CC BY
101
involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive LysR-type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 2005; 57: 420-33. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2005.04700.x
10. Iwanaga M., Yamamoto K. New medium for the production of cholera toxin by Vibrio cholerae Ol biotype El Tor. J. Clin. Microbiol. 1985; 22: 405-8.
11. Svennerholm A.M., Wiklund G. Rapid GMl-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin. J. Clin. Microbiol. 1983; 17: 596-600.
12. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ДДСТ Method. Methods. 2001; 25: 402-8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262
13. Guarino A., Albano F., Guandalini S. Oral rehydration: toward a real solution. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2001; 33: S2-12.
14. Oh Y.T., Lee K.-M., Barl W., Raskin D.M., Yoon S.S. (p)ppGpp, a small nucleotide regulator, directs the metabolic fate of glucose in Vibrio cholerae. J. Biol. Chem. 2015; 290: 13 178-90. DOI: 10.1074/ jbc.M115.640466
15. WHO. New formula oral rehydration salts. WHO Drug Inform. 2002; 16: 113-203.
16. Dutta D., Bhattacharya M.K., Deb A.K., Sarkar D., Chatterjee A., Biswas A.B. et al. Evaluation of oral hypo-osmolar glucose-based and rice-based oral rehydration solutions in the treatment of cholera in children. ActaPaediatr. 2000; 89: 787-90. DOI: 10.1111/j.1651-2227.2000.tb00386.x
17. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49: 3739-49. DOI:10.1128/JCM.01286-11
18. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18 (1): 46-54. DOI: 10.1016/j. tim.2009.10.003
19. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H. et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and Classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48: 4283-6. DOI: 10.1128/ JCM.00799-10
20. Заднова С.П., Шашкова А.В., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Фенотипический и генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Проблумы особо опасных инфекций. 2012; 1 (111): 57-61. / Zadnova S.P., Shashkova A.V., Krasnov Ya.M., Smirnova N.I. Phenotypic and genetic analysis of altered variants of Vibrio cholerae biovar El Tor. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; 1 (111): 57-61. (in Russian)
Поступила 02.08.16
Zadnova S.P., Cheldyshova N.B., Kritskii AA, Adamov A.K., Devdariani Z.L., Kutyrev V.V.
COMPARATIVE ANALYSIS OF GLUCOSE METABOLISM IN STRAINS OF VIBRIO CHOLERAE, BIOVAR EL TOR
Federal Government Health Institution Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, 410005, Saratov, Russian Federation
Comparative analysis of glucose fermentation in typical strains of V. cholerae biovar El Tor isolated in the Russian Federation in 1970-1990 and highly virulent strains of genovariants imported in 1993-2012 was performed. It was demonstrated that the glucose metabolism of V. cholerae genovariants changed as the result of acquisition of classical CTX prophage (or only ctxB gene) and a corresponding increase in virulence. A phenotypical manifestation of these changes was a lack of ability to grow on a minimally nutrient medium supplemented with 1% carbohydrate, as well as compromised capacity for acetoin fermentation in the course of Voges-Proskauer reaction. Possible causes of the degraded glucose metabolism are associated with the presence of SNP in alsD gene that encodes acetolactate decarboxylase enzyme and is included into als operon, which, in turn, is engaged into acetoin generation, as well as with the hyper-expression of regulatory AphA protein controlling acetoin biosynthesis.
Key words: Vibrio cholerae, genovariants, glucose metabolism, acetoin generation, gene expression.
For citation: Zadnova S.P., Cheldyshova N.B., Kritskii A.A., Adamov A.K., Devdariani Z.L., Kutyrev V.V. Comparative Analysis of Glucose Metabolism in Strains of Vibrio cholerae, Biovar El Tor. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology 2017; 35(2):64-69. (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-64-69.
For correspondence: Svetlana Petrovna Zadnova, Dr. Biol. Sci., Leading research officer in the Laboratory of pathogenic vibrios, Federal Government Health Institution Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, 410005, Saratov, Russian Federation; E-mail: [email protected]
Acknowledgments. The authors are grateful to the senior research officer of the Laboratory of genomic and proteomic analysis N.P. Guseva for performing fragmentary sequence analysis of alsD gene in genovariant strains.
acknowledgments. The study had no sponsor support. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.852.11.083.18:577.21.08
Щит И.Ю.1, Игнатов К.Б.2,3, Кудрявцева Т.Ю.1, Шишкова Н.А.1, Миронова Р.И.1, Маринин Л.И.1, Мокриевич А.Н.1, Крамаров В.М.2,3, Бикетов С.Ф.1, Дятлов И.А.1
использование петлевой изотермической амплификации днк для выявления и идентификации сибиреязвенного микроба
1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора,
142279, Оболенск, Россия; 2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 117971, Москва, Россия; 'Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, РАН, 127422, Москва, Россия
Представлены результаты выявления и идентификации штаммов Bacillus anthracis в реакции петлевой изотермической амплификации ДНК (LAMP) с использованием оригинальных прайме-ров, оптимизированных условий и термостабильного фермента ДНК полимеразы. Показано, что реакция позволяет воспроизво-
Для корреспонденции: Александр Николаевич Мокриевич, канд. мед. наук, рук. отдела особо опасных инфекций ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, E-mail: [email protected]
димо выявлять мишени, специфичные для штаммов B. anthracis на хромосомной и плазмидной ДНК. Не обнаружено перекрестных реакций с ДНК из штаммов, относящихся к другим видам группы В. cereus. На основе оптимизированной реакции петлевой изотермической амплификации ДНК планируется создание удобных в применении и не требующих сложного оборудования тестов для клинической и полевой диагностики возбудителя сибирской язвы.
Ключевые слова: петлевая изотермическая амплификация ДНК; LAMP; Bacillus anthracis.
Для цитирования: Щит И.Ю., Игнатов К.Б., Кудрявцева Т.Ю., Шишкова Н.А., Миронова Р.И., Маринин Л.И., Мокриевич А.Н., Крамаров В.М., Бикетов С.Ф., Дятлов И.А. Использование петлевой изотермической амплификации ДНК для выявления и идентификации сибиреязвенного микроба. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35 (2): 69-76. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-69-76.
Возбудитель сибирской язвы B. anthracis таксономи-чески принадлежит к группе B. cereus, в которую входят шесть близкородственных видов, такие как B. cereus, B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides и B. weihenstephanensis, однако только B. anthracis является облигатным патогеном человека и травоядных млекопитающих. Геномные последовательности B. anthracis, B. cereus и B. thuringiensis практически не различаются при исследовании целым рядом методов, поэтому дифференциация видов внутри группы В. сereus является трудной задачей. По данным анализа полиморфизма 16S-23S рРНК и мультилокусного сиквенс-типирования [1, 2] в геномах этих организмов наблюдаются лишь незначительные генетические отличия.
B. anthracis отличается от остальных членов группы наличием двух плазмид вирулентности (бесплазмид-ные штаммы утрачивают вирулентность) и некоторых хромосомных мутаций, что используется при расчете праймеров для амплификационных методов, выявляющих возбудителя сибирской язвы. Геном вирулентных штаммов B. anthracis представлен хромосомой размером 5,23 Мб и двумя мультикопийными плазмидами вирулентности рХО1 и рХО2. Плазмида рХО1 (184 тпн) содержит гены, кодирующие токсин, состоящий из про-тективного антигена (pag), летального (lef) и отечного (cya) факторов. На плазмиде рХО2 (97 тпн) локализованы структурные (cap) гены, участвующие в синтезе анти-фагоцитарного поли-Б-глютаминового капсульно-го антигена. Внутривидовая дифференциация штаммов возбудителя сибирской язвы возможна лишь с помощью исследования единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP), поскольку наиболее отличающиеся между собой штаммы B. anthracis имеют более 99,99% идентичности нуклеотидных последовательностей [3, 4]. Плазмиды со сходной генетической структурой обнаружены у других видов рода Bacillus, в том числе и у видов, не входящих в группу B. cereus, в частности, у вида B. circulans и штамма, близкого виду B. luciferensis [5].
Данные о наличии у B. cereus и B. thuringiensis полных наборов генов вирулентности, кодирующих трех-компонентный токсин и капсулу из полиглутаминовой кислоты могут отчасти объяснить существование описанных в последние десятилетия «антраксоподобных» заболеваний людей и животных, вызваемых вирулентными штаммами B. cereus (G9241, 03BB102, 3BB108, 03BB87, E33L, В17, 3а, CI) и B. thuringiensis (97-27) [6-10]. Причиной появления вирулентных штаммов B. cereus и B. thuringiensis может быть естественный генетический обмен плазмидами вирулентности между B. anthracis и другими бациллами. Хотя нет достаточных экспериментальных данных, подтверждающих, что такой обмен возможен, в лабораторных условиях осуществление переноса плазмид не представляет серьезных трудностей, поскольку обнаружены гены мобильности и гены с коньюгативной функцией на плазмиде рХО2 [11-13]. Косвенно эта гипотеза подтверждается также тем, что моно-, ди- и бесплазмидные штаммы B. anthracis выделяются и из окружающей среды, и могут быть сконструированы в лабораторных условиях.
В связи с вышесказанным для эпидемиологических расследований вспышек и лабораторной диагностики инфекционных заболеваний с клиническими симпто-
мами сибирской язвы представляется актуальным разработка и внедрение в практику новых методов дифференцирования В. anthracis от атипичных штаммов и других видов сапрофитных бацилл, а также от возбудителей, вызывающих «антраксоподобные» заболевания людей и животных, так как эпидемическая значимость последних значительно ниже, чем у сибиреязвенного микроба.
Одним из перспективных методов детекции и дифференциации микроорганизмов является петлевая изотермическая амплификация ДНК (LAMP), которая проходит с замещением цепи и катализируется ферментом ДНК-полимеразой (чаще всего Bst-полимеразой) при постоянной температуре 60-65oC [14, 15]. Соответственно, в отличие от полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой осуществляются циклы последовательного изменения температуры, для изотермической амплификации не требуется амплификатор. Пробирку с реакционной смесью инкубируют при температуре 60-65oC в обычной водяной бане или блоке твердотельного термостата. Синтез последовательности-мишени проходит с использованием двух или трех пар праймеров. Прямой (F3) и обратный (B3) внешние праймеры используются при замещении цепи. Прямой (FIP) и обратный (BIP) внутренние праймеры имеют более сложное строение, участвуют в образовании петлевых структур [16]. За последние годы создан целый ряд тестов на основе LAMP для детекции микробных и вирусных возбудителей инфекционных заболеваний, в частности туберкулеза [17, 18], лептоспироза [19], золотистого стафилококка [20], листериоза [21], холеры [22], вируса свиного гриппа H1N1 [23], вируса гепатита В [24], сибирской язвы [25-29].
В работе [25] проверяли возможность детекции спор B. anthracis. Были синтезированы 3 набора по 6 пар праймеров к последовательностям на плазмидах pX01(pag), pX02(capB) и на хромосоме. В LAMP с использованием этих праймеров были идентифицированы (положительный результат хотя бы с двумя из трех наборов праймеров) 13 из 13 использованных штаммов B. anthracis, негативный результат получен с 33 гетероло-гичными штаммами. Следует отметить, что праймеры к хромосомной мишени не были на 100% специфичны и давали положительный результат с некоторыми другими видами Bacillus, что создает предпосылки для ложно-положительных ответов.
В другой работе по применению LAMP для детекции штаммов сибиреязвенного микроба [26] в качестве мишеней также использовали участки ДНК на плазмидах pX01(pag), pX02(capB). Для проверки специфичности наборов праймеров использовали 3 штамма B. anthracis, 3 штамма B.cereus, по 1 штамму B. thuringiensis и B.subtilis и праймеры [26].
Чтобы избежать ложно-положительных сигналов с ДНК бацилл группы В. œreus при детекции B. anthracis нами были выбраны другие хромосомные мишени [30], позволяющие дифференцировать вид B. anthracis от близкородственных. А при выборе праймеров на участки хромосомной и плазмидной ДНК предъявляли жесткие требования к стабильности 3' конца F2-участка и 5' конца F1c-участка праймера FIP и стабильности 3' конца В2-участка и 5' конца В1с-участка праймера BIP.
Следует отметить, что благодаря изотермичности и высокой скорости реакции LAMP имеет значительный потенциал для создания тестов полевого применения, что актуально при решении ряда эпидемиологических задач, в частности при индикации патогенов в окружающей среде.
Целью данной работы является разработка спо-
соба видо-специфического выявления ДНК штаммов B. anthracis на основе LAMP с использованием оригинальных праймеров и термостабильной ДНК-полимеразы.
Материал и методы Штаммы бактерий. В работе использованы штаммы различных видов бактерий, полученные из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ «ГКПМ-Оболенск». Характеристика штаммов и наличие у них соответствующих генов приведены в табл. 1.
Культивирование. Ампулы с культурами B. anthracis вскрывали и вносили по 0,5 мл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем микробные взвеси B. anthracis высе-
вали бактериальной петлей на чашки Петри с L-агаром и инкубировали в течение 18 ч при температуре 37±1 oC. Из каждой культуры готовили отдельно суспензии в 2 мл 0,9% раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-86П), что соответствует 1108 м.к./мл для B. anthracis.
Приготовление термолизатов. Приготовленную суспензию 18-часовой агаровой культуры прогревали 30 мин при 100oC в термостате, затем помещали в лед и через 10 мин центрифугировали. Супернатант использовали в качестве матрицы.
Выделение ДНК. ДНК выделяли с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб-В» (ОАО «ИнтерЛабСер-
Таблица 1
Характеристика штаммов микроорганизмов, использованных в работе
№ Вид штамма Наименование штамма Плазмидный спектр LD50 (спор)* Источник/от кого получен
1 B. anthracis Ч-7 PX01(tox) +/PX02 + 4 Труп человека, 1970
2 B. anthracis 81/1 PX01(tox) +/PX02 + 7 Больной человек, кожная форма, 1972
3 B. anthracis 71/12 PX01(tox) +/PX02 + 32 2-я вакцина Ценковского
4 B. anthracis СТИ-1 PX01(tox) +/PX02 - 1x106 Вакцинный штамм Н.Н.Гинсбурга, 1941
5 B. anthracis СТИ-1 Rif 4 PX01(tox) -/PX02 - 1x109 Вариант штамма СТИ-1
6 B. anthracis 770NP1R PX01(tox) +/PX02 - 1x109 CDC
7 B. anthracis Aames PX01(tox) -/PX02 + 1x109 CDC
8 B. anthracis 1 (Коломна) PX01(tox) +/PX02 + 20 Труп коровы, Московская обл.
9 B. anthracis 5(Тула) PX01(tox) +/PX02 + 8 Корова, Тульская обл.
10 B. anthracis 15 PX01(tox) +/PX02 + 10 Труп коровы, Таджикистан
11 B. anthracis Pasteur 2 pX01(tox) +/pX02 + 6 Институт Пастера, Франция
12 B. anthracis 55 ВНИИВВиМ PX01(tox) +/PX02 - 1x106 ВНИИВВиМ
13 B. anthracis Ichtiman PX01(tox) +/PX02 - 5x105 ВНИИВВиМ
14 B. anthracis 34F2 Sterne PX01(tox) +/PX02 - 2,5x104 НИПЧИ «Микроб»
15 B. anthracis Ланге1 PX01(tox) -/PX02 - 1x108 ВНИИВВиМ
16 B. anthracis 513/1 PX01(tox) -/PX02 - > 1x108 Больной человек, Рязанская обл., 1981
17 B. anthracis 13/39 PX01(tox) +/PX02 - > 1x103 Больной человек, Респ. Дагестан, 1962
18 B. anthracis 10 (38 Калуга) PX01(tox) -/PX02 - > 1x108 Труп коровы, Калужская обл.
19 B. anthracis 32 (603) PX01(tox) -/PX02 - > 1x108 Корова, Казахстан
20 B. cereus 5832 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
21 B. cereus 160 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
22 B. cereus АТСС 10702 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
23 B. cereus 504 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
24 B. cereus Dakar PX01(tox) -/PX02 - > 1x108 ВНИИВВиМ
25 B. cereus 771 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
26 B. cereus var. Anthracoides 217 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
27 B.cereus var. Anthracoides 6691 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
28 B. thuringiensis 214 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
29 B. thuringiensis G 7566 PX01(tox) -/PX02 - ГКПМ-Оболенск
30 Bacillus spp. Nach PX01(tox) -/PX02 - Скотомогильник г. Н. Новгород
31 E. coli JM83 ГКПМ-Оболенск
32 Y. pestis И3449 ГКПМ-Оболенск
33 F. tularensis 503 ГКПМ-Оболенск
34 V. cholerae O139 B6475 ГКПМ-Оболенск
Примечание. * - при подкожном заражении мышей.
вис». При выполнении данных работ соблюдали требования безопасной работы1, 2.
Конструирование праймеров. Прай-меры были рассчитаны с помощью программы Primer Explorer 3 (http:// primerexplorer.jp/elamp3.0.0/index. html) и проверены на специфичность с использованием программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Праймеры синтезированы и очищены фирмой «Синтол», Москва.
Постановка LAMP. При использовании Bst-полимеразы реакционная смесь содержала от 0,8 мкМ до 2,4 мкМ каждого FIP и BIP праймеров, 0,2 мкЫ каждого F3 и B3 праймеров, 1x реакционный буфер для Bst-полимеразы, содержащий 20 мМ Трис-HCl, 10 мМ KCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 0,1% Твин 20, от 100 мкМ до 1,4 мM каждого дНТФ, от 0,2 М до 0,8 M бетаина, 6-8 мM Mg-SO4, 8-40 ед Bst полимеразы, 1-5 мкл образца, воды до конечного объема реакции 25 мкл. Реакцию собирали на льду. Для оптимизации реакции концентрацию Mg2+ изменяли до конечной концентрации 4-10 мМ, количество Bst-полимеразы (4-32 Ед/мкл), а температуру инкубации изменяли в пределах 50-68oC. Образцы инкубировали на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология) в течение 30-60 мин. Электрофорез продуктов LAMP проводили в 1,2% агарозном геле в ТАЕ-буфере. Визуализацию осуществляли на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 260 нм.
При использовании Sd-полимеразы реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1х SD-буфер («Bioron», Германия), 40 ед. SD-полимеразы, 3,5 мМ MgCl2, 0,5 мМ каждого дНТФ, 4 праймера: 0,2 мкМ F3, 0,2 мкМ B3, 0,8 мкМ BIP, 0,8 мкМ FIP, 5 мкл матрицы. Реакцию проводили при 60оС в течение 60 мин с предварительным прогревом при 92оС в течение 2 мин на амплификато-ре Терцик (ДНК-Технология). Электрофорез продуктов LAMP проводили в 1,2% агарозном геле в ТАЕ-буфере. Визуализацию осуществляли на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 260 нм.
Постановка полимеразной цепной реакции. Для синтеза фрагмента хромосомного участка dhp73.019 длиной 204 п.н. реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х реакционный буфер, 1,5 мМ MgCl2, 0,25 мМ каждого дНТФ, 0,2 мкМ праймеров chBA20F3 и chBA20B3, 5 мкл матрицы. Реакцию проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология) по следующей программе: первичная денатурация при 94oC 2 мин, затем 35 циклов амплификации: денатурация при 94oC 15 сек, отжиг праймеров при 54oC 20 сек, элонгация при 72oC 20 сек, для конечной достройки продукта амплификации осуществляли синтез при 72oC 2 мин. Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 1,2% агарозном геле в ТАЕ-буфере. Визуализацию проводили на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 260 нм.
'СП 1.3.1285-03. "Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности)".
2Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы групп патогенности: методические указания МУ 1.3.2569-09. - М., 2009
Рис. 1. Изотермическая амплификация фрагмента хромосомного участка dhp73.019 B. anthracis в реакции LAMP c помощью набора праймеров chBA20 и SD-
полимеразы.
1 - лизат B. anthracis AAmes; 2 - лизат B. anthracis СТИ RIF-4; 3 - лизат B. anthracis 71/12; 4 - ДНК B. anthracis 71/12; 5 - ДНК B. anthracis СТИ-1; 6 - ДНК B. anthracis 1; 7 - ДНК B. anthracis 5; 8 - ДНК B. anthracis Ч-7; 9 - ДНК B. anthracis 81/1; 10 - ДНК B. anthracis 770NP1R;
11 - ДНК B. cereus 5832; 12 - ДНК B. anthracis 15; 13 - ДНК B. Cereus 160; 14 - ДНК B. thuringiensis G 7566; 15 - лизат B. cereus 10702; 16 - лизат B. thuringiensis 214; 17 - отрицательный контроль ПЦР (вода); 18 - маркеры молекулярной массы (100-1000 п.н.).
Воспроизводимость. Все эксперименты повторяли не менее 3 раз, в том числе выращивание штаммов B. anthracis, выделение ДНК, постановку ПЦР и LAMP.
Результаты и обсуждение Выбор мишеней, конструирование праймеров В настоящее время для ПЦР детекции и идентификации B. anthracis сконструировано значительное количество праймеров к хромосомным локусам ДНК возбудителя. Обычно после широкого применения праймеров внутри вида обнаруживают новые штаммы, в которых может отсутствовать детектируемая последовательность, либо она содержит значимые единичные нуклео-тидные полиморфизмы. Иногда последовательность обнаруживается в штаммах близкородственных видов, что требует проведения дополнительного анализа для выявления более специфичных локусов. Нами, помимо биоинформатики, были использованы данные, полученные в работе [30] методом субтрактивной гибридизации, согласно которым для B. anthracis существуют 28 видоспецифических последовательностей ДНК. Из них в качестве хромосомных мишеней мы выбрали две последовательности (dhp73.019 и dhp73.017), к которым рассчитали по две пары праймеров (F3-B3 и FIP-BlP) для LAMP амплификации ДНК.
В качестве плазмидных мишеней были выбраны ген pagA на плазмиде pXOl и ген cap ABC на плазмиде pXo2, к которым также были подобраны по две пары праймеров для проведения LAMP.
Оптимизация метода петлевой изотермической амплификации
В отличие от традиционной ПЦР для синтеза продукта методом LAMP используют Bst- или Bsm-полимеразы, которые способны достраивать новую цепь ДНК и вытеснять предыдущую [31, 32]. Недавно был сконструирован новый фермент - мутант Taq-полимеразы - SD-полимераза, также обладающий способностью вытеснения цепи, но с более высокой термостабильностью по сравнению с Bst- и Bsm-полимеразами, что позволяет добавить этап первичной высокотемпературной денатурации ДНК, повышающий эффективность реакции [33]. В нашей работе мы использовали ферменты Bst- и SD-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
— В
SS
0Ш
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
S
tt
щее соотношение праймеров: 10 пмоль внешних прай-меров B3 и F3 и 40 пмоль внутренних праймеров FIP и BIP. Также улучшает качество реакции добавление к реакционной смеси 0,8 М бетаина, который необходим для стабилизации AT- и GC-пар.
LAMP хромосомной ДНК
Выявление хромосомной ДНК возбудителя сибирской язвы проводили со штаммами B. anthracis различного плазмидного состава: ди- (pX01+/pX02+), моно-(pX01"/pX02+ и pX01+/pX02") и бесплазмидных (pX01V pX02-), обладающих разной степенью патогенности, а также со штаммами близкородственных видов бацилл (см. табл. 1).
Фрагмент хромосомного участка dhp73.019 B. anthracis амплифицировали c помощью набора chBA20 (из четырех праймеров), а фрагмент хромосомного участка dhp73.017 - c помощью набора chBA188. Оба набора праймеров выявляли хромосомные участки при использовании в качестве матрицы не только очищенную ДНК, но и ДНК из термолизатов культур исследованных штаммов возбудителя сибирской язвы. При этом оба набора праймеров позволяли дифференцировать вид B. anthracis от видов B. cereus, B. thuringiensis (рис. 1).
Амплификация фрагментов хромосомной ДНК B. anthracis с помощью ПЦР
Результаты изотермической амплификации фрагмен-
Рис. 2. Обнаружение фрагмента хромосомы dhp73.019 B.
anthracis c помощью ПЦР и праймеров F3-B3 chBa20.
1 - ДНК B. anthracis Ч-7; 2 - ДНК B. anthracis 81/1; 3 - ДНК B. anthracis AAmes; 4 - ДНК B. anthracis 770 NP1R; 5 - ДНК B. anthracis 71/12; 6 - ДНК B. anthracis СТИ-1; 7 - ДНК B. anthracis СТИ RIF-4; 8 - ДНК B. cereus var. anthracoides 217; 9 - ДНК B. cereus 771; 10 - ДНК B. anthracis Pasteur 2; 11 - ДНК B. anthracis 55; 12 - ДНК B. anthracis
Ichtiman; 13 - ДНК B. anthracis 34F2 Sterne; 14 - ДНК B. anthracis Lange1; 15 - отрицательный контроль ПЦР (вода); 16 - маркер молекулярной массы (100-1000 п.н.); 17 - ДНК Bacillus spp, Nach; 18 - ДНК B. cereus var. anthracoides 6691; 19 - ДНК B. cereus Dakar; 20 - ДНК B. cereus 5832; 21 - ДНК B. thuringiensis 214; 22 - ДНК B. thuringiensis G 7566; 23 - ДНК B. anthracis 10; 24 - ДНК B. anthracis 32; 25 - ДНК B. anthracis 1; 26 - ДНК B. anthracis 5; 27 - ДНК B. anthracis 15; 28 - ДНК B. cereus 160; 29 - ДНК B. anthracis 513/1; 30 - ДНК B. anthracis 13/39;
31 - маркеры молекулярной массы (100-1000 п.н.).
полимеразы, чтобы оценить, какой из ферментов более пригоден для LAMP. Первоначально использовали фермент Bst-полимеразу. При многочисленных изменениях параметров амплификации: концентрации Mg2+, Bst-полимеразы, дНТФ, соотношения праймеров, введении в реакцию бетаина, изменении температуры реакции от 50 до 68oC - положительного ответа (характерную картину в виде «лестницы» на электрофореграмме) увидеть не удалось. При проведении ПЦР с внешней парой праймеров F3-B3 и Taq-полимеразой был получен фрагмент ожидаемой величины. При использовании этого ампли-кона в качестве матрицы (вместо нативной ДНК) в LAMP с Bst-полимеразой на электрофореграмме можно было увидеть появление характерной лестницы - множества полос различной длины (данные не представлены). Замена Bst-полимеразы для проведения LAMP на более термостабильную SD-полимеразу позволила ввести стадию предварительного прогрева реакционной смеси при 92oC, что обеспечило эффективную амплификацию как хромосомных, так и плазмидных фрагментов нативной ДНК B. anthracis. В дальнейших экспериментах использовали SD-полимеразу и прогрев реакционной смеси при 92oC в течение 2 мин.
Для оптимизации LAMP варьировали ряд параметров. Было установлено, что лучшим является следую-
Рис. 3. Изотермическая амплификация фрагмента гена pagA (pX01) B. anthracis c помощью LAMP и праймеров pagBA272 и SD-полимеразы.
1 - ДНК B. cereus var. anthracoides 217; 2 - ДНК B. anthracis Ч-7; 3 - ДНК B. anthracis 81/1; 4 - ДНК B. anthracis AAmes; 5 - ДНК B. anthracis 770 NP1R; 6 - ДНК B. anthracis 71/12; 7 - ДНК B. anthracis СТИ-1; 8 - ДНК B. anthracis СТИ RIF-4; 9 - ДНК B. cereus 771; 10 - ДНК B. anthracis Pasteur 2; 11 - ДНК B. anthracis 55; 12 - ДНК B. anthracis Ichtiman; 13 - ДНК B. anthracis 34F2 Sterne; 14 - отрицательный контроль ПЦР (вода); 15 - маркеры молекулярной массы (100-1000 п.н.); 16 - ДНК B. anthracis Ланге1; 17 - ДНК Bacillus spp, Nach; 18 - ДНК B. cereus var. anthracoides 6691; 19 - ДНК B. cereus Dakar; 20 - ДНК B. cereus 5832; 21 - ДНК B. thuringiensis 214; 22 - ДНК B. thuringiensis G 7566; 23 - ДНК B. anthracis 10; 24 - ДНК B. anthracis 32; 25 - ДНК B. anthracis 1; 26 - ДНК B. anthracis 5; 27 - ДНК B. anthracis 15; 28 - ДНК B. anthracis 513/1; 29 - ДНК B. anthracis 13/39; 30 - маркеры молекулярной массы (100-1000 п.н.).
Ранее в нашей лаборатории при исследовании штаммов 10 и 32 (по характеру роста на жидких и плотных питательных средах, вирулентности для мышей, чувствительности к трем специфическим сибиреязвенным бактериофагам) не было получено однозначного заключения об их видовой принадлежности. В настоящей работе мы не обнаружили положительного сигнала с праймерами к хромосомным локусам ДНК сибирской язвы, что согласуется с опубликованными результатами генетического анализа этих штаммов с помощью метода однопраймерной ПЦР и VNTR типирования [34, 35], которые не указывали на принадлежность штаммов 10 и 32 к виду B. anthracis.
Таким образом, разработанные в данной работе прай-меры на хромосомные фрагменты ДНК для реакции LAMP (chBA20-B3 и chBA20-F3) позволяют дифференцировать вид B. anthracis от видов B. cereus, B. thuringiensis, в частности от высоко гомологичных штаммов B. cereus Dakar и B. cereus var anthracoides 217 и 6691, что позволяет рассматривать их в качестве весьма перспективных компонентов тестов для идентификации сибиреязвенного микроба на основе LAMP.
Изотермическая амплификация фрагментов плаз-мидной ДНК
Плазмида pX01.
На рис. 3 показаны сравнительные результаты исследования проб ДНК ди-, моно- и бесплазмидных штаммов B. anthracis, а также сапрофитных представителей рода Bacillus в реакции петлевой изотермической амплификации с праймерами к фрагментам ДНК, локализованным на плазмиде pX01.
Фрагменты гена pagA плазмиды pXOl B. anthracis амплифицировали c помощью наборов праймеров pag-BA272 (см. рис. 3) и pagBA997 (данные не представлены). Во всех случаях при наличии в штамме плазмиды pXOl происходила амплификация соответствующего фрагмента гена pagA. У штаммов, не содержащих плаз-миду pXOl, синтез фрагмента отсутствовал. В случае набора праймеров pagBA997 в некоторых экспериментах наблюдали слабый выход продукта в пробе ДНК B. cereus var. anthracoides 217, что может говорить о более низкой специфичности данного набора праймеров по сравнению с набором pagBA272. Плазмида pXO2.
Для обнаружения продуктов амплификации гена capАВС плазмиды pXO2 B. anthracis использовали наборы праймеров capBA194 и capBA31 (данные не показаны). При наличии в штамме плазмиды pXO2 на электро-фореграмме наблюдалось появление LAMP-продукта, в отличие от штаммов без плазмиды pXO2.
На рис. 4 показаны итоги амплификации ДНК штаммов B. anthracis, а также других представителей рода Bacillus с набором праймеров capBA194 к участкам гена сарАВС плазмиды pXO2. Аналогичные результаты получены с набором праймеров capBA31.
Таким образом, оба набора праймеров: capBA194 и capBA31 - воспроизводимо обеспечивали наработку характерного для LAMP продукта в ди- и моноплазмид-ных штаммах, несущих плазмиду pXO2.
Определение чувствительности праймеров chBA20 для детекции B. anthracis c помощью LAMP и ПЦР
Чувствительность праймеров для детекции фрагмента хромосомы dhp73.019 B. anthracis с помощью ПЦР и праймеров F3-B3 chBa20 ДНК B. anthracis СТИ-1 выявлена в концентрации 6 нг, 600 пг, 60 пг и 6 пг. При проведении LAMP с набором праймеров chBa20ДНК этого же штамма чувствительность была обнаружена в таких же концентрациях (данные не показаны). Таким обра-
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Рис. 4. Изотермическая амплификация фрагмента гена capABC (на плазмиде pXO2) B. anthracis c помощью набора праймеров capBA194 и SD-полимеразы.
1 - ДНК B. cereus var. anthracoides 217; 2 - ДНК B. anthracis Ч-7; 3 - ДНК B. anthracis 81/1; 4 - ДНК B. anthracis AAmes; 5 - ДНК B. anthracis 770 NP1R; 6 - ДНК B. anthracis 71/12; 7 - лизат B. anthracis 71/12; 8 - ДНК B. anthracis СТИ RIF-4; 9 - ДНК B. cereus 771; 10 - ДНК
B. anthracis Pasteur 2; 11 - лизат B. anthracis Pasteur 2; 12 - ДНК B. anthracis Ichtiman; 13 - ДНК B. anthracis 34F2 Sterne; 14 - отрицательный контроль ПЦР (вода); 15 - маркеры молекулярной массы (100-1000 п.н.); 16 - ДНК B. anthracis Ланге1; 17 - лизат B. anthracis 1; 18 - ДНК B. cereus var anthracoides 6691; 19 - ДНК B. cereus Dakar; 20 - ДНК B. cereus 5832; 21 - ДНК B. thuringiensis 214; 22 - ДНК B. thuringiensis G 7566; 23 - ДНК B. anthracis 10; 24 - ДНК B. anthracis 32; 25 - ДНК B. anthracis 1; 26 - ДНК B. anthracis 5; 27 - ДНК B. anthracis 15; 28 - ДНК B. anthracis 513/1; 29 - ДНК B. anthracis 13/39; 30 - маркеры молекулярной массы (100-1000 п.н.).
тов хромосомной ДНК бацилл сравнили с данными, полученными с помощью традиционной ПЦР. При проведении специфической ПЦР с парой внешних праймеров F3-B3 chBA20 и Taq-полимеразой был получен фрагмент ожидаемой величины - 204 п.н. (рис. 2).
При этом данный специфический фрагмент синтезировался только в пробах с ДНК штаммов вида B. anthracis. Во всех других случаях амплификации либо не наблюдалось вовсе, либо синтезировались неспецифические продукты, отличающиеся от фрагмента ожидаемой длины.
Как видно из рис. 2, в пробах с ДНК бесплазмидных штаммов B. anthracis СТИ RIF4, B. anthracis Lange1 и B. anthracis 513/1 получен положительный сигнал. При использовании праймеров только на плазмидные мишени, детектировать штаммы B. anthracis, не имеющие плазмид, было бы невозможно. Следует отметить, что в работе [25] при использовании праймеров к последовательностям, расположенным на хромосоме, наблюдался положительный сигнал в пробах с ДНК штаммов B. mycoides и B. cereus (F3502/73 и 421-4). В наших экспериментах в случае штаммов, не относящихся к виду B. anthracis, положительных сигналов зарегистрировано не было, что говорит о высокой диагностической значимости праймеров на выбранные нами мишени на хромосоме B. anthracis.
зом, чувствительность LAMP при использовании прай-меров для детекции хромосомного участка dhp73.019 B. anthracis сопоставима с таковой в ПЦР.
При лабораторной диагностике и эпидемиологическом расследовании инфекционных заболеваний с клиническими симптомами, подобными сибирской язве, необходимо учитывать возможность обнаружения необычных штаммов B. anthracis или других бацилл, вызывающих «антраксоподобные» заболевания людей и животных, а также сапрофитных изолятов, имеющих высокую степень идентичности нуклеотидной последовательности (до 99,9%) с «классическими» штаммами возбудителя сибирской язвы. Текущие методы идентификации, основанные на выявлении ДНК, требуют наличия дорогостоящего оборудования, хорошо оборудованной лаборатории и квалифицированного персонала. Метод LAMP пригоден для применения в полевых условиях и слабо оснащенных лабораториях благодаря своей простоте и быстроте проведения анализа. В связи с этим в данной работе предпринята попытка создания теста для идентификации возбудителя сибирской язвы, который дифференцирует вид от близкородственных. Представлены результаты выявления и идентификации штаммов B. anthracis в реакции петлевой изотермической амплификации ДНК (LAMP) с использованием оригинальных праймеров, оптимизированных условий и термостабильного фермента ДНК полимеразы. Показано, что реакция позволяет воспроизводимо выявлять мишени, специфичные для штаммов B. anthracis на хромосомной и плазмидной ДНК. Не обнаружено перекрестных реакций с ДНК из штаммов, относящихся к другим видам группы В. œreus.
Чувствительность метода LAMP для детекции возбудителя сибирской язвы, особенно в полевых условиях, имеет большое значение. При использовании прай-меров для детекции хромосомного участка B. anthracis чувствительность LAMP была такой же, как при проведении ПЦР. Следует отметить, что при внесении одинакового количества матрицы в реакционную смесь продуктов LAMP образуется больше, чем ПЦР-ампликонов, благодаря чему возможна бесприборная визуализация продуктов реакции. В настоящее время проводятся исследования по использованию бесприборного способа визуализации продуктов LAMP. Для увеличения чувствительности изотермической амплификации планируется введение дополнительной пары петлевых прайме-ров, что, возможно, увеличит выход продукта и сократит время реакции.
На основе оптимизированной реакции петлевой изотермической амплификации ДНК планируется создание удобных в применении и не требующих сложного оборудования тест-систем для клинической и полевой диагностики возбудителя сибирской язвы.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Госконтракта № 13-Д (Диагностика, разработка и внедрение в практику новых диагностических средств и технологий для индикации и идентификации патогенных биологических объектов).
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-33 см. REFERENCES)
34. Шишкова Н.А., Мокриевич А.Н., Павлов В.М., Маринин Л.И., Вахрамеева Г.М., Кудрявцева Т.Ю., Дятлов И.А. Использование chi-последовательности для дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы от близкородственных бацилл. Проблемы особо опасных инфекций. 2014; (2): 97-100.
35. Шишкова Н.А., Мокриевич А.Н., Платонов М.Е., Светоч Т.Э., Маринин Л.И. Изучение генетического разнообразия штаммов
сибиреязвенного микроба из коллекции ГНЦ ПМБ. Проблемы особо опасных инфекций. 2010; 2 (104): 60-6.
REFERENCES
1. Daffonchio D., Cherif A., Brusetti L., Rizzi A., Mora D., Boudabous A. et al. Nature of polymorphisms in 16S-23S rRNA gene intergenic transcribed spacer fingerprinting of Bacillus and related genera. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69: 5128-37.
2. Priest F., Barker M., Baillie L., Holmes E., Maiden M. Population structure and evolution of the Bacillus cereus group. J. Bacteriol. 2004; 186: 7959-70.
3. Van Ert M., Easterday W., Huynh L., Okinaka R., Hugh-Jones M., Ravel J. et al. Global genetic population structure of Bacillus anthracis. PloS One. 2007; 2: e461.
4. Van Ert M., Easterday W., Simonson T., U'Ren J., Pearson T., Ke-nefic L. et al. Strain-specific single-nucleotide polymorphism assays for the Bacillus anthracis Ames strain. J. Clin. Microbiol. 2007; 45: 47-53.
5. Luna V., King D., Peak K., Reeves F., Heberlein-Larson L., Veguilla W. Bacillus anthracis virulent plasmid pX02 genes found in large plasmids of two other Bacillus species. J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (7): 2367-77.
6. Han C., Xie G., Challacombe J., Altherr M., Bhotika S., Brown N. et al. Pathogenomic sequence analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis isolates closely related to Bacillus anthracis. J. Bacte-riol. 2006; 188: 3382-90.
7. Hoffmaster A., Ravel J., Rasko D., Chapman G., Chute M., Marston C. et al. Identification of anthrax toxin genes in a Bacillus cereus associated with an illness resembling inhalation anthrax. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004; 101 (22): 8449-54.
8. Hoffmaster A., Hill K., Gee J., Marston C., De B., Popovic T. et al. Characterization of Bacillus cereus isolates associated with fatal pneumonias: strains are closely related to Bacillus anthracis and harbor B. anthracis virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (9): 3352-60.
9. Hoffmaster A., Novak R., Marston C., Gee J., Helsel L., Pruckler J., Wilkins P. Genetic diversity of clinical isolates of Bacillus cereus using multilocus sequence typing. BMC Microbiol. 2008; 8: 191.
10. Oh S.Y., Budzik J. M., Garufi G., Schneewind O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthraxlike disease. Mol. Microbiol. 2011; 80: 455-70.
11. Klee S., Brzuszkiewicz E., Nattermann H., Bruggemann H., Dupke S., Wollherr A. et al. The genome of a Bacillus isolate causing anthrax in chimpanzees combines chromosomal properties of B. cereus with B. anthracis virulence plasmids. PloS One. 2010; 5: e10986.
12. Hu X., Van der A., Timmery S., Zhu L., Mahillon J. Distribution, diversity, and potential mobility of extrachromosomal elements related to the Bacillus anthracis pXO1 and pXO2 virulence plasmids. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75: 3016-28.
13. Van der Auwera G., Andrup L., Mahillon J. Conjugative plasmid pAw63 brings new insights into the genesis of the Bacillus an-thracis virulence plasmid pXO2 and of the Bacillus thuringiensis plasmid pBT9727. BMC Genom. 2005; 6: 103.
14. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28 (12): E63.
15. Notomi T., Kanda H., Taguch F., Minekaw H., Itamura S., Odagiri T., Tashiro M. RT-LAMP method provides a simple, rapid and specific detection system for SARS-CoV RNA. In: Proceedings of the International Conference on SARS, German Medical Science. 2004.
16. Parida M., Sannarangaiah S., Dash P.K., Rao P. V.L., Morita K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev. Med. Virol. 2008; 18: 407-21.
17. Pandey B.D., Poudel A., Yoda T., Tamaru A., Oda N., Fukushima Y. et al. Development of an in-house loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of Mycobacterium tuberculosis and evaluation in sputum samples of Nepalese patients. J. Med. Mi-crobiol. 2008; 57: 439-43.
18. Geojith G., Dhanasekaran S., Chandran S.P., Kenneth J. Efficacy of loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the laboratory identification of Mycobacterium tuberculosis isolates in a resource limited setting. J. Microbiol. Meth. 2011; 84: 71-3.
19. Sonthayanon P., Chierakul W., Wuthiekanun V., Thaipadungpanit J., Kalambaheti T. Boonsilp S. et al. Accuracy of loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of human leptospirosis in Thailand. Am. J. Trop. Med Hyg. 2011; 84: 614-20.
20. Lim K.T., Teh C.S.J., Thong K.L. Loop mediated isothermal ampli-
fication assay for the rapid detection of Staphylococcus aureus. Bio. Med. Res. Int. 2013; 2013: 895 816.
21. Tang M.J., Zhou S., Zhang X.Y., Pu J.H., Ge Q.L., Tang X.J., Gao Y.S. Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loop-mediated isothermal amplification. Curr. Microbiol. 2011; 63: 511-6.
22. Ymazaki W., Seto K., Taguchi M., Ishibashi M., Inoue K. Sensitive and rapid detection of cholera toxin producing Vibrio B lerae using a loop mediated isothermal amplification. BMC Microbiol. 2008; 8: 94.
23. Kawai Y., Kimura Y., Lezhava A., Kanamori H., Usui K., Hanami T. et al. One-step detection of the 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus by the RT-SmartAmp Assay and its clinical validation. PloS One. 2012; 7 (1): e30 236.
24. Moslemi E., Shahhosseiny M.H., Javadi G., Praivar K., Sattari T.N., Amini H.K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of HBV in Iran. Afr. J. Microbiol. Res. 2009; 3: 439-45.
25. Qiao Y.-M., Guo Y.-C., Zhang X.-En, Zhou Y.-F., Zhang Z.-P., Wei H.-P. et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis spores. Biotechnol. Lett. 2007; 29: 193946.
26. Hatano B., Maki T., Obara T., Fukumoto H., Hagisawa K., Matsushita Y. et al. LAMP using a disposable pocket warmer for anthrax detection, a highly mobile and reliable method for anti-bioterrorism. Jpn. J. Infect. Dis. 2010; 63: 36-40.
27. Dugan L., Bearinger J., Hinckley A., Strout C., Souza B. Detection of Bacillus anthracis from spores and cells by loop-mediated isothermal amplification without sample preparation. J. Microbiol. Meth. 2012; 90 (3): 280-4.
28. Jain N., Kumar J.S., Parida M.M., Merwyn S., Rai G.P., Agar-wal G.S. Real-time loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and sensitive detection of anthrax spores in spiked soil and talcum powder. World J. Microbiol. Biotechnol. 2011; 27 (6): 1407-13.
29. Kurosaki Y., Sakuma T., Fukuma A., Fujinami Y., Kawamoto K., Kamo N. et al. A simple and sensitive method for detection of Bacillus anthracis by loop-mediated isothermal amplification. J. Appl. Microbiol. 2009; 107 (6): 1947-56.
30. Radnedge L., Agron P.G., Hill K.K., Jackson P.J., Ticknor L.O., Keim P., Andersen G.L. Genome differences that istinguish Bacillus anthracis from Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69 (5): 2755-64.
31. Nagamine K., Watanabe K., Ohtsuka K., Hase T., Notomi T. Loopmediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clin. Chem. 2001; 47: 1742-3.
32. Wozniakowski G., Kozdrun W., Samorek-Salamonowicz E. Loopmediated isothermal amplification for the detection of goose circovirus. Virol. J. 2012; 9: 110.
33. Ignatov K.B., Barsova E.V., Fradkov A.F., Blagodatskich K.A., Kra-marova T.V., Kramarov V.M. A strong strand displacement activity of thermostable DNA polymerase markedly improves the results of DNA amplification. BioTechniques. 2014; 57: 81-7.
34. Shishkova N.A., Mokrievich A.N., Pavlov V.M., Marinin L.I., Vakh-rameeva G.M., Kudryavtseva T.Yu., Dyatlov I.A. Usage of chi-sequence for differentiation between the strains of anthrax etiological agent and closely related bacilli. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2014; (2): 97-100. (in Russian)
35. Shishkova N.A., Mokrievich A.N., Platonov M.E., Svetoch Т.Е., Marinin L.I. Study of the genetic diversity of the anthrax microbe strains from the collection of SRC AMB. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2010; 2 (104): 60-6. (in Russian)
Поступила 24.11.16
Shchit I.Yu.1, Ignatov K.B.2,3, Kudryavtseva T.Yu.1, Shishkova NA.1, Mironova R.I.1, Marinin L.I.1, Mokrievich AN.1, Kramarov V.M.2'3, Biketov S.F.1, Dyatlov IA.1
APPLICATION OF LOOP MEDIATED ISOTHERMAL DNA AMPLIFICATION TO REVEAL AND IDENTIFY BACILLUS ANTHRACIS
1 State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, 142279, Obolensk, Russian Federation
2 Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of
Sciences, 117971, Moscow, Russian Federation
3 All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology,
Russian Academy of Sciences, 127422, Moscow, Russian Federation
The paper presents the results of revealing and identification of Bacillus anthracis strains in LAMP reaction using original primers, optimized conditions and thermostable DNA polymerase. It shows that the reaction allows revealing on a reproducible basis targets specific for Bacillus anthracis strains on chromosomal and plasmid DNA. Cross-reactions with DNA from strains related to other В. cereus species were not detected. Based on the optimized LAMP reaction it may be possible to create simple tests, which do not require sophisticated equipment, for clinic and field diagnostics of anthrax. Keywords: loop mediated isothermal amplification of DNA, LAMP, Bacillus anthracis
For citation: Shchit I.Yu., Ignatov K.B., Kudryavtseva T.Yu., Shishkova N.A., Mironova R.I., Marinin L.I., Mokrievich A.N., Kramarov V.M., Biketov S.F., Dyatlov I.A. Application of Loop Mediated Isothermal DNA Amplification to Reveal and Identify Bacillus Anthracis. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology 2017;35(2):69-76. (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-69-76.
For correspondence: Aleksander N. Mokrievich, Candidate of Medical Sciences, Head of the Department of highly dangerous infections, State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, 142279, Obolensk, Russian Federation; E-mail: [email protected]
Acknowledgments. This work was .supported by the State Contract No. 13 (Diagnostics, development and implementation of new diagnostic means and technologies for indication and identification of pathogenic biological objects).
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
