CC BY
52
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (142-143), 2010
П. П. Фисенко1,
кандидат сельскохозяйственных наук А. В. Бабикова2,
аспирантка
О. С. Ефремова1,
младший научный сотрудник
1ГНУ Приморский НИИСХ Россельхозакадемии тел.: 8(4234)39-27-19, факс 8(4234)39-24-00 е-mail: fe.smc_rf@mail.ru
2Биолого-почвенный институт ДВО РАН 690000 г. Владивосток, ул. Проспект 100-летия Владивостока, 159 тел.: 8(4232)34-83-86
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ*
И ДЛИТЕЛЬНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА УРОВЕНЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ СОМАКЛОНОВ СОИ
Ключевые слова: соя, сомаклоны, уровень генетической изменчивости, виды ионизирующего излучения УДК 575.174.015.3:633.853.52+581.143.5
Введение. Новая возможность расширения генетического разнообразия в селекции открылась с организацией биотехнологических методов исследований. Полученные на искусственных питательных средах в условиях in vitro растения-регенеранты, как правило, в той или иной степени отличаются от исходных форм и могут являться исходным материалом для традиционной селекции данной культуры, поскольку они представляют собой сомаклональные варианты [1].
Использование сомаклональной изменчивости в сочетании с отбором позволило О.А. Рожан-ской создать ценный селекционный материал сои, ярового рапса, нута, эспарцета, люцерны с признаками скороспелости, повышенной семенной и кормовой продуктивности, улучшенного химического состава, устойчивости к неблагоприятным гидротермическим условиям и патогенам [2].
В Казахстане группой ученых (С.В. Дидоренко, Ю.Г. Карягиным и Б.М. Жанысбаевым) сомакло-нальная изменчивость применяется как источник генетического разнообразия в создании новых форм сои [3].
В Приморском НИИСХ коллективом двух лабораторий: биотехнологии и селекции сои - с использованием метода культуры тканей создан первый в России сорт сои Приморская 81, который с 2004 г. районирован [4].
Важным моментом в технологии регенерации путем органогенеза являются условия, способствующие возникновению генетических изменений в рекомбинантах. По данным M.S. Wright и др. [5], дополнительные почки в пазухах семядольного узла сои закладываются de novo под влиянием 6-бензиламинопурина (БАП). R.A. Graybosch, M.E. Edge и X. Delannay [6] стимулировали побегообразование из вновь образовавшихся и ранее существовавших меристематических участков проводящей ткани семядольного узла на среде с БАП. Среди полученных линий исследователи наблюдали вариабильность по урожайности и другим признакам. A.H. Freytag с коллегами [7] изучали процесс регенерации растений сои из семядольного узла эксплантов эпикотиля. Авторы выявили генотипы, в потомстве регенерантов у которых отклонения от нормы появлялись чаще.
По мнению Рожанской [8], изоляция семядольных узлов на стадии развития проростка нарушает контролирующее влияние организма, приводит к неорганизованной пролиферации ткани и способствует возникновению генетических изменений у адвентивных почек, формирующихся в семядольных пазухах изолированных узлов.
Величины вариабельности признаков у регенерантов сои недостаточно высокие, поэтому с целью повышения генетического разнообразия мы использовали в качестве исходных эксплантов ткани мутантов. Существует много приёмов получения индуцированных мутаций. В основе их лежит воздействие на организм различными физическими и химическими факторами, называемыми мутагенами.
Действуя ими на растения, можно резко повысить их мутационную изменчивость. В селекционной работе используются любые виды ионизирующих излучений. Наиболее широко применяют рентгеновское, гамма- и нейтронное излучения. [9].
Наряду с этим существует вопрос о влиянии длительности культивирования на уровень генетической изменчивости сомаклонов сои. Как считают некоторые исследователи, уровень изменчивости со-маклонов повышается при более продолжительном культивировании ткани. Рядом авторов [10, 11] определено, что чем длительнее эксплант находится на питательной среде, тем больше вероятность получить регенеранты, отличающиеся от исходных форм.
Однако по данным M.S. Wright и др. [5], проводивших гистологический анализ пазух семядольного узла у исследуемых ими растений сои, через 6 дней после прорастания семян на среде с БАП базальные участки эпикотиля и семядолей, примыкающие к придаточным почкам, становятся меристематическими зонами. В эпидермальных и субэпидермальных тканях формируются проре-генеративные очаги, способные к морфогенезу, возникают новообразования - дополнительные адвентивные почки.
На основании вышеизложенных результатов и мнений ученых, нами была поставлена задача выяснить, оказывают ли влияние различные виды ионизирующего излучения и длительность культивирования на уровень генетической изменчивости сомаклонов сои.
Материалы и методы. Исследования проводились в лаборатории биотехнологии Приморского НИИСХ, в качестве исходных форм использовали сорт Ходсон и его мутанты. Для получения мутантов сухие семена обрабатывали в Институте цитологии и генетики СО РАН следующими электромагнитными излучениями: красным когерентным светом оптического квантового гелий-неонового генератора (лазера) с длиной волны 632,8 нм при плотности потока мощностью 0,08 мВт/см2 в течение 15 мин; у-излучением кобальтовой пушки в дозе 50 грей.
В качестве первичных эксплантов использовали семядольные узлы стерильных микрорастений. Для получения последних зрелые семена стерилизовали в разделительной воронке концентрированной серной кислотой (H2SO4) в течение 2-х мин, с последующей многократной отмывкой стерильной дистиллированной водой согласно методике, предложенной А.М. Смирновым, в изложении В.А. Тильбы [12].
Регенерацию осуществляли по рекомендации M.S.Wright и M.G. Carnes [5].
Семядольные узлы культивировали на питательной среде 1/2MS + БАП (1,13 и 0,23 мг/л) до 60 дней. Адвентивные побеги, образовавшиеся de novo через 7-14 дней (Rq-1) и через 31-60 дней (Ro-2), снимали и помещали на среду 1/2MS+ИМК (0,5 мг/л), не содержащую БАП, для дальнейшего роста и развития.
Степень поражения (%) грибными патогенами: септориозом (Septoria glycines), церкоспорозом (Сercospora sojina), пероноспорозом (Peronospora manshurica) - определяли при искусственном заражении листовой поверхности на жестком инфекционном фоне совместно с сотрудниками лаборатории селекции сои ПримНИИСХ по методике ВИР [13] и согласно Международному классификатору [14].
Биохимический состав семян исходных форм и регенерантных линий проведен во ВНИИ сои на ИК-сканере Nir-42 по следующим показателям: аминокислоты (аргинин, валин, пролин, глютамин, лизин, гистидин, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, аланин+глицин, треанин, серин, аспарагиновая кислота), жирные кислоты (пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линоле-вая, линоленовая), минеральные элементы (К, Са, Р, Mg), белок, масло. Оценка сомаклонов по химическому составу дана на основании классификатора [14].
Регенеранты третьего поколения выращивали в полевых условиях в соответствии с принятой для Приморского края агротехникой.
Статистическая обработка материала проведена методом дисперсионного анализа в изложении Б.А. Доспехова [15].
Для проведения генетического анализа все исследуемые образцы были разделены на три группы, каждая из которых была представлена растениями исходной формы и ее сомаклонами. Первая группа - сорт Ходсон и сомаклоны Rq-1-690, Rq-1-691, Ro-1-699, Rq-1-717, Rq-1-722 и Ro-2-617. Вторая группа - популяция Ходсон-Z, растения которой получены из облученных лазером семян, и сомаклоны R0-1-731, R0-2-616 и R0-2-623. Третья группа - популяция Ходсон-у, растения которой получены из облученных у-излучением семян, и сомаклоны R0-1-651, R0-1-688, R0-1-715 и R0-2-615.
Выделение ДНК и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в БПИ ДВО РАН, как было описано нами ранее [16]. Для анализа полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК 52 образцов использовали 12 праймеров, комплементарных к микросателлитным повторам (табл. 1). При оценке электрофореграмм учитывали только четко видимые и воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты (ампликоны). Для каждого из праймеров были составлены бинарные матрицы, в которых присутствие или отсутствие в спектре фрагментов с одинаковыми молекулярными массами обозначали как "1" или "0". Разная интенсивность полос одинаковых по размеру ампликонов у сравниваемых образцов не учитывалась. Для определения длины фрагментов использовали маркер молекулярных масс - EcoRI + К^Ш-рестрикты ДНК фага лямбда (Fermentas, Литва).
Таблица 1 - Праймеры, используемые в данной работе
Код праймера Нуклеотидная последовательность (5’-3’) Код праймера Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
пр812 (GA)8T прО (AGC)6T
пр825 (AC)8T ^C3 (AGC)eC
пр840 (GA)8(CT) t прС4 (AGC)6G
пр842 (GA)8(CT)G ^C5 (TCG)eG
пр888 (CGT) (ACT) (CGT) (CA)7 ^S1 (CA)8TG
пр889 (AGT) (CGT) (AGT) (AC)v ^S10 (GA)8TC
Объединенная бинарная матрица была использована для расчета частот фрагментов, доли полиморфных локусов (Р), генного разнообразия (Н) и индекса Шеннона (БГ) с помощью пакета программ POPGENE [17]. Для определения генетических расстояний Нея-Ли ф^) и построения дендрограммы генетических взаимоотношений между отдельными растениями на основе значений DN посредством невзвешенного парно-группового метода кластерного анализа (UPGMA) с бутст-рэпными оценками степени надежности порядка ветвления (1000 реплик) использовали пакет программ TREECON [18, 19].
Результаты и обсуждения. В результате ISSR-анализа выявлено 183 фрагмента, из них 164 были полиморфными. Популяция Ходсон-у характеризовалась наибольшим уровнем полиморфизма и значениями генного разнообразия и индекса Шеннона, чем все другие исследуемые популяции исходных форм (табл. 2).
Таблица 2 - Основные показатели генетической изменчивости исходных форм сои
Сорт/популяция Доля полиморфных локусов (P, %) Генное разнообразие (H) Индекс Шеннона (SI)
Xодсон 12,57 0,041 0,062
Xодсон-Z 10,93 0,040 0,062
Xодсон-y 18,03 0,063 0,099
Генетические дистанции между парами анализируемых образцов (популяций) варьировали, достигая 10-кратного различия (табл. 3). Наименьшее значение DN (0,0642) отмечено между исходными популяциями Ходсон-у и Ходсон-Х, наибольшее (0,6043) - между сомаклоном Я^-2-616 популяции Ходсон-Х и сомаклоном Я^-1-691 сорта Ходсон.
Таблица 3 - Матрица значений генетических различий (Б^) между исследуемыми образцами сои, рассчитанных по 183 ШБЯ-фрагментам
Образец (популяция) Ход- сон (n=1o) Ro-1- 69o (Ход- сон) Ro-1- 691 (Ход- сон) Ro-1- 699 (Ход- сон) Ro-1- 717 (Ход- сон) Ro-1- 722 (Ход- сон) Ro-2- 617 (Ход- сон) Ход-сон L (n=13) 1- 1 д- -L) 2- 6 д- -L) & g 2- 3 д- -L) &§ Ход-сон y (n=16) Ro-1- 651 (Ход- сон-Y) Ro-1- 688 (Ход- сон-Y) Ro-1- 715 (Ход- сон-Y) Ro-2- 615 (Ход- сон-Y)
Ходсон (n=10) *****
Ro-1-690 (Ходсон) o,179 *****
Ro-1-691 (Ходсон) o,545 o,447 *****
Ro-1-699 (Ходсон) o,337 o,261 o,381 *****
Ro-1-717 (Ходсон) o,211 o,141 o,465 o,2o6 *****
Ro-1-722 (Ходсон) o,165 o,o92 o,414 o,247 o,116 *****
Ro-2-617 (Ходсон) o,199 o,141 o,518 o,319 o,166 o, 153 *****
Ходсон L (n=13) o,531 o,469 o,569 o,319 o,443 o,477 o,564 *****
Ro-1-731 (Ходсон-L) o,21o o,172 o,5o9 o,254 o,134 o,16o o,186 o,439 *****
Ro-2-616 (Ходсон-L) o,264 o,212 o,6o4 o,312 o,172 o,212 o,186 o,534 o,141 *****
Ro-2-623 (Ходсон-L) o,225 o,2o6 o,594 o,365 o,219 o,192 o,179 o,524 o,172 o,o86 *****
Ходсон у (n=16) o,548 o,524 o,594 o,332 o,455 o,5o8 o,59o o,o64 o,455 o,56o o,557 *****
Ro-1-651 (Ходсон-Y) o,272 o,172 o,358 o,199 o,147 o,147 o,226 o,365 o,166 o,247 o,268 o,374 *****
Ro-1-688 (Ходсон-Y) o,217 o,128 o,334 o,179 o,116 o,1o4 o,2o6 o,446 o,16o o,24o o,275 o,459 o,11o *****
Ro-1-715 (Ходсон-Y) o,295 o,186 o,456 o,268 o,147 o,1725 o,24o o,339 o,166 o,219 o,254 o,368 o,141 o,16o *****
Ro-2-615 (Ходсон-Y) o,257 o,172 o,5o9 o,297 o,199 o,199 o,212 o,536 o,166 o,166 o,226 o,565 o,261 o,212 o,247 *****
Наибольшими генетическими отличиями от исходной формы характеризуются сомаклоны Ио-1-691 и Я^-1-699 в первой группе, Я^-2-616 и Я^-2-623 - во второй и Я^-2-615 - в третьей (табл. 4). Однако уровень генетической изменчивости исследованных сомаклонов не зависит от длительности культивирования первичных эксплантов на питательной среде.
Таблица 4 - Значения генетических дистанций между сомаклонами и выборками
их исходных форм и длительность культивирования сомаклонов in vitro
Сомаклон Длительность культивирования in vitro, сут. Генетические дистанции (DN)
Ходсон Ходсон-Z Ходсон-Y
Ro-1-69o (Ходсон) 7-14 o,1789 o,4695 o,5235
Ro-1-691 (Ходсон) 7-14 o,5451 o,5694 o,5937
Ro-1-699 (Ходсон) 7-14 o,3369 o,3188 o,3324
Ro-1-717 (Ходсон) 7-14 o,21o8 o,4433 o,4547
Ro-1-722 (Ходсон) 7-14 o,1646 o,4772 o,5o84
Ro-2-617 (Ходсон) 32 o,1993 o,5645 o,59o4
Ro-1-731 (Ходсон-Z) 7-14 o,2o98 o,4393 o,455o
Ro-2-616 (Ходсон-Z) 48 o,2643 o,534o o,5596
Ro-2-623 (Ходсон-Z) 57 o,2249 o,5245 o,5571
Ro-1-651 (Ходсон-Y) 7-14 o,2722 o,365o o,3735
Ro-1-688 (Ходсон-Y) 7-14 o,2173 o,4456 o,4589
Ro-1-715 (Ходсон-Y) 7-14 o,2952 o,3392 o,3678
Ro-2-615 (Ходсон-Y) 31 o,2566 o,5355 o,5646
Длительность культивирования семядольных узлов сорта Ходсон не влияет на генетическую изменчивость его сомаклонов. В то время, как для возникновения генетической дифференциации сомаклонов популяций Ходсон-Х и Ходсон-у от их исходных форм, вероятно, необходимо более длительное культивирование (см. табл. 4).
К третьему поколению из числа изучаемых нами сомаклонов были исключены стерильные, слабофертильные формы с нежизнеспособными семенами, а также непродуктивные и характеризующиеся другими отрицательными признаками (Ко-1-691, Ко-1-699, Ко-1-690, Ко-2-617, Ио-1-651 и Ко-1-688). Среди оставшихся сомаклонов по биохимическим показателям (содержание белка, гистидина, линолевой и олеиновой кислот) исходную форму превышали: сомаклон R617 первой группы (От 0,1993), все сома-клональные линии второй группы и регенерант R615 третьей группы (От о,5646) (табл. 5).
Кроме того, сомаклон R623 второй группы (От 0,5245) обладал высоким уровнем устойчивости к церкоспорозу, а регенерант Я715 третьей группы (От о,3678) характеризовался высоким уровнем устойчивости к пероноспорозу и церкоспорозу.
Таблица 5 — Сомаклональные линии сои третьего поколения, имеющие преимущество перед исходными формами по некоторым признакам
Исходная форма (и.ф.), выделившаяся сомаклональ-ная линия (К) Продук- тив- ность, г/раст. Содержание в семенах масла, % Содержание кислоты, % от общего количества масла в семенах Содержание белка в семенах, % Содержание гистидина, от общего количества аминокислот, % Степень поражения патогенами листовой поверхности, %
лино- левая линоле- новая олеи- новая септо- риоз церко- спо- роз перо- но- спороз
Ходсон (и.ф.) 7,6 2о,2 51,5 4,9 6,5 38,5 8,3 62,5 68,8 82,5
К-617 9,5* 2о,5 52,6* 3,7 1о,4* 38,4 1о,2* 43,8 52,5 57,5
Ходсон-Ь (и.ф.) 7,5 21,2 51,9 4,8 4,5 37,4 1о,7 50,0 57,5 70,0
К-616 6,3 21,6 52,3 5,0 4,8 39,3* 11,9* 41,3 29,8* 56,3
К-623 6,1 2о,о 52,4 4,4 8,6 39,2* 1о,3 35,0* 24,8* 57,5
К-731 8,2 21,5 51,9 5,4 4,3 37,6 11,9* 41,3 37,5 71,3
Ходсон-у (и.ф.) 7,7 2о,5 52,2 5,5 9,о 37,7 1о,3 41,3 52,5 58,8
К615 6,6 2о,о 52,7 * 3, 1о,7* 38,1* 9,6 40,0 47,5 58,8
К715 6,9 2о,3 51,7 4,7 6,5 38,1* 1о,9 42,5 33,8* 50,0*
Примечание: * - достоверно превосходит исходную форму на 5% -ном уровне
Следует отметить, что регенерантные формы, имеющие наибольшие генетические отличия от исходных форм, не всегда выделяются по биохимическим показателям, тогда как сомаклоны со средним ^715) и низким ^617) уровнем генетической изменчивости могут превышать исходную форму по селекционным признакам. В результате исследований в третьем поколении были выделены сомаклоны: R616, R623 и R617, которые рекомендованы селекционерам в качестве исходного материала для селекции сои в Приморском крае.
На рисунке представлена некорневая дендрограмма генетических взаимоотношений между исследуемыми образцами. Анализируемые растения распределились в два кластера: первый объединяет с высокой степенью достоверности (индекс бутстрепа 100 %) все растения популяций Ходсон-Х и Ходсон-у, которые группируются соответственно их происхождению; второй объединяет все растения исходного сорта Ходсон (индекс бутстрепа 100 %) и все исследуемые сомаклоны, за исключением двух (Ио-1-691 и Ио-1-699). Эти два сомаклона сорта Ходсон имеют наибольшие генетические отличия как от исходной формы, так и от всех других.
Рисунок - Некорневая дендрограмма генетических взаимоотношений между растениями сорта Ходсон, популяций Ходсон-у и Ходсон-L и их сомаклонами.
Выводы. В результате проведенных исследований выявлено, что растения, выращенные из ткани обработанных различными видами облучения семян сорта Ходсон, генетически значительно отличаются от растений, выращенных из необработанных семян. Среди сомаклонов популяций Ходсон-у и Ходсон-L выделены регенераты, характеризующиеся повышенным содержанием белка, гистидина, линолевой и олеиновой кислот, а также более высокой устойчивостью к церкоспорозу и септориозу по сравнению с их исходными формами. Уровень генетической изменчивости сомаклонов не зависит от длительности культивирования первичных эксплантов на питательной среде.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ДВО РАН №05-П-CХ-06-002C "Методы биотехнологии в селекции сои и риса".
Список литературы
1. Larkin, P.J. Somaclonal variation -a novel source of variability from cell cultures for plant improvement/ P.J. Larkin, P.J., W.R. Scowcroft // Theor . Appl. Genet. -1981. - Vol. 60. - P.197-214.
2. Рожанская, О.А. Создание исходного материала для селекции кормовых культур в условиях Сибири с помощью методов биотехнологии: автореф. дис...доктора биол. наук: 06.01.05 / О.А. Рожанская. -Санкт-Петербург, 2007. - 35 с.
3. Дидоренко, С.В. Состояние и перспективы развития селекции зернобобовых культур на юго-востоке Казахстана // С.В. Дидоренко, Ю.Г. Карягин, Б.М. Жанысбаев // Кормопроизводство. -2008. - № 5. - С.19-21.
4. Ващенко, А.П. Итоги научных исследований по сое за 2004-2007 гг. в Приморском НИИСХ и задачи НИР на последующий период // Современные проблемы селекции и технологии возделывания сои: сб. статей 2-й Междунар. конф. по сое, Россия, Краснодар, 9-10 октября 2008 г. РАСХН, ВНИИМК. - Краснодар, 2008. - С. 150-154.
5. Wright, M.S. Plant regeneration from tissue cuitures of soybean by organogenesis / M.S. Wright, M.G. Games et al. // Cell. Cult. Som. Cell. Genenet. Plants. - 1986. - Vol. 3. - P.111. -119.
6. Graybosch, R.A. Somaclonal variation in soybean. Plants regenerated from the Cotyledonary node tissue culture system / R.A. Graybosch, M.E. Edge, X. Delannay // Crop Science. - 1987. - Vol. 27. - № 4. - P. 803-806.
7. Freytag, A.H. Somaclonal variation in soybean plants regenerated from culture / A.H. Freytag,
A.P. Rao-Arelli, S.C. Anand et al. // Plant Cell. Rep. - 1989. - Vol. 8. - N 4. - P. 199-202.
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (142-143), 2010
8. Рожанская, О.А. Соя и нут в Сибири: культура тканей, сомаклоны, мутанты. - Новосибирск : Юпитер, 2005. - 155 с.
9. Гужов, Ю.Л. Селекция и семеноводство культурных растений / Ю.Л. Гужов, А.Фукс, П. Ва-личек; под ред. Ю.Л. Гужова. - М.: Агропромиздат, 1991. - 463 с.
10. Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. В.С. Шевелухи. - М.: Высшая шк., 1998. - 416 с.
11. Mc Coy, TJ. СytDgenetic and lysis of plants regenerated from oat (Avena sativa) tissue cultures; High frequency of partial chromosome loss / TJ. Mc Coy, R.L. Phillips, HW. Rines // Canad. J. Genet. а^ Cytol. - 1982. - Vol. 24. - P. 37-50.
12. Тильба, В.А. К вопросу определения численности клубеньковых бактерий сои в почве // Микробиологические и биохимические исследования почв: Конф. по методам микробиол. и биохим. исследований почв. 28-31 окт. 1969 г., Киев / ВАСХНИЛ [и др.]. - Киев. - Урожай, 1971. - С. 51-55.
13. Международный классификатор СЭВ рода Glycine Weld / [сост. СССР - Л.Щелко, Г.Седова.
В.Корнейчук; ЧСФР - Л.Пастухова, Г.Синский, П.Гофирек и др.]; ВАСХНИЛ, ВИР. - Л., 1990. - 46 с.
14. Методические указания по изучению устойчивости сои к грибным болезням / [сост. Н.И. Корсаков, А.М. Овчинникова, В.И. Мизева]; ВАСХНИЛ, ВИР. - Л., 1979. - 46 с.
15. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статист, обработки результатов исследований) / Б.А. Доспехов доп. и перераб. - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.
16. Козыренко, М.М. Анализ генетического разнообразия сортов и сомаклональных линий культурной сои (Glycine max (L.) Merr.) методом маркирования межмикросателлитных последовательностей (ISSR) / М.М. Козыренко, П.П. Фисенко, Е.В. Артюкова // Биотехнология. - 2007. - № 1. - С.3-13.
17. Nei, M., Li, W.H. Mathematical model for studying genetics variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1979. - 76. - P. 5269-5273.
18. MillerM.P. Tools for population genetic analysis (TFPGA) 1.3: A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. 1997. Computer software distributed by author.
19. Van de Peer Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. Van de Peer, R. De Wachter // Comput. Applic. Biosci. -1994. - V. 10. - P. 569-570.
