CC BY
33
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009
П. П. Фисенко1,
старший научный сотрудник, кандидат с.-х. наук А. В. Бабикова2,
младший научный сотрудник, аспирантка
О. С. Ефремова1,
младший научный сотрудник
1ГНУ Приморский НИИСХ Россельхозакадемии тел.: 8(4234)39-27-19, факс 8(4234)39-24-00 e-mail: fe.smc_rf@mail.ru
2Биолого-почвенный институт ДВО РАН 690000 г. Владивосток, ул. Проспект 100-летия Владивостока, 159 тел.: 8(4232)34-83-86
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ДЛИТЕЛЬНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА УРОВЕНЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ СОМАКЛОНОВ СОИ
Ключевые слова: соя, сомаклоны, уровень генетической изменчивости, виды ионизирующего излучения
УДК 575.174.015.3:633.853.52+581.143.5
Введение. Новая возможность расширения генетического разнообразия в селекции открылась с организацией биотехнологических методов исследований. Полученные на искусственных питательных средах в условиях in vitro растения-регенеранты, как правило, в той или иной степени отличаются от исходных форм и могут являться исходным материалом для традиционной селекции данной культуры, поскольку они представляют собой сомаклональные варианты [1].
Использование сомаклональной изменчивости в сочетании с отбором позволило О.А. Ро-жанской создать ценный селекционный материал сои, ярового рапса, нута, эспарцета, люцерны с признаками скороспелости, повышенной семенной и кормовой продуктивности, улучшенного химического состава, устойчивости к неблагоприятным гидротермическим условиям и патогенам [2].
В Казахстане группой ученых (С.В. Дидоренко, Ю.Г. Карягиным и Б.М. Жанысбаевым) сомаклональная изменчивость применяется как источник генетического разнообразия в создании новых форм сои [3].
В Приморском НИИСХ коллективом двух лабораторий: биотехнологии и селекции сои - с использованием метода культуры тканей создан первый в России сорт сои Приморская 81, который с 2004 г. районирован [4].
Важным моментом в технологии регенерации путем органогенеза являются условия, способствующие возникновению генетических изменений в рекомбинантах. По данным M.S. Wright и др. [5], дополнительные почки в пазухах семядольного узла сои закладываются de novo под влиянием 6-бензиламинопурина (БАП). R.A. Graybosch, M.E. Edge и X. Delannay [6] стимулировали побегообразование из вновь образовавшихся и ранее существовавших меристематических участков проводящей ткани семядольного узла на среде с БАП. Среди полученных линий исследователи наблюдали вариабильность по урожайности и другим признакам. A.H. Freytag с коллегами [7] изучали процесс регенерации растений сои из семядольного узла эксплантов эпикотиля. Авторы выявили генотипы, в потомстве регенерантов у которых отклонения от нормы появлялись чаще.
По мнению Рожанской [8], изоляция семядольных узлов на стадии развития проростка нарушает контролирующее влияние организма, приводит к неорганизованной пролиферации ткани и способствует возникновению генетических изменений у адвентивных почек, формирующихся в семядольных пазухах изолированных узлов.
Величины вариабельности признаков у регенерантов сои недостаточно высокие, поэтому с целью повышения генетического разнообразия мы использовали в качестве исходных эксплантов ткани мутантов. Существует много приёмов получения индуцированных мутаций. В основе их лежит воздействие на организм различными физическими и химическими факторами, называемыми мутагенами. Действуя ими на растения, можно резко повысить их мутационную изменчивость. В селекционной работе используются любые виды ионизирующих излучений. Наиболее широко применяют рентгеновское, гамма- и нейтронное излучения. [9].
Наряду с этим существует вопрос о влиянии длительности культивирования на уровень генетической изменчивости сомаклонов сои. Как считают некоторые исследователи, уровень изменчивости сомаклонов повышается при более продолжительном культивировании ткани. Рядом авторов В.С. Шевелуха и др. [10], Мс Coy и др. [11] определено, что чем длительнее эксплант находится на питательной среде, тем больше вероятность получить регенеранты, отличающиеся от исходных форм.
Однако по данным M.S. Wright и др. [5], проводивших гистологический анализ пазух семядольного узла у исследуемых ими растений сои, через 6 дней после прорастания семян на среде с БАП базальные участки эпикотиля и семядолей, примыкающие к придаточным почкам, становятся меристематическими зонами. В эпидермальных и субэпидермальных тканях формируются прорегенеративные очаги, способные к морфогенезу, возникают новообразования -дополнительные адвентивные почки.
На основании вышеизложенных результатов и мнений ученых, нами была поставлена задача выяснить, оказывают ли влияние различные виды ионизирующего излучения и длительность культивирования на уровень генетической изменчивости сомаклонов сои.
Материалы и методы. Исследования проводились в лаборатории биотехнологии Приморского НИИСХ, в качестве исходных форм использовали сорт Ходсон и его мутанты. Для получения мутантов сухие семена обрабатывали в Институте цитологии и генетики СО РАН следующими электромагнитными излучениями: красным когерентным светом оптического квантового гелий-неонового генератора (лазера) с длиной волны 632,8 нм при плотности потока мощностью 0,08 мВт/см2 в течение 15 мин; у-излучением кобальтовой пушки в дозе 50 грей.
В качестве первичных эксплантов использовали семядольные узлы стерильных микрорастений. Для получения последних зрелые семена стерилизовали в разделительной воронке концентрированной серной кислотой (H2SO4) в течение 2-х мин, с последующей многократной отмывкой стерильной дистиллированной водой согласно методике, предложенной А.М. Смирновым, в изложении В.А. Тильбы [12].
Регенерацию осуществляли по рекомендации M.S.Wright и M.G. Carnes [5].
Семядольные узлы культивировали на питательной среде 1/2MS + БАП (1,13 и 0,23 мг/л) до 60 дней. Адвентивные побеги, образовавшиеся de novo через 7-14 дней (R0-1) и через 31-60 дней (R0-2), снимали и помещали на среду 1/2MS+ИМК (0,5 мг/л), не содержащую БАП, для дальнейшего роста и развития.
Степень поражения (%) грибными патогенами: септориозом (Septoria glycines), церкоспоро-зом (Сercospora sojina), пероноспорозом (Peronospora manshurica) - определяли при искусственном заражении листовой поверхности на жестком инфекционном фоне совместно с сотрудниками лаборатории селекции сои ПримНИИСХ по методике ВИР [13] и согласно Международному классификатору [14].
Биохимический состав семян исходных форм и регенерантных линий проведен во ВНИИ сои на ИК-сканере Nir-42 по следующим показателям: аминокислоты (аргинин, валин, пролин, глютамин, лизин, гистидин, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, аланин+глицин, треанин, серин, аспарагиновая кислота), жирные кислоты (пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линоле-вая, линоленовая), минеральные элементы (К, Са, Р, Mg), белок, масло. Оценка сомаклонов по химическому составу дана на основании классификатора [14].
Регенеранты третьего поколения выращивали в полевых условиях в соответствии с принятой для Приморского края агротехникой.
Статистическая обработка материала проведена методом дисперсионного анализа в изложении Б.А. Доспехова [15].
Для проведения генетического анализа все исследуемые образцы были разделены на три группы, каждая из которых была представлена растениями исходной формы и ее сомаклонами. Первая группа - сорт Ходсон и сомаклоны Rq-1-690, Rq-1-691, Ro-1-699, Rq-1-717, Rq-1-722 и Ro-2-617. Вторая группа - популяция Ходсон-Z, растения которой получены из облученных лазером семян, и сомаклоны R0-1-731, R0-2-616 и R0-2-623. Третья группа - популяция Ходсон-у, растения которой получены из облученных у-излучением семян, и сомаклоны R0-1-651, R0-l-688, R0-1-715 и R0-2-6l5.
Выделение ДНК и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в БПИ ДВО РАН, как было описано нами ранее [16]. Для анализа полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК 52 образцов использовали 12 праймеров, комплементарных к микросателлитным повторам (табл. 1). При оценке электрофореграмм учитывали только четко видимые и воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты (ампликоны). Для каждого из праймеров были составлены бинарные матрицы, в которых присутствие или отсутствие в спектре фрагментов с одинаковыми молекулярными массами обозначали как "1" или "0". Разная интенсивность полос одинаковых по размеру ампликонов у сравниваемых образцов не учитывалась. Для определения длины фрагментов использовали маркер молекулярных масс - EcoRI + HindIII-рестрикты ДНК фага лямбда (Fermentas, Литва).
Таблица 1 - Праймеры, используемые в данной работе
Код праймера Нуклеотидная последовательность (5'-3') Код праймера Нуклеотидная последовательность (5'-3')
пр812 (GA)8T npC1 (AGC)6T
пр825 (AC)8T (AGC)6C
пр840 (GA)8(CT) t прС4 (AGC)6G
пр842 (GA)8(CT)G ^C5 (TCG)6G
пр888 (CGT) (ACT) (CGT) (CA)7 (CA)8TG
пр889 (AGT) (CGT) (AGT) (AC)7 прБ10 (GA)8TC
Объединенная бинарная матрица была использована для расчета частот фрагментов, доли полиморфных локусов (Р), генного разнообразия (Н и индекса Шеннона (57) с помощью пакета программ POPGENE [17]. Для определения генетических расстояний Нея-Ли и построения дендрограммы генетических взаимоотношений между отдельными растениями на основе значений посредством невзвешенного парно-группового метода кластерного анализа (UPGMA) с бутстрэпными оценками степени надежности порядка ветвления (1000 реплик) использовали пакет программ TREECON [18, 19].
Результаты и обсуждения. В результате ISSR-анализа выявлено 183 фрагмента, из них 164 были полиморфными. Популяция Ходсон-у характеризовалась наибольшим уровнем полиморфизма и значениями генного разнообразия и индекса Шеннона, чем все другие исследуемые популяции исходных форм (табл. 2).
Таблица 2 — Основные показатели генетической изменчивости исходных форм сои
Сорт/популяция Доля полиморфных локусов (P, %) Генное разнообразие (H) Индекс Шеннона (SI)
Ходсон 12,57 0,041 0,062
Ходсон-L 10,93 0,040 0,062
Ходсон-у 18,03 0,063 0,099
Генетические дистанции между парами анализируемых образцов (популяций) варьировали, достигая 10-кратного различия (табл 3). Наименьшее значение (0,0642) отмечено между исходными популяциями Ходсон-у и Ходсон-Х, наибольшее (0,6043) - между сомаклоном Ro-2-616 популяции Ходсон-Х и сомаклоном R0-1-691 сорта Ходсон.
Наибольшими генетическими отличиями от исходной формы характеризуются сомаклоны Ио-1-691 и К^-1-699 в первой группе, Я^-2-616 и Я^-2-623 - во второй и Я^-2-615 - в третьей (табл. 4). Однако уровень генетической изменчивости исследованных сомаклонов не зависит от длительности культивирования первичных эксплантов на питательной среде.
Таблица 4 - Значения генетических дистанций между сомаклонами и выборками
их исходных форм и длительность культивирования сомаклонов in vitro
Сомаклон Длительность культивирования in vitro, сут. Генетические дистанции (DN)
Ходсон Ходсон-L Ходсон-у
R0-1-690 (Ходсон) 7-14 0,1789 0,4695 0,5235
Ro-1-691 (Ходсон) 7-14 0,5451 0,5694 0,5937
R0-1-699 (Ходсон) 7-14 0,3369 0,3188 0,3324
R0-1-717 (Ходсон) 7-14 0,2108 0,4433 0,4547
R0-1-722 (Ходсон) 7-14 0,1646 0,4772 0,5084
R0-2-617 (Ходсон) 32 0,1993 0,5645 0,5904
R0-1-731 (Ходсон-L) 7-14 0,2098 0,4393 0,4550
R0-2-616 (Ходсон-L) 48 0,2643 0,5340 0,5596
R0-2-623 (Ходсон-L) 57 0,2249 0,5245 0,5571
R0-1-651 (Ходсон-у) 7-14 0,2722 0,3650 0,3735
R0-1-688 (Ходсон-у) 7-14 0,2173 0,4456 0,4589
R0-1-715 (Ходсон-у) 7-14 0,2952 0,3392 0,3678
R0-2-615 (Ходсон-у) 31 0,2566 0,5355 0,5646
Длительность культивирования семядольных узлов сорта Ходсон не влияет на генетическую изменчивость его сомаклонов. В то время, как для возникновения генетической дифференциации сомаклонов популяций Ходсон-Х и Ходсон-у от их исходных форм, вероятно, необходимо более длительное культивирование (табл. 4).
К третьему поколению из числа изучаемых нами сомаклонов были исключены стерильные, слабофертильные формы с нежизнеспособными семенами, а также непродуктивные и характеризующиеся другими отрицательными признаками (^-1-691, ^-1-699, ^-1-690, ^-2-617, ^-1-651 и Ио-1-688). Среди оставшихся сомаклонов по биохимическим показателям (содержание белка, гис-тидина, линолевой и олеиновой кислот) исходную форму превышали: сомаклон Я617 первой группы (Ох 0,1993), все сомаклональные линии второй группы и регенерант Я615 третьей группы (Ох 0,5646) (табл. 5). Кроме того, сомаклон Я623 второй группы (Ох 0,5245) обладал высоким уровнем устойчивости к церкоспорозу, а регенерант Я715 третьей группы (Ох 0,3678) характеризовался высоким уровнем устойчивости к пероноспорозу и церкоспорозу.
Следует отметить, что регенерантные формы, имеющие наибольшие генетические отличия от исходных форм, не всегда выделяются по биохимическим показателям, тогда как сомаклоны со средним (Я715) и низким (Я617) уровнем генетической изменчивости могут превышать исходную форму по селекционным признакам. В результате исследований в третьем поколении были выделены сомаклоны: Я616, Я623 и Я617, которые рекомендованы селекционерам в качестве исходного материала для селекции сои в Приморском крае.
На рисунке представлена некорневая дендрограмма генетических взаимоотношений между исследуемыми образцами. Анализируемые растения распределились в два кластера: первый объединяет с высокой степенью достоверности (индекс бутстрепа 100 %) все растения популяций Ходсон-Х и Ходсон-у, которые группируются соответственно их происхождению; второй объединяет все растения исходного сорта Ходсон (индекс бутстрепа 100 %) и все исследуемые сомаклоны, за исключением двух (И0-1-691 и И0-1-699). Эти два сомаклона сорта Ходсон имеют наибольшие генетические отличия как от исходной формы, так и от всех других.
