CC BY
27
УДК 616.932:575(471.61)
Н.РЛГелесманич, Ю.МЛомов, И.Д.Бардых, Н.И.Винокур
АДГЕЗИВНОСТЬ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ С ТСР+ СТХ“ ГЕНОТИПОМ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ТЕРРИТОРИИ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ В 2002 ГОДУ
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Проведено изучение степени адгезии, гемолитической и триацилглицероллипазной активности 4 штаммов холерных вибрионов с К;р+ ах~ генотипом, чувствительных к бактериофагу с1х+, выделенных на территории Ростовской области в 2002 г. Полученные результаты дают основание считать, что на настоящий момент по параметрам атоксигенности, неадгезивности, наличию гемолитической и триацилглицероллипазной активности штаммы 1ср+ ах~ можно отнести к эпидемически не опасным, не отрицая того, что наличие гена Ц;рА может быть потенциально опасным и привести к формированию токсигенной вирулентной популяции.
Одним из главных вопросов эпиднадзора при холере является оценка эпидемической опасности выделяемых культур холерных вибрионов, существующих в виде токсигенных и нетоксигенных вариантов. Основным генетическим маркером эпидемиологической значимости штаммов являются гены ах АВ. Вместе с тем известно, что для реализации инфекционного процесса холерные вибрионы должны иметь и ген пилей адгезии [14], токсиген-ные штаммы без токсинкорегулируемых пилей адгезии (ТСР) не способны колонизировать слизистую кишечника и вызывать инфекционный процесс. Поэтому ген 1срА, контролирующий биосинтез ТСР, признан наряду с ах АВ ключевым генетическим фактором, определяющим эпидемический потенциал вибрионов. При исследовании в ПЦР 93 штаммов вибрионов 01 группы, выделенных из воды и клинического материала на территории ряда республик бывшего СССР, лишь 7,5 % из них имели в составе своих хромосом структурный ген и:рА. При этом выявлены штаммы с генотипом ах+ 1срА+; ах-1:срА+; йх- К;рА“, но не было штаммов ахЧсрА' [6]. В 2002 г. из воды р. Дон, а также из сточных вод Ростова-на-Дону выделили 4 штамма холерных вибрионов эльтор, содержащих ген токсинкорегулируемых пилей адгезии (ЧсрА+), при отсутствии гена холерного токсина (ах) и чувствительных к ах+ бактериофагу. Эти данные были получены в 2003 г. в Ростовском-на-Дону противочумном институте при изучении свежевыделенных штаммов холерных вибрионов. Роль ТСР как важного фактора колонизации кишечника у человека и одновременно рецептора филаментозного фага СТХф, способного к переносу ах генов [16], позволила рассматривать ах' ШрА+ штаммы вибрионов 01 серо-группы, выделенных из воды поверхностных водоемов, как потенциально опасные в связи с их способностью воспринимать посредством трансдукции ранее утраченные или вновь приобретаемые гены, детерминирующие синтез холерного токсина. Необходимо отметить, что в работах последних лет изучение генотипа значительно опережает исследование фенотипа холерных вибрионов. Вместе с тем основным показателем фенотипического проявления гена 1ср должна являться способность штаммов холерных вибрионов 1ср+ ах“ к адгезии, которая до
настоящего времени была неизученной.
Как известно, одним из важнейших условий развития инфекционного процесса при холере является способность вибрионов адгезироваться к поверхности энтероцитов и включаться в их ферментные системы. В настоящее время известны методы определения адгезивности холерных вибрионов как in vivo, так и in vitro. Методы in vivo включают в себя определение адгезии на модели лигированных петель подвздошной кишки взрослых кроликов, а также модель кроликов-сосунков и мышей [1, 2, 7, 8]. Однако, несмотря на информативность, эти методы трудоемки, дорогостоящи, длительны, непригодны для исследования большого числа культур и доступны не каждой лаборатории, кроме того, клетки кролика лишь отдаленно похожи на клетки кишечника человека. Для оценки адгезивных свойств энтеробактерий были предложены и широко апробированы методы изучения адгезивного процесса in vitro [2, 3, 10, 13]. В качестве клеток макроорганизма предложены эритроциты барана или человека как универсальная модель для изучения адгезии различных микроорганизмов. Эритроциты имеют на своей поверхности гликофорин - вещество идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для адгезинов микробов. Преимущества методики очевидны - полная корреляция результатов с адгезией in vivo [3, 4, 9, 10, 13], простота получения эритроцитов в необходимых количествах, меньшая трудоемкость, экспресс-анализ, а также возможность изучения адгезии на клетках человеческого происхождения [10].
В настоящее время наряду с ПЦР и ДНК-зондированием, определением чувствительности к фагам эльтор ctx+ и ctx" и холерогенности на кроли-ках-сосунках, общепринятым тестом для оценки эпидзначимости штаммов холерных вибрионов является гемолиз эритроцитов барана в пробе Грейга. При изучении феномена гемолитической активности нами был разработан тест для определения триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов, которая проявляется у гемолитичных атоксигенных штаммов и не характерна для токсигенных.
В связи с вышесказанным целью настоящего исследования явилось изучение степени адгезии,
гемолитической и триацилглицероллипазной активности культур' холерных вибрионов с tcp+ ctxTi генотипом, чувствительных к бактериофагу ctx+, ^выделенных на территории Ростовской области.
Материалы и методы
В работе использованы 4 штамма tcp+ ctx~, чувствительных к бактериофагу ctx+, выделенных на территории Ростовской области в 2002 г. - V. cholerae eltor 18513, 18514, 18507, 18515. В качестве контроля использовали токсигенные штаммы ctx+ Н1у“ -V. с hole гае cholerae 569В, V. с hole гае eltor 5879, 1310; атоксигенные - V. cholerae eltor ctx~ Н1у+ 14959 (tcp+), 15037, 14863, выделенные от челрвека; 18235, 18236, 18237, изолированные из ‘воды; ctx+Hly” из воды - 18210, 18228, 18231; V. cholerae 0139-16131.
Адгезивные свойства холерных вибрионов изучали при помощи экспресс-метода in vitro [4]. 18-часовые бульонные культуры холерных вибрионов засевали на щелочной агар, через 24 ч культивирования при 37 °С готовили 1 млрд взвесь. Клеточным субстратом служили формалинизиро-ванные эритроциты человека 0(1) группы Rh(+). В качестве буфера использовали 0,1 М раствор фосфата натрия, приготовленный на изотоническом1 растворе хлорида натрия (pH 7,2-7,3) или таблетирован-ный PBS (Serva), на котором готовили 10 % взвесь эритроцитов. Для опыта использовали 1 млрд взвесь вибрионов (по стандарту мутности ОСО ГИСК им. JT.A,Тарасовича); На предметном стекле смешивали каплю эритроцитов в буфере и взвесь вибрионов. Предметное стекло с эритроцитами и микробами помещали во влажную камеру на 30 мин при 37 °С, затем препарат высушивали при той же температуре, фиксировали 96° спиртом или смесью Никифорова и окрашивали по Романовскому-Гимза или метиленовым синим. Изучение адгезии, вели под световым микроскопом. Адгезивные свойства оценивали с помощью (СПА) среднего показателя адгезии (среднее количество вибрионов прикрепившихся к эритроциту). Подсчет вели на 100 эритроцитах. Адгезивность считали нулевой при СПА от 0 до 1; средней - от 1,01 до 2,9; высокой - свыше 3 [3, 4]; К (коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе) - процент, эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микробы (определяют визуально, при подсчете 100 эритроцитов). НАМ (индекс адгезйвности микроорганизма) - среднее количество микробных клеток на одном эритроците, участвующем в адгезивном процессе, вычисляется по формуле
ТТАЛ/Г СПА-100
ИАМ =------------,
К
Вибрионы считают неадгезивными при ИАМ = 0—2,4; адгезивными - от 2,51 до 3,9; высокоадгезивными - выше 4,0. .
Гемолитическую активность определяли обще-I принятым тестом Грейга на эритроцитах барана. Триацилглицероллипазную активность, характер-I ную для атоксигенных гемолитичных штаммов, определяли по предложенной ранее методике [12].
Результаты
После изучения 4 штаммов холерных вибрионов tcp+ ctx~, выделенных из р. Дон и сточных вод в 2002 г. установлено, что они вызывали гемолиз эритроцитов барана через 2 ч в пробе Грейга; обладали триацилглицероллипазной активностью. Средний показатель адгезии (СПА) tcp+ ctx~ соответствовал штаммам V. cholerae eltor с генотипом ctx~Hly+. По шкале оценки адгезивных свойств микроорганизмов [3, 4] штаммы с tcp+ ctx~ генотипом были оценены как неадгезивные.
Так, средний показатель адгезии (СПА) для штаммов V. cholerae eltor tcp+ ctx~ 18513 составлял 0,25; 18514 - 0,17; 18507 - 0,21; 18515 - 0,17 (неадгезивны). Для штаммов V. cholerae eltor ctx” Н1у+ 14959 - 0,15 (tcp+); 15037 - 0,3; 14863 - 0,18; 18237 - 0,2; 18235 - 0,15; 18236 - 0,17 (неадгезивны). СПА подтверждался низким коэффициентом адгезии, что. нашло отражение в показателе ИАМ (индексе адгезии) (таблица). В то же время СПА для штаммов вирулентных составлял для V. cholerae cholerae 569В - 5; V. cholerae eltor 5879 - 3,5; 1310 — 4,5; 18210 - 2,6; 18228 - 2,9; 18231 - 2,3; эти параметры также подтверждались высоким коэффициентом, что выразилось высоким индексом адгезии (таблица).
Обсуждение
Ранее в результате изучения адгезивных свойств холерных вибрионов с помощью, методов и in vitro [2, 3, 13] установлено, что высокоадгезивные штаммы - ctx+, негемолитичны (СПА = 3 и выше); адгезивные - могут быть ctx+ и ctx”, гемолитичны (СПА = 1,01-2,9); неадгезивные СПА = 0-1 - ctx", гемолитичны.
Эти факты подтверждают данные, полученные нами. Четкая зависимость адгезивной активности от токсигенности, которая прослеживается в результатах наших исследований на 17 штаммах холерных вибрионов, нуждается в подтверждении на большем количестве штаммов..
Таким образом, наличие гена tcpA в геноме атоксигенных штаммов не свидетельствует о способности последних к адгезии, аналогично тому, как токсигенные штаммы не всегда могут вызывать холерогенный эффект. По всей вероятности, способность к адгезии у холерных вибрионов появляется с приобретением гена ctx. Вместе с тем отсутствие вариантов ctx+ tcp“ [6] свидетельствует, что токсиген-ность, адгезивность й вирулентность связаны с геном tcpA. Однако по данным .[14], островок патогенности VPI, кроме tcpA, который кодирует основную белковую субъединицу TCP, содержит кластер генов - tcp В, С, Q, D, Е, Т; tcp Р, Н участвуют в координированной регуляции биосинтеза TCP и холерного токсина. Выявлен полиморфизм гена tcpA у разных вариантов холерных вибрионов, различия в структуре белка TCP могут вести к различиям в антигенной специфичности и существенной специфичности протек-тивного иммунитета, а также влияют на его взаимодействие с различными фагами, использующими этот белок в качестве рецептора [14].
Результаты изучения адгезивных свойств, гемолитической и триацилглицероллипазной активности различных штаммов холерных вибрионов (М ± ш, п = 6)
Название штамма Наличие генов Объект выделения ■ Параметры адгезивных свойств Гемолити- ческая активность Триацил- глицерол- липазная активность
tcp ctx Средний показатель адгезии Коэффициент адгезии, % Индекс адгезии
V. cholerae eltor 18513 tcp* ctx" Вода 0,25+0,03* 23+1,7 1,08±0,08 + +
18514 tcp* ctx" Вода 0,17+0,02* ' 13 + 0,5 1,3±0,1 + +
. 18507 tcp* ctx" Вода 0,21+0,03* 19 ±0,9 . 1,1±0,01 + +
18515 tcp* ctx" Вода 0,17±0,02* 14 ±0,4 1,4±0,02 + +
18235 ctx' Вода 0,15+0,02* 13 1,1+0,01 + +
18236 ctx" Вода 0,17+ 0,03* 13 1,3±0,1 + +
18237 ctx' Вода 0,2± 0,05* 19 1.3+0,03 + +
14959 tcp* ctx" . Человек 0,15±0,03* 13 ±0,9 1,1±0,01 + +
15037 tcp” ctx" Человек 0,3+0,05* 19 ±0,2 1,5±0,03 + +
14863 tcp" ctx" Человек 0,18±0,01* . 18 ±0,8 1± 0,01 - +
5879 tcp* ctx* Человек 3,5+0,09 80+11 4,4±0,3 - -
-1310 tcp* ctx* Человек 4,5+0,1 70 ± 10 6,4±0,4 - -
V. cholerae cholerae 569 tcp* ctx* Человек 5,0+0,2 70+ 11 7,1+0,3 - -
V. cholerae eltor 18210 ctx* Вода 2,6±0,1 64 ± 10 4,0±0,3 - -
18228 ctx* Вода 2,9+0,2 60 ±12 4,8+0,4 ' - -
18231 cix* Вода ' 2,3+0,1 55 ± 11 4,6+0,4 - -
V. cholerae 0139 16131 tcp* ctx* Человек 2,9+0,1 59 ± 10 4,8±0,3 - -
* Р - степень достоверности < 0,05 относительно V. cholerae cholerae 56.
Результаты наших исследований дают основание считать, что на настоящий момент по параметрам атоксигенности, неадгезивности, наличию гемолитической и триацилглицероллипазной активности штаммы Сср+ ах~ можно отнести к эпидемически не опасным, не отрицая того, что наличие гена йрА может быть потенциально опасным и привести к формированию токсигенной вирулентной популяции.
Поэтому при выделении штаммов 1ср+ ах' и других возможных атипичных вариантов, определение адгезивной активности с помощью экспресс-метода в совокупности с определением предложенной нами триацилглицероллипазной активности [ 12] может быть полезно для дополнительной оценки эпидемической значимости холерных вибрионов.
учебн. заведений. Северо-Кавказский регион. - 1994. - №4. -С. 45. - 9.Король В.В., Алексеева Л.П., Гофман Е.Д.// Профилакт. природно-очаговых инф. - Ставрополь, 1983. - С. 300-301. - 10. Линцнер А. А., Брилис В.И., Брилене Т. А. // Теоретическая и прикладная инф. иммунол. -М., 1982.- С. 93. - 11. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мазрухо Б. Л. и др. // ЖМЭИ. - 2003. - № 2. - С. 3-7. -12. Телесманич Н.Р., Мазрухо Б.Л ., Винокур Н.И. // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер, пробл. комиссии межвед. науч. совета по сан.-эпид. охране территории РФ. - Ростов н/Д, 2002. - Вып. 15. - С. 143-144. - 13. Фрунзе О.В., Андрусенко И.Т., Шепелев А.П. и др. // Лаб. дело. - 1987. -№3.-14. Karaolis D.K., Lan R., Kaper J.B., Ruves P.R. // Infect. Immun. - 2001. - Vol. 69, N 3. - P. 1947— 1952. - 15.Jones G.W., Rutter J. // J. Gen. Microbiol. -1974,- N84. -P. 135-144. - 16.Trocksis М., Michalski J., Deng Y.K., Kaper J.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. - Vol. 95, N 24. - P. 14464-14469.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Авроров В.П., Глянько Е.В., Бардых И.Д. // Эпидемиол., клин., диагн. и профилакт. антропонозных и зоонозных инф. - Астрахань, 1982. - С. 185-187. - 2. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы// Саратов. -1984. - 328 с. - 3. Андрусенко И.Т. Исследование факторов, влияющих на вирулентность холерных вибрионов, и разработка новых методов ее определения: Автореф. ... докт. мед. наук. -Ростов н/Д, 1991. - 43 с. - 4. Брилис В.И. // Лаб. дело. -1986.- №4. - С. 210-212. - 5. Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Сучков И.Ю. и др. // Совр. технол. в диагн. особо опасных инф. бол.: Матер. 4-й Межгос. науч.-практ. конф. гос.-участ. СНГ. - Саратов, 2003. - С. 38. - 6. Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П.//Био-технол. - 1999. - №6. - С. 19-23. - 7. Ефремов В.Е., Полоцкий Ю.Е., Самострельский А.Ю. и др. // ЖМЭИ. -1981. - № 12. - С. 69-75. - 8. Король В.В.// Изв. высших
N.R.Telesmanich, Yu.М.Lomov, I.D.Bardykh, N.I.Vinokur
Adhesion Properties of Vibrio cholerae with tcp* ctx" Genotype Isolated in 2002 from Environmental Objects in the Territory of Rostov Region
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
The levels of adhesion, hemolytic and triacylglycerol-lipase activities were studied in 4 cholera vibrio strains, isolated in Rostov region in 2002, susceptible to ctx* bacteriophage and expressing tcp* ctx' genotype. The observations suggest that, at the present moment, according to their non-toxinogenic and non-adhesive character and due to the presence of hemolytic and triacylglycerol-lipase activities, strains tcp* ctx' can be regarded as epi-demiologically safe bacteria, admitting, however, potential risk of formation of toxinogenic virulent populations due to the presence of gene tcpA.
Поступила 16.02.04
