Использование результатов автоматизированного анализа крови в токсикологических исследованиях на грызунах Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

plaques in carotids in patients of low and moderate risk according to Scope scale.

Key words: arterial wall rigidity, speed of pulse-wave propagation, CAVI index.

УДК 615.9:616.1

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО АНАЛИЗА КРОВИ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ НА ГРЫЗУНАХ

И.Н. КРАВЧЕНКО, Д.И. РЖЕВСКИЙ, И.А. ПАХОМОВА,

Н.Н. КРАВЧЕНКО, А.Н. МУРАШЕВ*

Приведены исторические данные анализа крови контрольных крыс СD (Sprague-Dawley) категории СПФ (свободных от патогенной флоры), полученные с помощью гематологических анализаторов. Сравнение результатов трехкомпонентной автоматизированной лей-кограммы крыс с данными микроскопического метода выявило разницу в количественном составе субпопуляций лейкоцитов. Ключевые слова: кровь, крысы, автоматизированный анализ крови.

В токсикологических исследованиях на грызунах анализ крови является неотъемлемой частью диагностического процесса и предоставляет важную информацию о физиологическом состоянии животного. В последние годы автоматизированный анализ крови все больше вытесняет ручные методы исследования. Исследование крови с помощью гематологических анализаторов имеет несомненные преимущества перед ручными методами, а именно: высокую производительность, небольшой объем пробы, одновременное определение 16-25 показателей и более, дополнительное графическое представление распределения клеток, высокую точность и воспроизводимость результатов. Однако есть некоторые ограничения в возможностях гематологических анализаторов, которые не позволяют полностью отказаться от микроскопических методов исследования.

Цель исследования - суммирование исторических данных анализа крови крыс CD (Sprague-Dawley) СПФ статуса (свободных от патогенной флоры), проводимых в лаборатории биологических испытаний ФИБХ в 2008-2011 годах, сравнение результатов трехкомпонентной автоматизированной лейкограммы крыс с данными микроскопического метода и анализ гистограмм распределения клеток крови крыс по объему.

Материалы и методы исследования. Исследования выполнялись на аутбредных крысах CD (Sprague-Dawley). Животные были получены из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ и содержались в барьерных помещениях в стандартных условиях, рекомендованных для содержания грызунов [8]. Животные имели статус СПФ, подтверждаемый сертификатом производителя. Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены Институтской биоэтической комиссией по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных. Все исследования проводились согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации [5] и стандартным операционным процедурам лаборатории.

Исторические данные анализа крови приведены для контрольных животных (50 самцов, 50 самок), которые участвовали в доклинических испытаниях новых лекарственных средств на безопасность. Контрольные животные получали растворитель согласно способу и режиму введения исследуемых веществ опытным животным (внутривенные инъекции физиологического раствора в хвостовую вену, введение питьевой воды зондом в желудок или накожное нанесение дистиллированной воды). Животных содержали в комнатах барьерного типа с контролируемыми условиями окружающей среды: температура 18-26°C, относительная влажность 30-70%, автоматическая смена 12 часового светового периода, 10 кратная смена объема воздуха комнаты в час. Условия содержания животных соответствовали международным стандартам [8].

Животных лишали корма на ночь перед сбором крови, оставляя свободный доступ к воде. Забор крови проводили из нижней полой вены, предварительно подвергая животных анестезии в СО2-камере. Анализ крови проводили на автоматических анализаторах, осуществляющих трехкомпонентное разделение лейкоцитов (ABC Vet, Celly-70). Для подсчета полной лейкоцитарной

* Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганиче-ской химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, 142290, Пущино, Московская область, Проспект Науки, 6

формулы на окрашенных мазках крови использовали аппаратнопрограммный комплекс МЕКОС-Ц1 с программой МЕКОС-АМК.

Для всех количественных данных были подсчитаны средние арифметические значения (Mean) и их стандартные ошибки (SEM). Для определения достоверности отличий между группами применялся непараметрический критерий Mann-Whitney. Различия считали статистически значимыми при P<0,05. Статистический анализ проводили с помощью программы «Statistica for Windows 7.0».

Результаты и их обсуждение. Крысы являются наиболее часто используемым объектом в доклинических испытаниях новых лекарственных средств на безопасность. Нами были суммированы исторические данные анализа крови контрольных животных аутбредной линии CD (Sprague Dawley) за 2008-2011 гг., которые участвовали в подобных исследованиях (табл.1). Представленные показатели количества лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, концентрации гемоглобина, гематокрита и индексов эритроцитов были получены с помощью гематологических анализаторов, показатели лейкоцитарной формулы определяли микроскопическим методом.

Как видно из полученных результатов (табл.1), у самцов крыс CD средние значения количества эритроцитов (RBC, 8,0х1012/л), гематокрита (Hct, 42,8%) и концентрации гемоглобина (HGB, 156 г/л) несколько выше, чем у самок (7,4х1012/л, 39,9%, 152 г/л, соответственно). Общее количество лейкоцитов WBC у самцов (11,0х109/л) также выше, чем у самок (8,8х109/л) за счет самой многочисленной субпопуляции - лимфоцитов (10,0х109/л у самцов и 8,0х109/л у самок). Содержание тромбоцитов PLT, напротив, несколько выше у самок (854х109/л) по сравнению самцами (798х109/л). Остальные показатели у животных обоего пола, практически, не отличаются.

Таблица 1

Показатели периферической крови крыс CD (возраст 2-5 мес.)

Показатель самцы самки

(n=45) (n=50)

Количество лейкоцитов (WBC), х109/л 11,0±1,6 8,8±0,3

Количество эритроцитов (RBC), х10‘2/л 8,0±0,4 7,4±0,1

Концентрация гемоглобина (HGB), г/л 156±5 152±1

Гематокрит (Hct), % 42,8±2,7 39,9±0,6

Средний объем эритроцита (МСУ), фл 53,6±2,1 54,1±0,4

Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН), пг 19,7±0,6 20,8±0,3

Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС), % 37,0±1,8 38,3±0,5

Количество тромбоцитов (PLT), х109/л 798±78 854±21

(n=50) II (n

Нейтрофилы палочкоядерные, % 1,3±0,2 1,4±0,2

Нейтрофилы палочкоядерные, х109/л 0,2±0,0 0,1±0,0

Нейтрофилы сегментоядерные, % 7,0±0,6 6,9±0,6

Нейтрофилы сегментоядерные, х109/л 0,8±0,1 0,6±0,0

Эозинофилы, % 0,42±0,08 0,51±0,11

Эозинофилы, х109/л 0,05±0,01 0,04±0,01

Базофилы, % 0,160±0,052 0,143±0,051

Базофилы, х109/л 0,020±0,007 0,014±0,005

Моноциты, % 3,3±0,2 3,8±0,4

Моноциты, х109/л 0,4±0,0 0,3±0,0

Лимфоциты, % 87,9±0,8 87,2±0,8

Лимфоциты, х109/л 10,0±0,4 8,0±0,4

Примечания: значения представлены как Mean±SEM, где Mean - среднее значение, SEM - стандартная ошибка среднего; n - количество животных.

Полученные значения показателей периферической крови крыс CD сопоставимы с данными, опубликованными ранее Лабораторией биологических испытаний ФИБХ [2], а также с данными других авторов [6, 7]. Некоторые отличия в абсолютных значениях среднего объема эритроцита (MCV) и гематокрита (НС) у разных авторов, по-видимому, связаны с тем, что на сегодняшний день нет четких стандартов для калибровки приборов, считающих клетки. Контрольный материал для гематологических анализаторов содержит стабилизированные эритроциты, частицы латекса вместо лейкоцитов, тромбоциты животных и пр. Поэтому стабилизированная кровь не является идеальным контрольным материалом, т. к. у содержащихся в ней клеток изменены размеры, форма поверхности, реологические свойства и специфическая электропроводность [1]. Кроме того, анализаторы разных моделей отличаются особенностями конструкции приборов и свойствами применяемых реагентов. В связи с этим при измерении одной и той же пробы крови на разных гематологических анализаторах могут получаться несколько разные результаты среднего

объема эритроцита (MCV), а также гематокрита (Нй), который находится в прямой зависимости от MCV:

КБС х ЫСУ

Таблица S

Hct =

10

где ИоХ - гематокрит (%), КБС - количество эритроцитов (1012/л), МСУ - средний объем эритроцитов (фл).

Поскольку расчетный индекс средней концентрации гемоглобина в эритроците (МСНС) находится в обратной зависимости от МСV, его величина также может отличаться при измерениях на разных гематологических анализаторах:

ИОБ

МСНС=

-xlOO’

RBC XMCV

где МСНС - средняя концентрация гемоглобина в эритроците (%), HGB - концентрация гемоглобина (г/л), RBC - количество эритроцитов (1012/л), MCV - средний объем эритроцитов (фл).

Несомненным достоинством автоматизированного анализа крови является высокая скорость и точность определения количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, которая значительно превышает ручные методики. Коэффициент вариации для современных гематологических анализаторов при подсчете эритроцитов составляет 1-2 %, лейкоцитов - 1-3%, тромбоцитов - 57%. Это существенное преимущество по сравнению с ручными методами, в которых суммарная погрешность может превышать 10-23% [1]. Однако определение лейкоцитарной формулы - самая сложная задача для гематологического анализатора. Приборы, в основе работы которых лежит только кондуктометрический метод, разделяют лейкоциты на три субпопуляции: лимфоциты, «средние клетки» и гранулоциты, которые формируются в результате обработки лейкоцитов лизирующим раствором. К «средним клеткам» относят моноциты, эозинофилы и базофилы, субпопуляция гранулоцитов, в основном, представлена нейтро-филами [3]. Нам представлялось важным оценить информативность и точность такого трехкомпонентного разделения лейкоцитов. Был проведен сравнительный анализ результатов лейкоцитарной формулы автоматизированного подсчета, выполненного на анализаторе с трехкомпонентной дифференцировкой лейкоцитов, и микроскопического метода. В табл. 2 представлена лейко-грамма, полученная с помощью гематологического анализатора. Из проб крови этих же животных были выполнены и окрашены мазки и подвергнуты микроскопии для подсчета полной лейко-формулы (табл.3).

Таблица 2

Лейкограмма самок крыс CD, полученная с помощью гематологического анализатора с трехкомпонентной дифференцировкой лейкоцитов

Показатель Номер животного Mean SEM

1 2 3 4 5

Количество лимфоцитов (Lym), % 71,0 78,0 66,0 65,0 64,0 68,8 2,60

Количество лимфоцитов (Lym), х109/л 7,9 8,4 6,0 4,3 7,5 6,8 0,75

Количество клеток средних размеров (Mid), % 3,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 0,32

Количество клеток средних размеров (Mid),x109/i 0,3 0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 0,04

Количество гранулоцитов (Gm), % 26,0 21,0 32,0 33,0 34,0 29,2 2,48

Количество гранулоцитов (Gm), х109/л 2,9 2,3 2,9 2,1 4,0 2,8 0,33

Примечания: Mean - среднее значение,

SEM - стандартная ошибка среднего

При сравнении результатов лейкоцитарной формулы, полученных разными методами, выявлено их несоответствие (табл. 2 и 3). В данном случае трехкомпонентная дифференцировка лейкоцитов анализатором занижает количество лимфоцитов (6,8х109/л) и завышает количество гранулоцитов (2,8х109/л) в крови крыс относительно данных микроскопии (7,7х109/л и 1,5х109/л, соответственно). Несмотря на то, что разница эта в приведенном примере статистически не достоверна, дальнейшее использование результатов трехкомпонентной дифференцировки лейкоцитов может привести к ошибочным выводам. Так, если проводить сравнение показателей автоматизированной лейко-граммы этой группы животных с аналогичной лейкограммой другой экспериментальной группы, выявляются статистически значимые отличия (табл. 4).

Лейкограмма самок крыс CD, полученная микроскопическим методом

Показатель Номер животного Mean SEM

1 2 3 4 5

Нейтрофилы палочкоядерные, % 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,00

Нейтрофилы палочкоядерные, х109/л 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01

Нейтрофилы сегментоядерные, % 12,0 6,0 20,0 10,0 28,0 15,2 3,93

Нейтрофилы сегментоядерные, х109/л 1,3 0,6 1,8 0,7 3,3 1,5 0,49

Эозинофилы, % 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,00

Эозинофилы, х109/л 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01

Базофилы, % 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0 0,2 0,19

Базофилы, х109/л 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,01

Лимфоциты, % 83,0 89,0 74,0 84,0 66,0 79,2 4,09

Лимфоциты, х109/л 9,2 9,6 6,7 5,5 7,7 7,7 0,77

Моноциты, % 3,0 3,0 4,0 3,0 4,0 3,4 0,24

Моноциты, х109/л 0,3 0,3 0,4 0,2 0,5 0,3 0,04

Примечания: Mean - среднее значение, SEM - стандартная ошибка среднего

Таблица 4

Средние значения показателей лейкограммы самок крыс CD (данные гематологического анализатора с трехкомпонентной дифференцировкой лейкоцитов)

Показатель группа 1 (n=5) группа 2 (n=5)

Количество лимфоцитов (Lym), % 73,6±1,33 68,8±2,60

Количество лимфоцитов (Lym), х109/л 7,4±1,36 6,8±0,75

Количество клеток средних размеров (Mid), % 8,4±1,08 2,0±0,32#

Количество клеток средних размеров (Mid), х109/л 0,8±0,16 0,2±0,04#

Количество гранулоцитов (Gm), % 18,0±1,10 29,2±2,48#

Количество гранулоцитов (Gm), х109/л 1,8±0,25 2,8±0,33#

Примечания: значения представлены как Mean±SEM, где Mean - среднее значение, SEM - стандартная ошибка среднего; n - количество животных.

# - P<0,05 относительно группы 1 согласно тесту Mann-Whitney

Согласно данным трехкомпонентных лейкограмм гематологического анализатора, абсолютное и относительное содержание гранулоцитов (2,8х109/л, 29,2%) в группе 2 оказывается существенно выше, чем в группе 1 (1,8х109/л, 18,0%, см. табл.4). В то же время, количество клеток средних размеров в группе 2 (0,2х109/л, 2,0%) - значительно ниже уровня 1 группы (0,8х109/л, 8,4%, см. табл.4). Кроме того, поскольку к категории «клетки средних размеров» относят моноциты, эозинофилы и базофилы, нет точной информации о том, какие именно субпопуляции лейкоцитов отличаются.

Качественно и количественно другая картина наблюдается при сравнении данных лейкограмм этих же экспериментальных групп, полученных микроскопическим методом. В данном случае не выявляется статистически значимых межгрупповых различий в содержании субпопуляций лейкоцитов как в абсолютном, так и в относительном их количестве (табл.5).

По-видимому, полученное несоответствие данных лейко-формулы автоматизированного и микроскопического методов связано с тем, что в кондуктометрических счетчиках используется единственный критерий разделения клеток - их объем. При микроскопическом исследовании, кроме размеров, учитывается морфология клеток в полном объеме: ядерно-цитоплазматическое отношение, структура и окраска хроматина, зернистость в цитоплазме. Кроме того, анализатор этого класса не определяет незрелые формы нейтрофилов и не может отдельно подсчитать количество эозинофилов, базофилов и моноцитов, что бывает очень важным во многих случаях. Поэтому, несмотря на подсчет большого количества клеток при автоматизированном анализе лейкоформулы, результаты разделения лейкоцитов на 3 субпопуляции следует использовать очень осторожно. Однако результаты трехкомпонентной дифференцировки лейкоцитов весьма полезны и могут использоваться как ориентировочные значения, а также при динамическом наблюдении за состоянием животных для выявления изменений лейкоформулы.

Важной дополнительной информацией автоматизированного анализа крови являются гистограммы распределения клеток по объему. На рис. 1 представлены типичные гистограммы распределения эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов крысы по объему, полученные с помощью гематологического анализатора с трехкомпонентной дифференцировкой лейкоцитов.

Таблица 5

Средние значения показателей лейкограммы cамок крыс CD (данные микроскопического метода)

Показатель группа 1 (n=5) группа 2 (n=5)

Нейтрофилы палочкоядерные, % 1,0±0,00 1,0±0,00

Нейтрофилы палочкоядерные, х109/л 0,1±0,02 0,1±0,01

Нейтрофилы сегментоядерные, % 10,6±1,94 15,2±3,93

Нейтрофилы сегментоядерные, х109/л 1,1±0,21 1,5±0,49

Эозинофилы, % 1,0±0,00 1,0±0,00

Эозинофилы, х109/л 0,1±0,02 0,1±0,01

Базофилы, % 0,2±0,20 0,2±0,19

Базофилы, х109/л 0,0±0,02 0,0±0,01

Лимфоциты, % 83,8±2,22 79,2±4,09

Лимфоциты, х109/л 8,5±1,51 7,7±0,77

Моноциты, % 3,4±0,40 3,4±0,24

Моноциты, х109/л 0,3±0,03 0,3±0,04

Примечание: значения представлены как Mean±SEM, где Mean - среднее значение, SEM - стандартная ошибка среднего; n - количество животных

Рис. 1. Типичные гистограммы распределения клеток крови крысы по объему: WBC - лейкоцитарная, RBC - эритроцитарная,

PLT - тромбоцитарная. По оси абсцисс - объем клеток в фемтолитрах, по оси ординат - количество клеток в относительных единицах. 8,4 s - время лизиса эритроцитов.

Поскольку кровь крысы имеет лимфоцитарный профиль [4], то этот факт .отражается на форме лейкоцитарной гистограммы (рис.1, WBC). Она характеризуется высоким лимфоцитарным пиком в области 25-85 фл и сравнительно малым пиком гранулоцитов (110-400 фл), между ними (85-110 фл) «средние лейкоциты», к которым относят моноциты, эозинофилы и базофилы. Перераспределения в составе субпопуляций лейкоцитов приводят к изменениям в соответствующих областях гистограммы, что указывает на присутствие того или иного патологического состояния. Нормальная эритроцитарная гистограмма крысы имеет симметричную куполообразную форму с нижней границей около 25 фл и максимумом 50-60 фл (рис 1, RBC). По ширине ее основания и положении максимума сразу можно судить о степени анизо-цитоза эритроцитов и наличии микро- или макроцитоза. Тромбоци-тарная кривая унимодальна и немного асимметрична, расположена между 1 и 20 фл с максимумом 5-7 фл (рис.1, PLT). По форме ее правого крыла и пограничной зоны с эритроцитами можно выявить присутствие в крови макротромбоцитов или микроэритроцитов.

Таким образом, качественные и количественные изменения в клеточном составе крови немедленно отражаются на формах гистограмм, что является сигналом исследователю для проведения детального морфологического анализа мазка крови.

Выводы:

1. Приведены исторические данные анализа крови контрольных крыс CD категории СПФ, полученные при проведении доклинических токсикологических исследований, проводимых в Лаборатории биологических испытаний ФИБХ на протяжении 2008-2011 годов.

2. Показано, что трехкомпонентная дифференцировка лейкоцитов гематологическим анализатором не несет достаточной информации для формирования окончательных выводов в токсикологических исследованиях на лабораторных животных и может использоваться только в качестве ориентировочных значений. Во

избежание ошибочных выводов оптимальным является сочетание исследования трехкомпонентной лейкограммы гематологического анализатора и микроскопического исследования крови с определением всех субпопуляций лейкоцитов.

3. Определены границы распределения клеток крови крысы по объему, которые составляют для эритроцитов 25-260 фл, для лейкоцитов 25-450 фл, для тромбоцитов 1-20 фл.

Литература

1. Антонов, В.С. Автоматизация гематологического анализа. Интерпретация показателей гемограммы / В.С. Антонов, Н.В. Богомолова, А.С. Волков.- Издательство Саратовского Медицинского Университета.- 2008.- С.10-14; 38-41.

2. Биомедицина / И.Н. Кравченко [и др.].- 2008.- № 2.-С.20-30.

3. Луговская, С.А. Гематологические анализаторы. Интерпретация анализа крови. Методические рекомендации / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, В.В. Долгов.- М., 2008.- С.18-20.

4. Никитин, В.Н. Атлас клеток крови сельскохозяйственных и лабораторных животных / В.Н. Никитин.- М., 1949.- С.17-22.

5. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации N° 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

6. «Animal Models in Toxicology» edited by Shayne C. Gad.-2008- Р. 813.

7. Charles River Laboratories. Clinical Laboratory Parameters

for Crl:CD(SD) Rats.- March, 2006- Internet resource (February, 2008): http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm rm r

clinical parameters cd rat 06.pdf

8. The Guide for Care and Use of Laboratory Animals.-Washington, D.C.: National Academy Press-1996.

THE USE OF THE RESULTS OF AUTOMATED BLOOD CELL COUNTING IN TOXICOLOGICAL STUDIES ON RODENTS

I.N. KRAVCHENKO, D.I. RZHEVSKY, I.A. PAKHOMOVA,

N.N. KRAVCHENKO , A.N. MURASHEV

Branch of Russian Academy of Sciences, Institute of Bio-Organic Chemistry after Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov, Pushchino, Moscow Region

The historical blood test data of control CD (Sprague-Dawley) rats having SPF category (pathogenic flora free) are presented. The data have been received by using hematological analyzers. The comparison of the results of rat' 3-part white blood cells differential leukogram with the data of microscopic studying revealed the difference in the quantitative formula of leukocyte subpopulations.

Key words: blood, rats, automated blood test.

УДК 616-021.3

ОСОБЕННОСТИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОГО СТАТУСА У ЧАСТО БОЛЕЮЩИХ ДЕТЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ В ТВЕРСКОЙ ОБЛАСТИ.

Р.В. МАЙОРОВ*

Проведено обследование 2040 детей школьного возраста проживающих на территории Тверской области. Выявлена большая распространенность детей, часто болеющих респираторными инфекциями. Отмечены характерные изменения в иммунном статусе у данной категории детей: снижением уровня Т-хелперов, NK-клеток, иммунорегуляторного индекса, повышением уровня TNF-альфа и IgG. Ключевые слова: частые респираторные заболевания, дети,

иммунограмма.

Острые инфекционно-воспалительные заболевания различных отделов респираторного тракта являются одними из самых частых болезней в детском возрасте [1,2,3,4].

При этом отдельно выделяют часто болеющих детей (ЧБД), которые по сути своей представляют особую группу диспансерного наблюдения, включающую детей, с более частыми, чем у сверстников, простудными заболеваниями. Распространенность ЧБД в различные возрастные периоды может колебаться от 10 до 80% [3,5,6,7].

Доказано, что частые респираторные инфекции являются фактором риска развития различных соматических [1,2,8] и нервно-психических заболеваний [2,9].

* ГБОУ ВПО Тверская ГМА, 170100, г. Тверь, ул. Советская, д. 4