CC BY
50
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (139), 2008
П. П. Фисенко,
кандидат сельскохозяйственных наук Приморский НИИСХ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕКУРРЕНТНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ В СЕЛЕКЦИИ СОИ
УДК 633.853.52:581.143.6
Сомаклональная изменчивость является разновидностью мутагенеза, причем эта разновидность имеет некоторые специфические и весьма ценные аспекты. Как и индуцированный мутагенез, сома-клональная изменчивость носит случайный, ненаправленный характер, то есть реализуются как полезные, так и вредные мутации. Однако in vitro выбраковка вредных и нежелательных форм происходит уже в процессе регенерации и начального отбора среди регенерантов Ro в условиях культуральной комнаты. Поэтому испытуемая в поле популяция регенерантов (R1) более продвинута в селекционном плане, что значительно сокращает объем [1, 2].
После получения нерасщепляющихся константных форм регенеранты могут быть снова переведены в культуру in vitro для второго этапа скрининга сомаклонов с целью улучшения их по каким-либо признакам. Таким путем были отобраны, например, томат с повышенным содержанием сухих веществ, высокоурожайный рис, раннеспелая кукуруза, устойчивые к низким температурам и к болезням пшеница, сахарный тростник, картофель, сельдерей, томаты [2]. Рожанская [3] подобную регенерацию назвала рекуррентной и осуществляла ее на эспарцете.
Материал и методика. В нашем эксперименте для введения in vitro регенеранта в популяции сома-клонов сорта Ходсон был отобран R86. В качестве первичного экспланта использовали семядольные узлы. Стерилизацию материалов, приготовления питательных сред осуществляли согласно рекомендаций Бутенко [4]. В качестве основы регенерацион-ной питательной среды использовали минеральные ингредиенты по прописи Murashige T., Scoog F. [5] (MS); витамины - Nitsch (B5) [6], с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) - 1,13 (среда А) и 0,23 мг/л (среда Б). Культивирование проходило на свету при освещенности 4-5 тыс. люкс, 16/8-часового фотопериода и температуры 23±3 оС, укоренение пробирочных растений осуществляли на безгормональной среде с половинным составом минеральной основы MS (1/2 MS). Растения-регенеранты R0 переводили в почву (горшечная культура) для дальнейшего развития в культуральной комнате. Первоначально создавали влажную камеру, затем проходили адаптацию регенерантов.
Выращивание сомаклональных линий, начиная с
Я (регенеранты первого поколения) проводили в полевых условиях в соответствии с принятой для Приморского края агротехникой.
Площадь делянки в гибридном и селекционном питомниках 1,8 м2, контрольном - 9,0 м2. Схема посева во всех питомниках - 45х5 см. Посев в первых двух осуществляли вручную, в контрольном питомнике - сеялкой СКС-6-10. Уборку в начальных питомниках проводили вручную, в контрольном - комбайном «Хеге».
Полевые испытания осуществляли в условиях муссонного климата Приморского края в агрокли-магическом районе 1б2. Данный район характеризуется как наиболее теплый, влажный, с суровой зимой. Сумма активных температур колеблется в пределах 2400-2600°, гидротермический коэффициент - 1,6-2,0.
Оценка степени поражения исходных форм и сомаклональных линий сои грибными патогенами проведена старшим научным сотрудником лаборатории селекции сои Дегой Л. А. при искусственном заражении листовой поверхности на жестком инфекционном фоне по методике ВИР [7] и согласно Международному классификатору [8]. Биохимический состав семян выполнен сотрудниками ВНИИ сои на ИК-сканере №г-42 по следующим показателям: аминокислоты, жирные кислоты, белок, масло, минеральные элементы.
Урожайные данные и другие показатели обрабатывали по методике Доспехова [9].
Результаты исследований и их обсуждение. Первоначально нами в результате изучения сома-клонов отмечено 10 признаков, по которым сома-клоны различаются большей или меньшей степенью между собой и с исходными формами: урожайность, содержание белка, гистидина, масла, линолевой, линоленовой, олеиновой кислот, степень поражения септориозом, церкосопорозом, пероноспорозом.
Сравнение двух популяций осуществляли по вышеперечисленным признакам. По другим анализируемым признакам: содержание аминокислот в белке (валин, пролин, глютамин, лизин, фенилала-нин, тирозин, лейцин, изолейцин, аланин+гли-цин, треанин, аспарагиновая кислота), содержание в масле пальмитиновой и стеариновой жирных кислот, содержание минеральных элементов (К, Са, Р, М^ и др.) различий не обнаружено. Величины
перечисленных признаков оказались стабильными. Значительные и средние показатели вариабельности регенератных линий популяции Ходсон в сравнении с таковыми показателями популяции сомаклонов отмечены по признакам: урожайность (36,1 %), содержание гистидина (15,6 %), линоленовой (13,3 %) и олеиновой (17,3 %) кислот (рисунок). В популяции Я86 преимущество перед популяцией сорта Ходсон выявлено по признакам: степень поражения септорио-зом (12,8 %), церкоспорозом (22,2 %), пероноспоро-зом (18,3 %) (см. рисунок).
1 - урожайность, 2 - содержание белка, 3 - содержание гистидина, 4 - содержание масла, 5 - содержание линолевой кислоты, 6 - содержание линоленовой кислоты, 7 - содержание олеиновой кислоты, 8 - степень поражения септориозом, 9 - степень поражения церкоспорозом, 10 - степень поражения пероноспорозом.
Рисунок - Величина коэффициента вариации (У,%) десяти признаков в зависимости от генотипа
Величины коэффициентов вариации признаков содержания белка, масла, линолевой кислоты в обеих популяциях отнесены к числу несущественных (0,457,64%).
Средние арифметические значения двух популяций различались по семи из десяти изучаемых признаков (табл. 1). Исключение составили такие признаки: содержание олеиновой кислоты, степень поражения септориозом, церкоспорозом, средние арифметические значения которых у двух сравниваемых групп (популяции сомаклонов сорта Ходсон и популяции сомаклонов Я86) практически не различались.
Признаки урожайность (от 0,084 до 0,184 кг с^м2), содержание олеиновой кислоты (от 9,3 до 20 %), степень поражения церкоспорозом (от 69,4 до 38,3 %) улучшены в процессе регенерации сорта Ходсон, т. е. на первом этапе, без использования
второго этапа - регенерации регенеранта сорта Ходсон Rg6 - рекуррентной регенерации.
В результате введения in vitro R86 и его регенерации путем органогенеза удалось изменить в позитивном направлении еще шесть признаков сорта Ходсон:
- содержание масла от 20,38 до 21,23 % (R456);
- содержание линолевой кислоты от 51,0 до 52,9 % (R697);
- содержание линоленовой кислоты от 9,2 до 7,5 % (R422);
- содержание гисти-дина от 9,0 до 10,8 %
(R422);
- степень поражения септориозом от 77,5 до 47,2 % (R389);
- степень поражения пероноспорозом от 90,7 до 45,6 % (R465);
Содержание белка в семенах повысить под действием условий регенерации in vitro не удалось ни при введении и регенерации сорта Ход-сон, ни Rg6, вероятно потому, что Ходсон относится к числу белковых сортов.
Введение in vitro ре-генеранта и.ф. Ходсон способствовало улучшению сорта Ходсон по содержанию гистидина на 1,8 %, масла - 0,85 %, линолевой кислоты -1,9 %, снижению содержания линоленовой кислоты - 1,7 % и степени поражения септориозом - 30,3 %, пероноспорозом - 45,1 %.
В каждой из двух изучаемых популяций выявлены линии, превосходящие исходные формы по ряду признаков. В популяции Ходсона это четыре сомаклона, в популяции R86 - пять (см. табл. 1).
В первом варианте достоверное превышение отмечено по 2-4 признакам, во втором - по 2-5 признакам. Лучшей сомаклональной линией в популяции сорта Ходсон оказалась линия R347, которая помимо урожайности превосходит исходный сорт по содержанию олеиновой кислоты, степени поражения церкоспорозом и пероноспо-розом. В популяции R86 таковых две линии - R456 и R422, пре-вышающие R86 наряду с урожайностью по содержанию линоленовой кислоты, содержанию гистидина, степени поражения перо-носпорозом (табл. 2).
Таблица 1 - Сравнительная характеристика двух популяций сомаклонов органогенного происхождения
Сомаклональная популяция и.Ф. Ходсон Сомаклональная популяция и.ф. К^6
популяция популяция
Признак и.ф. выделив- и.ф. выделив-
X X Нш V, % шаяся линия X X Нш V, % шаяся линия
К347 - 0,184 К456 - 0,146
1. Урожайность, кг/м2 0,084 0,117 0,081-0,184 36,1 К249 - 0,183 К312 - 0,139 0,118 0,135 0,118-0,151 9,0 К465 - 0,144 К422 - 0,151
2. Содержание в семенах масла, % 20,38 19,37 15,49-20,63 7,64 - 20,23 20,72 20,17-21,23 1,53 К456 - 21,23 К465 - 21,0
3. Содержание, % от общего количества
масла:
линолевая к-та 51,0 50,9 48,6-52,1 1,8 - 51,9 52,48 52,1-52,9 0,45 К397 - 52,9
К422 - 7,5
линоленовая к-та 9,2 10,5 9,1-14,3 13,3 - 10,4 8,78 7,5-9,3 8,28 К456 - 8,4 К397 - 8,4 К389 - 8,4
К352 - 20,0
олеиновая к-та 9,3 13,7 11,2-20,0 17,3 К347 - 16,1 К-304 - 14,4 13,8 13,1 11,7-14,6 7,8 К397 - 14,6
4. Содержание белка в семенах, % 40,2 35,9 37,6-40,28 2,79 - 40,03 39,7 39,44-40,14 2,35 -
5. Содержание гистиди-на, % от общего содержания аминокис- 9,0 8,3 5,5-9,9 15,6 - 9,1 10,14 9,6-10,8 4,2 К456 - 10,7 К422 - 10,8
лот в семенах
6. Степень поражения, К352 - 57,5 К389 - 47,2
%: септориозом 77,5 67,85 57,5-78,5 10,4 К249 - 59,6 К441 - 62,2 78,5 61,75 47,2-70,5 12,8 К458 - 54,7 К397 - 58,2
К353 - 38,4
церкоспорозом 69,4 52,4 38,4-65,7 15,7 К-347 - 43,8 К352 - 46,5 53,2 53,5 41,9-81,9 22,2 —
К347 - 66,2 К465 - 45,6
пероноспорозом 90,7 82,3 66,2-92,7 8,3 К353 - 76,7 К251 - 80,6 87,2 68,8 45,6-79,1 18,3 К391 - 54,7 К422 - 60,1
Таблица 2 - Выделившиеся по комплексу хозяйственно ценных признаков сомаклональные линии
из популяций органогенного происхождения (исходные формы - сорт Ходсон и регенерант RS6) (2004, 2005 гг.)
Признак И.Ф. Ходсон И.Ф. RS6
X и. ф. К347 К249 К352 К353 X и. ф. К422 К456 К465 К397 К389
1. Урожайность, кг/м2 0,0842 0,184 0,183 - - 0,119 0,151 0,146 0,144 - -
2. Содержание в семенах масла, % 20,38 - - - - 20,23 - 21,23 21,0 - -
3. Содержание орг. кислот, % от общего количества масла в семенах:
линолевая 51,0 - - - - 51,9 - - - 52,9 -
линоленовая 9,2 - - - - 10,4 7,5 8,4 - 8,4 8,4
олеиновая 9,3 16,1 - 20,0 - 13,8 - - - 14,6 -
4. Содержание белка в семенах, % 40,2 - - - - 40,03 - - - - -
5. Содержание гистидина, % от общего содержания аминокислот в семенах 9,0 - - - - 10,1 10,8 10,7 - - -
6. Степень поражения, %:
септориозом 77,5 - 59,6 57,5 - 78,5 - - - 58,2 47,2
церкоспорозом 69,4 43,8 - 46,5 38,4 53,2 - - - - -
пероноспорозом 90,7 66,2 - - 76,7 87,2 60,1 45,6 - - -
Примечание: Выделившиеся сомаклональные линии достоверно превышают исходную форму (и. ф.).
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (139), 2008
Выделившиеся сомаклональные линии R347 и R422 переданы в конкурсное сортоиспытание лаборатории селекции сои.
Заключение. Нашими исследованиями подтверждена необходимость проведения рекуррентной регенерации сои, которая в результате повторного скрининга дает возможность улучшения форм по ряду признаков.
Литература
1. Evans D. A. Somaklonal variation / D. A. Evans // Plant Biology. - 1987. - Vol. 4. - P. 59-60.
2. Evans D. A. Somaklonal variation-genetic basi-sand breeding application / D. A. Evans // Trend in Genetics. - 1989. - Vol. 5. - № 2. - P. 46-50.
3. Рожанская О. А. Создание исходного материала для селекции кормовых культур в условиях Сибири с помощью методов биотехнологии / О. А. Рожанская // Автореф. дис.... д-ра биол. наук. - Новосибирск, 2007. - 34 с.
4. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. - М.: Наука, 1964. - 272 с.
5. Murashuge E. Scoog / E. Murashuge // Phisiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. - № 13. - P. 473-497.
6. Gamborg P. L. Nutrient requirement of suspension cultures soybean rod celles / P. L. Gamborg, R. A. Miller, K. Ojima // Experimental cell research. - 1969. - Vol. 59. - № 1. - Р.151-158.
7. Методические указания по изучению устойчивости сои к грибным болезням / [Сост. Н. И. Корсаков, А. М. Овчинникова, В. И. Мизеева]; ВАСХ-НИЛ, ВИР. - Л., 1979. - 46 с.
8. Международный классификатор СЭВ рода Glicine Weld / [Сост.: СССР - Л. Г. Щелко, Г. Седова, В. Корнейчук; ЧСФР - Л. Пастухова, Г. Син-ский, П. Гофирек и др.]; ВАСХНИЛ, ВИР. - Л., 1990. - 46 с.
9. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта (с основами стат. обраб. результ. исслед.). - 5-е изд., доп. и перераб. / Б. А. Доспехов. - М.: Агропром-издат, 1985. - 351 с.
