CC BY
55
между повышением активности КФК-МВ и уровнем Са2+-АТФазы СР.
Контрольная группа включала 10 практически здоровых лиц в возрасте от 25 до 40 лет с нормальными биохимическими показателями крови. Концентрация Са2+-АТФазы СР не превышала у них 0,015 мкг/мл.
Для того чтобы проверить специфичность разработанного теста, одновременно определяли содержание КФК-МВ и тропонина Т у 10 пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), находившихся на гемодиализе, а также у 10 с острыми травматическими повреждениями скелетной мускулатуры. Получили следующие результаты: у 1 больного с ХПН показатели Са2+-АТФазы СР были в пределах нормы, у 6 выявили повышенный уровень КФК-МВ, у 2 - положительный тест на тропонин Т. Из 10 больных с острыми травматическими повреждениями скелетной мускулатуры повышенный уровень КФК-МВ был у 8, а тест на тро-понин Т оказался положительным у 1.
Изучили также содержание Са2+-АТФазы СР в сыворотке крови у 20 больных с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST, концентрация Са2+-АТФазы СР у них была на том же уровне, как и у здоровых лиц.
Выводы. В результате проведенного исследования разработан новый метод ИФА для определения в крови уровня Са2+-АТФазы СР. Данный тест может быть использован в качестве биологического маркера для диагностики ОИМ. Дальнейшие клинические исследования позволят выявить степень специфичности этого теста для диагностики ОИМ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Левицкий Д. О., Сырбу С.И., Черепахин В.В., Рохлин С.В., Попович М.И. Моноклональные антитела к мембранам саркоплазматическо-го ретикулума, ингибирующие транспорт кальция и Са++-АТФазную активность. Биологические мембраны. Москва, 1986; 3(2): 101-6.
2. Сырбу С.И., Левицкий Д.О., Черепахин В.В., Попович М.И., Рохман О.В. Механизм ингибирования Са2+транспортирующей и АТФ-гидролитической активности саркоплазматического ре-тикулума моноклональными антителами к Са2+-АТФазе сердца собаки. В кн.: Актуальные вопросы кардиологии: Сборник науч. трудов. Кишинев; 1989: 149-63.
3. Сырбу С.И., Мачука О.И., Попович М.И., Гудумак В.С. Функциональное состояние и содержание Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума сердца при ишемии. В кн.: Материалы научной конференции Гос. мед. ун-та им. Н. Тестемицану Респ. Молдова (12-15 мая 1992 г.). Кишинев; 1992: 39.
4. Donacki N. Peroxidase conjugation by periodate method. May 14 2002. http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/Peroxidase-Conjugation-by-Periodate-Method-440.html
5. Garcia-Dorado D., Piper H.M., Eisner D.A. Sarcoplasmic reticulum and mitochondria in cardiac pathophysiology. Cardiovasc. Res. 2008; 77(2): 231-3.
6. Levitsky D.O., Syrbu S.I., Cherepakhin V.V., Rokhlin O.W. Monoclonal antibodies to dog heart sarcoplasmic reticulum. Antibodies that inhibit Ca-pump systems of cardiac and skeletal muscles. Eur. J. Bi-ochem. 1987; 164: 477-84.
7. Levitsky D.O., Syrbu S.I., Cherepakhin V.V., Rokhlin O.W. Monoclonal antibodies to dog heart sarcoplasmic reticulum. Application of the mAbs for study's structure and function of Ca-ATPase. Biomed. Biochem. Acta. 1987; 8: 382-7.
8. PeriasamyM., Bhupathy P., Babu G.J. Regulation of sarcoplasmic reti-culum Ca2+-ATPase pump expression and its relevance to cardiac muscle physiology and pathology. Cardiovasc. Res. 2008; 77 (2): 265-73.
9. The Joint European Society of Cardiology/American College of Cardiology Committee. Myocardial infarction redefined - A consensus document of the Joint European Society of Cardiology/American College of Cardiology Committee for the Redefinition of Myocardial Infarction. Eur. Heart J. 2000; 21:1502-13.
Поступила 03.09.12
микробиология
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 615.45.03:616.932-078.33
B. B. Агафонова, К P. Телесманич, Ю. м. Ломов, А. П. Кочеткова, А. Н. Наркевич, м. В. Полеева
использование стандартных методических подходов для определения эпидемической значимости холерных вибрионов
ФКУз Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Проводили испытания нового диагностического антилипазного препарата и бактериологического метода выявления гемолитических штаммов холерных вибрионов с целью внедрения в лабораторную практику и стандартизации подходов к определению эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов.
Ключевые слова: холерные вибрионы, современные технологии определения, эпидемическая значимость
V.V. Agafonova, N.R. Telesmanitch, Yu.M. Lomov, A.P. Kotchetkova, A.N. Narkevitch, M.V. Poleyeva
THE APPLICATION OF STANDARD APPROACHES TO DETERMINE EPIDEMIC VALUE OF CHOLERA VIBRIO
The article deals with the results of testing of new diagnostic anti-lipase preparation and bacterial technique of detection of
hemolytic strains of cholera vibrio with purpose to implement them in the laboratory practice and standardization of detection of
epidemically dangerous strains of cholera vibrio.
Key words: cholera vibrio, modern techniques of detection, epidemic value
микробиология
В отечественной и зарубежной практике ранее отсутствовали диагностические препараты, позволяющие серологическими методами оценивать эпидемическую значимость штаммов холерных вибрионов. Это связано с трудностями в получении очищенных препаратов холерного токсина и гемолизина в достаточных количествах, высокоспецифичных сывороток как к токсину, так и гемолизину.
Основными регламентированными и часто применяемыми методами в лабораторной диагностике холеры продолжают оставаться ПЦР и определение гемолитической активности на эритроцитах барана в пробе Грейга (МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»). Вместе с тем на основе полученных в последние годы новых данных о феноти-пических свойствах и генетической организации возбудителя холеры на современном этапе предлагаются новые подходы, которые находят свое место в схеме лабораторной диагностики холеры с перспективой их использования при разработке и внедрении в практику «стандарта диагностической деятельности». Разработка стандарта лабораторной диагностики особо опасных инфекций, в частности холеры, не только позволяет нормативно закрепить объем, сроки и порядок проведения исследований, но и отражает обеспечение практической деятельности диагностическими препаратами и дополнительными методическими подходами. В свою очередь, методы и диагностические препараты, регламентированные в МУК 4.2.2218-07 и во введенных в действие с 01.06.11 МУК 4.2.287011 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней», должны обеспечивать стандартизацию различных этапов лабораторной диагностики холеры, проводимых в лабораториях различного уровня
В частности, одна из задач - это разработка и внедрение новых альтернативных методов выявления гемолитических (атоксигенных) штаммов холерных вибрионов, так как метод определения эпидемической значимости штаммов по гемолитической активности в пробе Грейга с применением эритроцитов барана является нестандартным.
Феномен гемолиза - это сложный полифункциональный процесс, являющийся результатом взаимодействия продуктов нескольких генов: ЫуА и ЫуВ, 1ес (лецитиназы) и ЫуС (или НрА-липазы), находящихся в Ыу-области V сЫо1егае, ответственной за синтез и продукцию гемолизина холерных вибрионов [9, 12, 13]. Корреляционная связь гемолитической и липаз-ной активности позволила установить, что именно гемолитически активные в отношении эритроцитов барана штаммы холерных вибрионов эльтор проявляли липазную активность на средах, содержащих в качестве субстрата жиры, что легло в основу разработки новых методов изучения и идентификации гемолитических штаммов эльтор [8].
Для корреспонденции: Агафонова Виктория Владиславовна, науч. сотр. Адрес: 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40 Телефон: (863)240-91-08
Липазная активность холерных вибрионов долгое время оставалась неизученной. Считается, что липо-литическая активность микроорганизмов имеет таксономическое значение, однако большинство исследователей изучали липазную активность в пределах одного рода, не сравнивая разные виды микроорганизмов и тем более биологические варианты внутри вида [7]. Предполагалось, что липаза холерных вибрионов является составляющей комплекса ферментов, принимающих участие в повреждении мембран, а также может участвовать в нарушении слизистого слоя кишечника, защищающего эпителий, и таким образом способствовать адгезии и колонизации холерных вибрионов. Внимание к липазе возбудителя холеры определила ее связь с гемолитической активностью атоксигенных вибрионов эльтор, выявление которой до сих пор используется для ориентировочной оценки эпидемической значимости штаммов.
Компьютерный анализ аминокислотной последовательности продукта гена hlyC (lipA) показал, что аминокислотный состав липазы холерных вибрионов высокогомологичен липазе Pseudomonas sp. (степень гомологии 93,5%), доступной в коммерческой сети [12, 17, 18]. Изучена возможность использования чужеродного, но аналогичного по структуре антигена-липазы Pseudomonas sp. в целях разработки полимерного иммуноглобулинового диагностикума, который можно использовать для серологического выявления гемолитических штаммов холерных вибрионов по продукции ими липазы, определяемой в реакции агломерации объемной (РАО).
Нашей задачей явилось проведение испытаний нового диагностического антилипазного препарата и бактериологического метода выявления гемолитических штаммов холерных вибрионов с целью внедрения их в лабораторную практику и стандартизации подходов к определению эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов.
Первым этапом в конструировании антилипазного препарата явилось получение антилипазной сыворотки к коммерческому препарату липазы Pseudomonas sp. фирмы "Sigma". B результате подбора оптимальной схемы иммунизации получена высокоспецифическая сыворотка, титр антител которой в иммуноблоте с препаратом липазы Pseudomonas sp. в качестве антигена составлял 1:1600-1:3200 [1, 2, 11]. Далее методом Dubert из иммунной сыворотки выделяли антилипаз-ные антитела (IgG), которые иммобилизовали на полимерных микросферах. В работе использовались по-лиакролеиновые микросферы, полученные анионной полимеризацией акролеина, окрашенные в красный цвет, диаметром 1,5 мкм, содержащие 1,3 ммоль/г альдегидных групп и 98% монодисперсности. Поскольку носитель содержит альдегидные группы, реагирующие с аминогруппами белков (преимущественно IgG) с образованием азометинов, сенсибилизация осуществлялась без предварительного химического активирования. Антилипазные антитела ковалентно связывались с полимерными микросферами. Далее препарат подвергали низкотемпературной обработке в жидком азоте при -196±2oC и лиофильно высушивали. В данном виде препарат стабильно сохраняет активность в течение двух лет при соблюдении пра-
вил хранения и транспортирования в соответствии с инструкцией по применению.
Традиционно РАО с применением иммуноглобу-линовых полимерных диагностикумов использовалась для индикации и идентификации инфекционных агентов и их токсинов, где немаловажную роль играет чувствительность и специфичность диагностикума. Мы исследовали способность уже идентифицированных чистых культур штаммов холерных вибрионов продуцировать липазу, выявляя при этом продукцию последней как антигена. Объектом исследования в реакции агломерации при использовании разработанного диагностикума является 4-часовая бульонная культура штамма, продуцирующего липазу. Взвесь 109 микробных клеток на 1 мл (по стандартному образцу мутности - ОСО) готовят в 0,9% растворе натрия хлорида из колоний 18-24-часовой агаровой идентифицированной культуры холерных вибрионов эльтор. Далее 0,1 мл приготовленной взвеси вносят в 4 мл мясопептонного бульона или бульона ЬВ (рН 7,2), и инкубируют посевы в термостате при температуре 37±20С в течение 4 ч. Полученную бульонную культуру исследуют в РАО.
Результаты реакции учитывают через 2,0±0,5 ч. За положительный результат реакции принимают цветной ярко-розовый агломерат, выстилающий все дно лунки равномерным слоем (зонтик). Положительная реакция указывает на продукцию липазы штаммом холерного вибриона и свидетельствует о гемолитической активности и отсутствии эпидемической значимости. В случае отрицательного результата образуется компактное колечко или «точка» в центре лунки (пуговка), что указывает на отсутствие тестируемой липазы в культуральной жидкости и позволяет предположить, что штамм токсигенный и, следовательно, возможно, эпидемически опасен [10]. В качестве положительного контроля в РАО предложено использовать депонированный в ГКПВ «Микроб» штамм холерного вибриона 01 V. сЫо1егае КМ 254.
Атоксигенные гемолитические (йхАВ" Н1у+) штаммы, выделенные как из объектов окружающей среды, так и от людей, при культивировании в течение 4 ч в мясопептонном бульоне, в РАО с антилипазным диа-гностикумом образовывали на дне лунок пластикового планшета четкий зонтик, что свидетельствовало о наличии липазы в среде культивирования и определяло штаммы как гемолитические атоксигенные эпидемически неопасные. Установлено, что токсигенные штаммы холерных вибрионов эльтор (йхАВ+ Н1у-), выделенные из различных источников, в РАО с анти-липазным диагностикумом не проявляли липазной активности, что определяло их как токсигенные негемолитические штаммы и свидетельствовало об их эпидемической опасности. Важно отметить, что чувствительность реакции при исследовании свежевы-деленных штаммов была высокой и определялась положительной реакцией в разведении культуральной жидкости 1:64. Наличие у штаммов гена холерного токсина йхА подтверждалось результатами постановки ПЦР со специфическими праймерами.
При изучении штаммов холерных вибрионов классического биовара и вибрионов 0139 серологической группы, выделенных в разные годы на различных территориях, установлена их неспособность про-
дуцировать липазу, выявляемую в РАО с помощью антилипазного диагностикума. Возможно, это объясняется тем, что по структуре липаза этих вибрионов отличается от липазы вибрионов эльтор, что также согласуется с отсутствием гемолитической активности у классических холерных вибрионов от эльтор.
При определении липазной активности учитывали способность штаммов к гемолизу эритроцитов барана - проба Грейга, при постановке которой в соответствии с МУК-07 атоксигенные варианты проявляют гемолитические свойства, а токсигенные - не-гемолитичны. Следует отметить, что при постановке пробы Грейга 16,7% токсигенных штаммов частично лизировали эритроциты барана, в то время как по паспортным данным при первичном изучении этих культур процесса гемолиза не наблюдалось. Обратный эффект, утрата гемолитических свойств, наблюдался у 18,2% атоксигенных штаммов, в то время как при первичном изучении они были охарактеризованы как гемолизпозитивные. Подобные процессы имеют место при длительном хранении культур штаммов в музеях, а также в процессе многократных пассирований на питательных средах.
В 90-х годах группа ученых на основании альтернативности гемолитической активности и токсиген-ности вибрионов эльтор предложила формулу оценки эпидемической значимости штаммов возбудителя холеры - Н1у- [6]. Проба на гемолиз с эритроцитами барана далеко не всегда выявляет атоксиген-ные штаммы холеных вибрионов эльтор [16]. Однако чаще снижение или потеря гемолитических свойств штаммов является временным процессом, обусловленным реакцией культуры на условия хранения. Восстановление первоначальных гемолитических свойств штаммов происходило при троекратном пассировании культур через высокопитательный мясо-пептонный агар и бульон. Снижение гемолитических свойств не оказывало отрицательного влияния на выявление продукции липазы в РАО, что позволяло в 95±0,3% случаев четко дифференцировать токсиген-ные и атоксигенные штаммы. В реакции с антилипаз-ным диагностикумом наблюдались более стабильные результаты, что определяет РАО с иммуноглобулино-вым антилипазным диагностикумом как более чувствительный, специфичный и стандартный тест по сравнению с классическим методом ориентировочного определения эпидемической опасности штаммов по гемолитической активности в пробе Грейга.
Исследована способность к продукции липазы у единичных штаммов холерных вибрионов эльтор, выделенных от людей на различных территориях вне вспышек заболевания. Молекулярно-биологическими методами в геноме таких штаммов установлено наличие генов холерного токсина, но при изучении холерогенности на биологической модели кроликов-сосунков показана их низкая вирулентность (паспортные данные). Возможно, благодаря снижению вирулентности выделенных культур возбудителя холеры на данных административных территориях удалось избежать серьезных эпидемических осложнении. Такие токсигенные штаммы в пробе Грейга частично лизировали эритроциты барана и при исследовании их липазной активности в РАО с применением анти-
микробиология
липазного диагностикума продуцировали липазу. Однако продукция липазы у таких токсигенных «человеческих» штаммов была снижена и не превышала разведения 1:8 в сравнении с атоксигенными вариантами вибрионов, липаза которых выявлялась в разведении культуральной жидкости 1:3-1:64. Этот момент может характеризовать изучаемую группу штаммов как «промежуточную» форму и позволяет считать, что у токсигенных штаммов, выделенных от человека, существует взаимосвязь нескольких биологически важных фенотипически проявляющихся активностей:
- при высокой вирулентности штаммов - гемолиз отрицательный - липаза отрицательна;
- при низкой вирулентности штаммов - гемолиз отрицательный/частично положительный - липаза отрицательна/положительна в низких титрах.
Установлена 100% специфичность антилипазно-го диагностикума при выявлении гемолитических штаммов холерных вибрионов эльтор в реакции агломерации с 4-часовыми бульонными культурами, при этом не выявлено перекрестной реакции с представителями энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Yersinia, а также штаммов Pseudomonas spp.) и рода Vibrio (V metschnikovi, V. parahaemoliticus, V. mimicus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. furnissii, V. alginoliticus).
Антилипазный диагностикум, полученный при использовании чужеродного, но гомологичного для холерного вибриона антигена, позволяет специфично выявлять (дифференцировать) токсигенные негемолитические и атоксигенные гемолитические штаммы холерных вибрионов в серологической РАО по продукции липазы и может быть использован при определении эпидемической опасности штаммов эльтор в схеме лабораторной диагностики холеры. Результат может быть готов через 6 ч от момента получения чистой культуры возбудителя, в то время как постановка и учет пробы Грейга занимает 48 ч [1].
Следующим этапом явилось изучение возможности применения метода серологического определения эпидемической значимости холерных вибрионов по липаз-ной активности в регламентированной схеме идентификации возбудителя холеры при мониторинге водных объектов окружающей среды в соответствии с МУК 4.2.2218-07. Несколько экспериментальных серий препарата с целью проведения испытаний были переданы в различные бактериологические лаборатории учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и противочумные учреждения. Апробация препарата проводилась и продолжает проводиться на базах ФГУЗ Ростовский-на-Дону НИПЧИ и ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в РО (Ростов-на-Дону), ФГУЗ Противочумный центр (Москва), ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (Иркутск), ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области» (Екатеринбург), ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Московская обл., пос. Оболенск). Специалисты перечисленных учреждений вне плановых тем на базе своих лабораторий при мониторинге объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов эльтор на этапе определения эпидемической опасности выделенных штаммов применяли антилипазный диагностикум
параллельно с регламентированными в МУК-07 методами ПЦР, фагами ctx+ ctx- и пробой Грейга на гемолиз. Результатами работы явились положительные отзывы практических специалистов, оформленные в виде актов внедрения успешно проведенных комиссионных и медицинских испытаний. Полученные заключения свидетельствуют о том, что метод РАО с антилипазным диагностикумом дает четкие (100%) результаты при детекции токсигенных штаммов холерного вибриона, прост в постановке и позволяет заподозрить эпидемически опасные штаммы уже на уровне городских и районных бактериологических лабораторий, в которых отсутствует возможность постановки ПЦР-анализа. Метод РАО может быть использован в лабораторной практике для сигнального выявления культур холерного вибриона различной эпидемической значимости. Результаты медицинских испытаний подтвердили, что диагностикум антилипазный иммуноглобулино-вый для РАО может быть использован в практическом здравоохранении и внесен в «стандарт» лабораторной диагностики холеры для определения эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов биовара эльтор при мониторинге объектов окружающей среды на наличие возбудителя. В результате проведенных испытаний антилипазный полимерный диагностикум для выявления гемолитических штаммов холерных вибрионов в РАО включен в некоторые нормативные документы федерального уровня, регламентирующие методические подходы к диагностике холеры: МУК 4.2.2315-08 «Серологические методы в диагностике холеры. Дополнение к МУК 4.2.2218-07», практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (Москва, 2009); введенные в действие с 01.06.11 МУК 4.2.2870-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» [4, 5].
Одним из методов обнаружения липазной активности холерных вибрионов является выращивание культур на питательной среде с жирами, специфическая ферментация которых лежит в основе дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов [8]. С помощью системы интегрированного запроса Entrez на сайте National Center for Biotechnology Information найдены полные нуклеотидные и аминокислотные (АК) последовательности структурного гена ЫуС (lipA) и полипептида HlyC, зарегистрированные в базе данных под номерами доступа № AF 194478 и № AAF 08828.1 соответственно. В белке Н1уС, состоящем из 312 АК, обнаружены следующие АК-мотивы: триа-цилглицероллипазы (сходной с панкреатической); а-, ß-гидролазы, эстеразы, тиоэстеразы, пероксидазы, пеп-тидазы. Множество обнаруженных коротких мотивов гена свидетельствует в пользу того, что он способен проявлять себя по фенотипу в зависимости от природы и структуры липидов, находящихся в окружающей среде. Способность к гидролизу жиров животного происхождения, обеспечиваемая активностью гена НрА -триацилглицероллипазная активность, у атоксигенных холерных вибрионов эльтор напрямую связана с их гемолитической активностью по отношению к эритроцитам барана. Разработан и предложен метод ее определения, а также способ дифференциации токсигенных
эпидемически опасных и атоксигенных гемолитических штаммов на основе определения триацилглице-роллипазной активности на средах с 1% содержанием жиров растительного и животного происхождения и индикатора нильского голубого сульфата [12]. Однако данная дифференциальная питательная среда не лишена недостатков в связи с нестандартностью субстрата и необходимостью внесения эмульгатора жира «Прогресс». Для решения этого вопроса рассмотрена возможность использования глицерина в качестве субстрата для выявления гидролазной активности холерных вибрионов. Применение глицерина обусловлено интересом к изучению способности холерных вибрионов с различными генетическими характеристиками использовать продукт гидролиза жиров в качестве субстрата для проявления а-, Р-гидролазной активности. Глицерин вводили в агар Мартена в количестве 2,5%. Результаты опыта учитывали через 48 ч, что позволяло дифференцировать штаммы и вибрионов О1 и О139 и демонстрировало проявление активности у гемолитических представителей холерных вибрионов. На основе проявления штаммами гидролазной активности в отношении глицерина можно проводить дифференциацию гемолитических атоксигенных и негемолитических токсигенных вибрионов независимо от объекта выделения, аналогично дифференциации на среде с жирами. Добавление глицерина в питательную среду позволяет стандартизировать метод для выявления гемолитических штаммов вибрионов бактериологическим методом (пат. № 2375457) [1, 15].
Разработаны и предложены к внедрению питательные среды, содержащие в качестве субстрата жиры или глицерин, для дифференциальной диагностики гемолитических атоксигенных и негемолитических токсигенных холерных вибрионов, основанной на выявлении липазной активности как маркера гемоли-тичности штаммов.
Заключение. Качество эпидемического надзора зависит от эффективности мониторинга, который оценивается по интенсивности выделенных культур от общего числа исследуемых проб, что в свою очередь зависит от соблюдения в полном объеме существующей схемы лабораторной диагностики холеры (МУК 4.2.2218-07, МУК 4.2.2870-11). После выделения культуры наступает этап дополнительных исследований свойств штамма, который проводится с помощью как регламентированных методических подходов, так и современных, не предусмотренных существующей схемой лабораторной диагностики холеры. Этот этап подразумевает привлечение научных разработок с целью выявления закономерностей, которые не были установлены в процессе исследования по общепринятой схеме идентификации, но чрезвычайно полезны для последующего анализа эпидемической обстановки каждого сезонного периода [14]. В задачи научных исследований, помогающих совершенствованию лабораторной диагностики, также входит разработка еще более доступных и экспрессных методов, которые в дальнейшем нашли бы свое место в схеме лабораторной диагностики холеры.
Лабораторная диагностика различных болезней в целом и, в частности, холеры остается актуальной проблемой на протяжении многих лет. В основе совершенствования диагностических подходов лежит как
модернизация ранее предложенных методов, так и разработка новых приемов. Однако бесспорным преимуществом дня сегодняшнего является возможность комбинированного использования научно-практических достижений, накопленных за многие десятилетия изучения возбудителя холеры, и применение современных технологий, что в итоге повышает качество, скорость и точность получаемых результатов, своевременный анализ которых является сигналом для проведения противоэпидемических мероприятий [3].
РАО может быть использована как дополнительный стандартный тест для определения гемолитической активности и ориентировочный тест на ток-сигенность при характеристике штаммов холерных вибрионов. Закономерности проявления гемолитической и липазной активности, выявленные с помощью комплексного методического подхода, включающего серологический (РАО) и бактериологические методы - проба Грейга и характеристика роста на средах с жирами и глицерином, открывают перспективы дальнейшего совершенствования и стандартизации дифференциальной диагностики холеры.
ЛИТЕРАТУРА
1. Агафонова В. В. Закономерности проявления триацилглицерол-липазной активности у холерных вибрионов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Ростов н/Д, 2009.
2. Ломов Ю. М., Агафонова В. В., Телесманич Н. Р. и др. // Журн. микробиол. - 2007. - № 1. - С. 74-77.
3. Ломов Ю. М., Терентьев А. Н., Карбышев Г. Л. // Материалы IX съезда Всероссийского науч.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2007. - Т. 3. - С. 60-61.
4. МУК 4.2.2870-1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. - М.: ФЦГиЭ Роспотреб-надзора, 2011.
5. МУК 4.2.2315-08. Серологические методы в диагностике холеры. Дополнение к МУК 4.2.2218-07. - М.: ФЦГиЭ Роспотреб-надзора, 2010.
6. Подосинникова Л. С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Саратов, 1993.
7. Рубан Е. Л. Микробные липиды и липазы. - М., 1977.
8. ТелесманичН. Р. // Журн. микробиол. - 2004. - № 2. - С. 11-14.
9. ТелесманичН. Р., ЛомовЮ. М. // Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д., 2005. -Вып. 18. - С. 59-64.
10. Телесманич Н. Р., Безуглова Е. В., Карбышев Г. Л., Агафонова В. В. Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов. - Пат. № 2261444; опубл. 27.09.2005 г. - Бюл. № 27.
11. Телесманич Н. Р., Ломов Ю. М., Агафонова В. В. // Журн. микробиол. - 2006. - № 1. - С. 57-60.
12. ТелесманичН. Р. Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Ростов н/Д., 2006.
13. Телесманич Н. Р., Ломов Ю. М., Подосинникова Л. С. // Журн. микробиол. - 2007. - № 4. - С. 85-92.
14. ТелесманичН. Р. // Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д., 2008. - Вып. 21. - С. 18-24.
15. Телесманич Н. Р., Агафонова В. В., Акулова М. В. Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов 01 и О139 серогрупп от токсигенных по гидролазной активности. -Пат. на изобретение № 2375457 от 10 декабря 2009 г.
16. Barrett Т. J, Blake P. A. // J. Clin. Microbiol. - 1984. - Vol. 13, N 1. - P. 126-129.
17. Casanova T. B., PetersonK. M. // DNA Seq. - 1997. - Vol. 5, N 3. -P. 181-184.
18. OgiermanM. A., Fallarino A., Riess T. // J. Bacteriol. - 1997. - Vol. 179, N 22. - P. 7072-7080.
Поступила 09.12.11
