CC BY
21ITS improvement by use of chromogenic medium and PCR. Int. J. Food Microbiol. 2012,157 (2): 189-194.
47. Sarma Z., Heifetz M., Talmor J. et al. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 1998, 36 (4): 990-994.
48. Sikora A.E., Beyhan S., Yildiz F.H. Cell envelope perturbation induces oxidative stress and changes in iron homeostasis in Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 2009,191 (17): 5398-5408.
49. Townsley L„ Mangus M.P.S., Mehic S„ Yildiz F.H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shifte: CspV regulation of VI secretion, biofilm formation, and association with zooplancton. Appl. Environ. Microbiol. 2016, 82 (14): 4441-4452.
50. Xu Q., Dziejman M., Mekalanos JJ. Determination of the transcriptome of Vibrio cholerae during intraintestinal growth and midexponential phase in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003, 100(3): 1285-1291.
Поступила 15.11.16
Контактная информация: Мазрухо Алексей Борисович, к.м.н.,
344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40, р.т. (863)240-27-03
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
ИА.Иванова, Б.Н.Мишанькин, И.А.Беспалова,
H.Д.Омельченко, Е.С.Шипко, А.В.Филиппенко
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУР ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Потребность в эффективной и экономичной вакцине против холеры продолжает оставаться актуальной в связи с появлением новых штаммов, которые вызывают тяжелые клинические формы холеры и могут вытеснить штаммы седьмой пандемии, а также угрозе выноса инфекции из эндемичных стран. В обзоре представлены литературные данные об использовании белков наружных мембран, везикул, «теней» возбудителя холеры для специфической профилактики и диагностики этого заболевания.
Журн. микробиол., 2017, № 2, С. 110—115
Ключевые слова: белки наружных мембран, везикулы, «тени» возбудителя холеры, вакцина
I.A.Ivanova, B.N.Mishankin, LA.Bespalova, N.D.Omelchenko, E.S.Shipko, A.V.Filippenko
USE OF VIBRIO CHOLERAE SURFACE STRUCTURES FOR SPECIFIC PROPHYLAXIS AND DIAGNOSTICS OF CHOLERA
Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control, Russia
The need for efficient and cost-effective cholera vaccine hasn't lost its actuality in view of the emergence of new strains leading to severe clinical forms of cholera and capable to replace strains of the seventh cholera pandemic, and in connection with the threat of cholera spreading beyond the borders of endemic countries. In this review data from literature sources are presented about the use of outer membrane proteins, vesicles, cell ghosts of the cholera causative agent in specific prophylaxis and diagnostics of the disease.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 2, P. 110—115
Key words: outer membrane proteins, vesicles, cell ghosts of cholera causative agent, vaccine 110
Во время текущей пандемии получены противоречивые данные об эффективности специфической профилактики холеры и ее применении в случаях завоза инфекции из внеэндемичных территорий. В соответствии с этим менялась официальная точка зрения экспертов ВОЗ и национальных служб здравоохранения на эту проблему [10]. Идеальной вакцины, которая бы отвечала всем требованиям ВОЗ, до сих пор не существует [24]. Атгенуированные вакцины способны индуцировать мощный протек-тивный ответ после однократного применения, но могут оказывать и негативное действие на больных с ослабленным иммунитетом. Убитые вакцины с успехом продемонстрировали свой потенциал по защите населения эндемичных районов, однако не способны обеспечить долгосрочную защиту и не подходят для детей в возрасте до двух лет. Кроме того, они принимаются в несколько доз [30]. Существенным препятствием для усовершенствования химических вакцин против холеры является недостаточность сведений о природе протективных антигенов холерного вибриона. Вместе с тем, установлено, что антигены, ответственные за формирование антибактериального иммунитета, локализованы, главным образом, на наружных мембранах (НМ) возбудителя, поэтому исследования по совершенствованию средств иммунопрофилактики и иммунодиагностики холеры тесно связаны с поверхностными структурами холерного вибриона [3].
Белки наружной мембраны различных бактерий играют двойственную роль во взаимоотношениях патогена с иммунной системой организма-хозяина. С одной стороны, наружные белки являются факторами патогенности, подавляющими отдельные стадии иммунной защиты хозяина, с другой — представляют собой молекулы-мишени для системы врожденного иммунитета макроорганизма, активируя факторы немедленной защиты и участвуя в формировании специфического иммунного ответа [8]. Поэтому понимание структуры и свойств белкового состава бактериальной наружной мембраны необходимо при разработке противоинфекционных препаратов и вакцин [17]. Кроме того, препараты, созданные на основе белков НМ бактерий, могут защищать от инфекции, вызываемой всеми типами данного вида микроорганизма, и являются перспективными доя профилактики родственных инфекций [8].
Наружные мембраны Vibrio cholerae содержат белки (Ошр), продукция которых регулируется в ответ на желчь, осмолярность, колебания рН и другие сигналы окружающей среды. В составе мембранных пузырьков поверхностные белки могут принимать участие в транспорте различных токсинов, ферментов, ДНК и т.д. в клетки хозяина во время колонизации кишечника [21], что предполагает их важную роль в индукции иммунного ответа макроорганизма. Белки внешней мембраны возбудителя холеры являются видоспецифическими антигенами и способны вызывать образование агглютинирующих и вибриоцидных антител, перекрестно реагирующих с вибрионами разных серогрупп [16]. Ранее сообщалось о наличии иммуногенной активности у белка OmpW (22 кДа), присутствующего практически у всех исследованных штаммов холерных вибрионов [16], и OmpV (25 кДа), связанного с пептидо-гликаном белка теплового шока [35]. Мишанькиным Б.Н. и др. [5] получены данные о наличии протективных и иммуногенных свойств у ОшрТ (около 40 кДа) возбудителя холеры, что может быть полезным для совершенствования специфической профилактики этого заболевания.
Иммуногенными свойствами обладают и токсин-корегулируемые пили адгезии (Тер) [11,33]. Антитела против Тер, образующиеся непосредственно к белкам, входящим в состав дисульфидной петли, оказывают протективное действие при экспериментальной холере [27], предотвращая развитие инфекционного процесса на его первой стадии — колонизации. Включение Тер в состав вакцинных препаратов может усилить их иммуногенность [2], так как адгезины вызывают выработку секреторных антител класса А, предотвращающих колонизацию кишечника. Фактор колонизации белок TcpF, продуцируемый V. cholerae 01 и 0139 серогрупп, вызывает интерес исследователей как потенциальный протективный антиген. При оценке иммуногенности и прогективности выявлен дополнительный протективный эффект при сочетании его с В субъединицей холерного токсина (ХТВ) [31]. Показано, что рекомбинантная субъединица А токсин-корегулируемых пилей (ТсрА) холерного вибриона может использоваться в качестве носителя в оральной вакцине против холеры как самостоя-
тельно [19], так и совместно с ХТВ в качестве иммуногенов при разработке эффективной мультивалентной субъединичной вакцины против V. с1ю1егае [32].
Экстрацеллюлярная секреция продуктов является основным механизмом «общения» грамогрицательных возбудителей с макроорганизмом. Патогенные и непатогенные виды грамотрицательных бактерий выделяют везикулы (пузырьки), которые служат транспортным средством для секретируемых белков и липидов и играют важную роль в колонизации, передавая факторы вирулентности в клетки хозяина, причем механизмы пузырек-опосредованной доставки токсинов очень разнообразны. Анализ биохимических и функциональных характеристик везикул продемонстрировал, что они содержат адгезины, токсины и иммуномодулирующие соединения, благодаря чему опосредуют проявление бактериальных и инвазивных свойств, являются причиной цитогоксичности, а также активируют иммунную систему макроорганизма [21, 26]. Сохранение нативной структуры мембранных антигенов и хорошая физико-химическая стабильность делают везикулы наружных мембран (ОМУ) привлекательными для использования их в качестве вакцин, адъювантов, в лекарственной терапии бактериальных и вирусных болезней [28].
Холерный вибрион, как и все грамотрицательные бактерии, выделяет для транспорта важных факторов вирулентности ОМУ, которые представляют собой образования сферической формы размером от 20 до 200 нм. Показано, что ОМУ играют важную роль в доставке ХТ к клеткам эпителия тонкого кишечника [14]. Также установлено, что взаимодействие ОМУ с эпителиальными клетками кишечника модулирует про-воспалительный ответ клеток эпителия и активирует дендритные клетки, что способствует дифференциации Т-клеток в сторону ТЬ2/ТЬ17 ответа [15].
О возможности использования ОМУ холерного вибриона для специфической профилактики холеры свидетельствуют результаты, полученные за рубежом. Показано, что оральная или интраназальная иммунизация животных ОМУ индуцировала долгосрочную иммунную защиту от заражения холерой и защищала потомство от колонизации кишечника возбудителем. Независимо от способа иммунизации у мышей регистрировался выраженный иммунный ответ на различные антигены, присутствующие в ОМУ [23,36, 37]. Иммунизация ОМУ холерного вибриона самок мышей снижала колонизацию бактериями кишечника новорожденных мышат, инфицированных V. сЬо1егае: после заражения достоверно уменьшалось количество вибрионов, а также снижалась инфицирующая способность бактерий, выделяемых во внешнюю среду с фекалиями [12,13]. Индийские авторы выявили, что пероральная иммунизация ОМУ V. сЬо1егае вызывала формирование серогруппоспецифического иммунитета и защищала иммунизированных взрослых мышей от заражения гетерогенными штаммами этого возбудителя, что может быть полезным для создания новой вакцины против циркулирующих штаммов [38]. Японскими авторами также показано, что оральная иммунизация очищенными ОМУ холерного вибриона индуцировала высокие титры специфических антител, которые оказывали вибриоцидное действие на гомологичные и некоторые гетерологичные штаммы V. сЬо1егае. Кроме того, ОМУ обладали протекгивными свойствами и защищали кроликов от последующего заражения холерой. Было также установлено, что ОМУ достоверно менее реактогенны, чем живые и убитые бактерии, что свидетельствует о перспективности их использования для профилактики этого заболевания [34].
Другим направлением в плане совершенствования профилактики инфекционных болезней является исследование иммуногенных и протекгивных свойств так называемых «теней», у которых сохраняются все поверхностные структуры. «Тени» проявляют адъювантные свойства и вызывают формирование гуморального и клеточного иммунного ответа на антигены. Протекгивные антигены могут быть представлены как на внутренней, так и на наружной мембране «теней». После очистки и лиофили-зации препараты «теней» могут сохраняться при комнатной температуре достаточно долго. Цикл производства от исходной культуры до прививки очищенным препаратом занимает не более одного дня и, таким образом, отвечает современным критериям быстрого производства вакцины, что позволяет не хранить ее большие запасы [22]. Все вышеперечисленное обусловливает повышенный интерес исследователей к этим бактериальным структурам.
Поданным ЕО. Еко й а1. [18] оральная иммунизация кроликов «тенями» клеток V. сЬо!егае О! и 0139 серогрупп стимулировала образование высокого титра вибрио-цидных антител.
Для конструирования искусственных вакцин иркутскими исследователями были использованы наружные мембраны клеток возбудителя холеры, полученные в результате разрушения и инактивации вибрионов Эль тор мочевиной с последующей обработкой их трипсином [3]. Предложенный препарат был нетоксичен, обладал имму-ногенностью и протективностью, что позволило рекомендовать его в качестве основы, обеспечивающей формирование эффективного антибактериального иммунитета, для конструирования оральной бесклеточной холерной вакцины [4, 9].
В Ростовском-на-Дону противочумном институте выявлены иммуноген-ная и протективная активности у НМ холерного вибриона, выделенных щадящими методами из штамма V. сЬо1егае Е1 Юг 18950 (<Лх~, к;р~, ОтрТ+, Отри-, Отр\¥+). Иммунизация мышей и взрослых кроликов НМ предотвращала развитие холеры у экспериментальных животных, зараженных вирулентными штаммами возбудителя, причем этот эффект сохранялся до 5 месяцев поствакцинального периода (срок наблюдения) [6].
Антитела, полученные к белковым компонентам НМ бактериальных клеток, также обладают протективным эффектом [20, 25]. М. Бае е1 а1. [16] показали, что антисыворотки к белкам НМ холерного вибриона значительно снижают секрецию жидкости в петлях тонкого кишечника взрослых кроликов при заражении их гомологичным штаммом возбудителя холеры, а комбинация антисывороток к разным белкам — у зараженных гетерологичными вибрионами серотипа Огава и штаммов 0139 животных.
В последние годы развивается направление по использованию белков наружных мембран для диагностики инфекционных болезней. Разработан быстрый МАЬОГ-ТОЕ МБ анализ, который может выявлять эпидемические штаммы возбудителя холеры 01/0139 и другие патогенные вибрионы по различию в массе белка Отри, аминокислотная последовательность которого у эпидемически значимых штаммов холеры является уникальной и высоко консервативной [29]. Для детекции эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов Эль тор 01 и 0139 серогупп Евдокимовой В.В. и др. [1] получены моноклональные антитела, которые выявляют антигенные детерминанты белковой природы, представленные только у штаммов холерных вибрионов 01, 0139 с генетической характеристикой Ох+ 1:ср" и с1х~ 1ср+.
Таким образом, знание строения и свойств поверхностных структур возбудителей может серьезно повлиять на разработку противоинфекционных препаратов и вакцин, предназначенных для профилактики заболеваний, вызванных патогенными грамо-трицательными бактериями, в том числе и холеры. Это тем более актуально, так как до сих пор отсутствуют отечественные комплексные вакцины, обеспечивающие одновременную защиту от эпидемически опасных штаммов V. сЬо1егае двух серогрупп — 01 и 0139. Кроме того, для производства химических холерных вакцин используют высоковирулентные штаммы, применение которых требует больших материальных затрат для обеспечения биологической безопасности. В этой связи, разработка вакцинных препаратов нового поколения, а также создание универсальной технологии их производства является важным и перспективным направлением научных исследований [7].
ЛИТЕРАТУРА
1. Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Кретенчук О.Ф., Кругликов В.Д., Архангельская И.В., Бурша О.С. Моноклональные антитела ктермостабильным поверхностным антигенам холерных вибрионов 01 и 0139-серогруппы. Эпидемиол. и инф. болезни. 2015, 20 (3): 51-57.
2. Заднова С.П., Топорков А.В., Смирнова Н.И. Получение препарата токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона классического биовара и изучение его биохимических и иммунобиологических свойств. Проблемы особо опасных инфекций. 2003, 85: 69-75.
3. Марков Е.Ю., УрбановичЛ.Я., КолесникР.С., Голубинский Е.П., Саппо С.Г., Иванова
Т. А., Шкаруба Т.Т. Клеточные мембраны холерного вибриона как основа высокоимму-ногенного вакцинного препарата против холеры. Бюллетень ВСНЦ ССО РАМН. 2004,1: 127-132.
4. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Иванова Т.А., Николаев В.Б., Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Козлов С.Н. Методические рекомендации по получению вы-сокоиммуногенного препарата наружных мембран холерного вибриона Эль тор. Иркутск, 2013.
5. Мишанькин Б.Н., Иванова И.А., Дуванова О.В., Романова Л.В., Шипко Е.С., Омель-ченко Н.Д., Дорошенко Е.П., Беспалова И.А., Судьина Л.В., Филиппенко А.В. Мембранный белок OmpT холерного вибриона как возможный компонент химической вакцины. Цитокины и воспаление. 2014,13 (1): 114.
6. Омельченко Н.Д., Мишанькин Б.Н., Иванова И.А., Дуванова О.В., Романова Л.В., Шипко Е.С., Филиппенко А.В,ГаличеваА.Л., Беспалова И.А.ДорошенкоЕ.П. Изучение иммуногенных свойств наружных мембран холерного вибриона. Медицинская иммунология. 2015,17 (3s): 120-121.
7. Онищенко Г.Г., Попова А. Ю., Кутырев В.В., Смирнова Н.И., Щербакова С.А., Москвитина Э.А., Титова С.В. Актуальные проблемы эпидемиологического надзора, лабораторной диагностики и профилактики холеры в Российской Федерации. Журн. микробиол. 2016,1: 89-101.
8. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопро-филактики инфекционных заболеваний. Вестник ДВО РАН. 2004, 3: 35-44.
9. Урбанович Л.Я. Закономерности и механизмы формирования естественной резистентности организма под влиянием иммуногенного препарата клеточных мембран холерного вибриона (экспериментальное исследование). Автореф. дисс. д-ра мед. наук. Иркутск, 2000.
10. ЩуковскаяТН., СаяпинаЛ.В., Кутырев В.В. Вакцинопрофилактикахолеры: современное состояние вопроса. Эпвдемиол. и вакцинопрофилактика. 2009,2 (45): 62-67.
11. Asaduzzaman М„ Ryan Е.Т., John М. et al. The major subunit of the toxin-coregulated pilus TcpA induces mucosal and systemic immunoglobulin A immune responses in patients with cholera caused by Vibrio cholerae 01 and 0139. Infect. Immun. 2005, 72 (8): 4448-4454.
12. Bishop A.L., Schild S., Patimalla B. et al. Mucosal immunization with Vibrio cholerae outer membrane vesicles provides maternal protection mediated by antilipopolysaccharide antibodies that inhibit bacterial motility. Infect. Immun. 2010, 78 (10): 4402-4420.
13. Bishop A.L., Tarique A.A., Patimalla B, et al. Immunization of mice with Vibrio cholerae outer-membrane vesicles protects against hyperinfectious challenge and blocks transmission. J. Infect. Dis. 2012, 205 (3): 412-421.
14. Chatteijee D., Chaudhuri K. Association of cholera toxin with Vibrio cholerae outer membrane vesicles which are internalized by human intestinal epithelial cells. FEBS Lett. 2011, 589 (9): 1357-1362.
15. Chatteijee D., Chaudhuri K. Vibrio cholerae 0395 outer membrane vesicles modulate intestinal epithelial cells in a NODI dependent manner and induce dendritic cell-mediated Th2/ Thl7 responses. J. Biol. Chem. 2013,288 (6): 4299-4309.
16. Das M., Chopra A. K., Cantu J. M., Peterson J. W. Antisera to selected outer membrane proteins of Vibrio cholerae protect against challenge with homologous and heterologous strains of V. cholerae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998,22: 303-308.
17. Eko F.O., Mania-Pramanik J., Pais R. et al. Vibrio cholerae ghosts (VCG) exert immunomodulatory effect on dendritic cells for enhanced antigen presentation and induction of protective immunity. BMC Immunol. 2014, 15: 584-596.
18. Eko F.O., Schukovskaya Т., Lotzmanova E.Y. et al. Evaluation of the protective efficacy of Vibrio cholerae ghost (VCG) candidate vaccines in rabbits. Vaccine. 2003, 21: 3663-3674.
19. Kiaie S., Abtahi H., Mosayebi G. et al. Recombinant toxin-coregulated pilus A (TcpA) as a candidate subunit cholera vaccine. Iran J. Microbiol. 2014, 6 (2): 68-73.
20. Kubo A., Stephens R.S. Characterization and functional analysis of PorB, a Chlamydia porin and neutralizing target. Mol. Microbiol. 2000, 38 (4): 772-780.
21. KuehnMJ., KestyN.C. Bacterial outer membrane vesicles and the host pathogen interaction.
Genes Dev. 2005,19: 2645-2655.
22. Langemann Т., Koller V.J., Muhammad A. et al. The bacterial ghost platform system production and applications. Bioengineered Bugs. 2010, 1 (5): 326-336.
23.Leitner D.R., Feichter S., Schild-Prufert K. et al. Lipopolysaccharide modifications of a cholera vaccine candidate based on outer membrane vesicles reduce endotoxicity and reveal the major protective antigen. Infect. Immun. 2013,81 (7): 2379-2793.
24. Lopez A.L., Gonzales M.L., Aldaba J.G., Nair G.B. Killed oral cholera vaccines: history, development and implementation challenges. Ther. Adv. Vaccines. 2014, 2 (5): 123-136.
25. Marandi M.V., Mittal K.R. Role of outer membrane protein H (OmpH) and OmpA specific monoclonal antibodies from hybridoma tumors in protection of mice against Pasteurella mul-tocida. Infect. Immun. 1997, 65 (11): 4502-4508.
26. McBroom A. J., Kuehn M.J. Release of outer membrane vesicles by gram-negative bacteria is a novel envelope stress response. Molecular Microbiol. 2007, 63 (2): 545-558.
27. Meeck M.D., V&de Т.К., Taylor R.K., Wade W.F. Immune response genes modulate serologic responses to Vibrio cholerae TcpA pilin peptides. Infect. Immun. 2001, 69 (12): 76877694.
28. Olsen I., Amano A. Outer membrane vesicles offensive weapons or good samaritans? J. Oral Microbiol. 2015, 7: 27468:1-9.
29. Paauw A., Trip H., Niemcewicz M., Sellek R. et al. OmpU as a biomarker for rapid discrimination between toxigenic and epidemic Vibrio cholerae 01/0139 and non-epidemic Vibrio cholerae in a modified MALDI-TOF MS assay. BMC Microbiol. 2014,14:158.
30. Pastor M., Esquisabel A., Talavera A. et al. An approach to cold chain free oral cholera vaccine: in vitro and in vivo characterization of Vibrio cholerae gastro-resistant microparticles. Int. J. Pharm. 2013, 448 (1): 247-258.
31. Price G.A., Holmes R.K. Evaluation of TcpF-A2-CTB chimera and evidence of additive protective efficacy of immunizing with TcpF and CTB in the suckling mouse model of cholera. PLoS One. 2012, 7(8): e42434.
32. Price G.A., Holmes R.K. Immunizing adult female mice with a TcpA-A2-CTB chimera provides a high level of protection for the pups in the infant mouse model of cholera. PLoS Negl. Trop.Dis. 2014,8(12): e3356.
33. Rollenhagen J.E., Kalsy A., Cerda F. et al. Transcutaneous immunization with toxin-coregu-lated pilin A induces protective immunity against Vibrio cholerae 01 El Tor challenge in mice. Infect. Immun. 2006, 74 (10): 5834-5839.
34. Roy N., Barman S., Ghosh A. et al. Immunogenicity and protective efficacy of Vibrio cholerae outer membrane vesicles in rabbit model. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2010,60 (1): 18-27.
35. Sahu G.K., Chowdhury R., Das J. Heat shock response and heat shock protein antigens of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 1994,62 (12): 5624-5629.
36.Schild S., Nelson E.J., Bishop A.L., Camilli A. Characterization of Vibrio cholerae outer membrane vesicles as a candidate vaccine for cholera. Infect. Immun. 2009, 77(1): 472-484.
37. Schild S., Nelson E.J., Camilli A. Immunization with Vibrio cholerae outer membrane vesicles induces protective immunity in mice. Infect. Immun. 2008, 76 (10): 4554-4563.
38.Sinha R., Koley H., Nag D. et al. Pentavalent outer membrane vesicles of Vibrio cholerae induce adaptive immune response and protective efficacy in both adult and passive suckling mice models. Microbes Infect. 2015,17 (3): 215-27.
Поступила 10.01.17
Контактная информация: Иванова Инна Александровна, к.б.н.,
344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117,р.т. (863)234-23-11
