1085).
11. Кузник Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии: монография. Чита: Экспресс-издательство, 2010. 832 с.
12. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. М.: Медицина.
