Определение различий в структуре генов биосинтеза метионина у штаммов Bacillus anthracis и филогенетически родственных видов бацилл Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.852.11:579.222]:577.21.08

Н. И. Микшис, Ю. Н. Живова, Л. В. Новикова, Н. А. Шарапова, Ю. А. Попов, В. В. Кутырев

определение различий в структуре генов биосинтеза МЕТИОНИНА У штаммов BACILLUSANTHRACIS И фИЛОГЕНЕТИчЕСКИ РОДСТВЕННЫх

ВИДОВ бацилл

ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора, Саратов

Осуществлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих синтез ферментов метаболизма метионина у штаммов Bacillus anthracis и близкородственных бактериальных видов. Во всех тестированных штаммах сибиреязвенного микроба обнаружена делеция 42 нуклеотидов в гене hom2, детерминирующем гомосериндегидрогеназу. У штаммов других бациллярных видов мутации в гене hom2, блокирующей пути биосинтеза метионина и треонина, не отмечено. Выявлен полиморфизм единичных нуклеотидов в генах asdl, metX и metH, что позволяет осуществлять идентификацию штаммов B. anthra-cis с помощью технологии секвенирования. Ключевые слова: Bacillus anthracis, бациллярные виды, метаболизм метионина и треонина, амплификация, секвениро-вание

Сибирская язва на протяжении многих веков наносила огромный экономический ущерб, истребляя поголовья скота и диких животных, причиняя вред здоровью людей. В XX веке с распространением противоэпидемических, санитарно-гигиенических и профилактических мероприятий наметилась тенденция к улучшению ситуации. Тем не менее и в настоящее время локальные вспышки сибиреязвенной инфекции в мире возникают постоянно. По данным официальной статистики Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в России насчитывается около 35 тыс. стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов с почвенными очагами, в которых учтено 7940 скотомогильников [2]. За последние 10 лет в Российской Федерации зарегистрировано 175 случаев заражения людей возбудителем сибирской язвы. Угроза возникновения и распространения особо опасного инфекционного заболевания, а также вероятность использования патогенного микроорганизма в террористических целях определяют необходимость создания надежных и эффективных средств диагностики, профилактики и лечения.

Современным требованиям в диагностике соответствуют активно развивающиеся молекулярно-генетические методы. Однако для сибиреязвенного микроба разработка подобных способов индикации и идентификации проблематична ввиду относительно мономорфной молекулярной природы B. anthracis и высокого уровня гомологии нуклеотидных последовательностей большинства хромосомных генов у штаммов филогенетически родственных видов. Возбудитель сибирской язвы - грамположительный спорообразующий микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus, семейству Bacillaceae, отряду Enter-obacteriales. Внутри рода Bacillus существует группа близкородственных бацилл, в нее входят B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomy-coides и B. weihenstephanensis. Данные бактериальные виды схожи по своим морфологическим и физиологическим характеристикам. Идентичность хромосомных ДНК в отдельных случаях достигает 99%.

Основные межвидовые различия обеспечиваются внехромосомными репликонами [7, 16, 18].

В геноме возбудителя сибирской язвы присутствуют две высокомолекулярные плазмиды - pXO1 и pXO2. Функциональная активность входящих в их состав генов обеспечивает почти весь каскад происходящих при сибиреязвенной инфекции патологических процессов [10, 11]. Секвенирование ДНК плазмиды pXO1 (B. anthracis Sterne - 181 654 п. н., 143 открытые рамки считывания) обнаружило ограниченный IS-элементами "остров патогенности" [12]. В этой области генома сосредоточены известные детерминанты синтеза и регуляции экзотоксина, играющего ключевую роль в патогенезе сибиреязвенной инфекции. Репликон pXO2 (B. anthracis Pasteur -96 231 п. н., 85 открытых рамок считывания) содержит структурные гены, отвечающие за образование капсулы [13]. Главным назначением капсулы является защита микробных клеток от фагоцитоза.

Присутствие в геноме плазмид pXO1 и pXO2 определяет вирулентность штаммов B. anthracis и является дифференциально-диагностическим признаком возбудителя сибирской язвы. Однако появились сообщения об обнаружении у штаммов других бациллярных видов схожих или идентичных плазмид [3, 8, 9, 16]. Некоторые из таких необычных штаммов были изолированы от людей или животных с симптомами заболевания, напоминающего сибирскую язву. В этой связи встает вопрос о поиске хромосомных локусов, позволяющих надежно дифференцировать штаммы B. anthracis и близкородственных видов.

Для идентификации сибиреязвенного микроба было предложено использовать полиморфизм хромосомных генов rpoB и gyrA [4, 6, 14, 19]. Кроме того, в процессе сравнительного анализа секвенированных геномов B. anthracis и B. cereus были выявлены единичные нуклеотидные замены в хромосомных генах плейотропного регулятора plcR. Транскрипционный регулятор PlcR регулирует различные функции клетки, имеющие отношение к патогенности микроорганизма и выживанию в агрессивной внешней среде. Полиморфизм нуклеотидов в гене plcR относится к каноническим однонуклеотидным полиморфизмам (SNP, single nucleotide polymorphisms) и используется при типировании штаммов B. anthracis различного происхождения [5].

Целью данного исследования явился поиск ДНК-мишеней для дифференциации возбудителя сибирской язвы от других представителей рода Bacillus.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы. В работе использовали следующие штаммы: B. anthracis M-29, И-29, И-302, 81/1, СТИ-1, Sterne, 17JB, 55, Pasteur, Wright, Ихти-

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №2, 2012

L-ЛИЗИН А

Аспартат-

Аспартат киназа I, II семиальдегид-дегидрогеназа

(dapG1,2) (asd1,2,3) ¡ L-АСПАРТАТ -► L-4-аспартилфосфат-► 1.-аспартат-4 семиальдегид

Гомосериндегидрогеназа (hom1,2,3)

Гомосерин-О-ацетилтрансфераза (metX)

Гомосерин киназа Треонинсинтаза (thrB) (thrC) L-гомосерин-► О-фосфо-L-roMOcepnH--+• L-треонин

Гомосерин-О-сукцинилтрансфераза (metA)

0-ацетил-1--гомосерин

Цистатион-у-синтаза (metC1)

О-сукцинил-Ь-гомосерин

Цистатион-у-синтаза (metC1)

L-цистатионин

L-цистеин

Цистатион-у-лиаза (metC2,3)

L-гомоцистеин

5-метилтетрогидрофолат-гомосеринметилтрансфераза (metH)

Гомосеринметилтрансфераза (metE)

L-метионин

S-аденозилметионинсинтаза (metK)

Рис. 1. Метаболические пути биосинтеза метионина и треонина у штаммов возбудителя сибирской язвы.

ман, B. anthracis (2-я вакцина Ценковского); B. cereus 8, 96, 336, 569; B. thuringiensis 19/31, 17/5, 351, 482/3; B. megaterium 1, 3; 654; B. subtilis WB600; B. licheni-formis 4. Все штаммы получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПБ) (Саратов, РосНИПЧИ "Микроб").

Питательные среды. Выращивание бациллярных штаммов осуществляли на агаре BHI или в бульоне BHI ("Difco" США). Для определения питательных потребностей штаммов B. anthracis использовали синтетическую среду следующего состава (в г/л): K2HPO4 - 5,23; KH2PO4 - 4,08; MgSO. • 7H 2O - 0,049; MnSO. • H2O - 0,015; CaCl2 - 0,55; ID-глюкоза - 3,6; тиамин-HCl - 0,01; FeSO4 • 7H20 - 0,014; (NH4)2SO4 -1,0. Аминокислоты вносили до конечной концентрации 50 мкг/мл.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов. Анализ пути метаболизма метио-нина осуществляли с использованием базы данных KEGG Metabolic Pathways. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов, участвующих в биосинтезе метионина, проводили с применением алгоритма BLAST и программного обеспечения MEGA 4,0. Сравнивали последовательности изучаемых генов у представленных в базе данных NCBI GenBank бациллярных штаммов: B. anthracis Ames, Ames 0581, Sterne, CDC 684, A0248; B. cereus

ATCC 14579, ATCC10987, ZK, AH187, B4264, AH820, G9842, Q1, 03BB102; Bacillus thuringiensis 97-27, Al Hakam, BMB171; B. weihenstephanensis KBAB4_4052, B. licheniformis ATCC14580, DSM13; B. megaterium QMB1551, DSM319; B. subtilis subsp. spizizenii, BSU35150, BSn5.

Расчет праймеров и условия проведения полимераз-ной цепной реакции. Для определения нуклеотидной последовательности фрагментов генов hom2, asdl, metX и metH с использованием программы VECTOR NT19 были рассчитаны праймеры: hom2-s, hom2-as, asd1-s, asd1-as, metX-s, metX-as, metH-s, metH-as. Олигону-клеотидные праймеры синтезировали в РосНИПЧИ "Микроб" на автоматическом синтезаторе ДНК АСМ-800 ("Биосет", Россия). Амплификацию фрагментов генов hom2, asdl, metX и metH в ПЦР проводили по схеме: один цикл 94°С в течение 4 мин, 35 циклов при 94°С - 15 с, 56°С - 20 с, 72°С - 15 с и завершающий цикл 3 мин при 72°C. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов осуществляли в горизонтальной камере ("Bio-Rad", США) в 2% агарозном геле.

Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих ферменты биосинтеза метионина, проводили на генетическом анализаторе модели GEQ 8000 ("Beckman Coulter", США) по методу Сэнгера [17]. Сравнение нуклеотидных последовательностей штаммов, представленных в базе данных NCBI Gen-

l+l 111111111 ! 1 Il II II III III I III llllfttt

1. ■

2. ma rp 7\

3.

4. Ia 1

5. 6. 7. и gaaa|aaagggg[r ggAAAAA|gg|g[r AA AA A A Ag Ag AAAA AAAA A A aaa aaa t a A

8. taaa|aaattttt AA A at aaaa A AAA t ta

9. taaa|aaattttt AA A AB AAAA A AAA t a

10. т^аа|ааадщ|[г AA a at |aaa A AAA t ta

11. т|ааааа|^тт^т aa A A! aaaa a aaa t ta

12. gAAAgAAATTTTT aa a Ag aaaa a aaa й t ta

13. t^aaaaa|ttttt aa AC ag aaaa a aaa t ta

14. t^aa|aaattttt aa a a| |aaa a aaa t ta

15. §aaa|aaattttt aa a at aaaa a aaa t ta

16. gaaa|aaa||||| aa AC Ag aaaa a aaa t a

17. gaaagaaaggggjr aa a ag aaaa a aaa t ta

18. T|AAAAAgTTTjg^ aa a ag t aaaa a aaa t ta

19. ^|аааааИШ|| aa a Agi tJaaa ¡a aaa

Рис. 2. Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей гена hom2, кодирующего гомосериндегидрогеназу, у представленных в базах данных KEGG и NCBI GenBank бациллярных штаммов.

1 - B. anthracis Ames; 2 - B. anthracis Ames 0581; 3 - B. anthracis Sterne;

4 - B. anthracis CDC684; 5 - B. anthracis A0248; 6 - B. cereus biovar anthracis str. CI; 7 - B. cereus ATCC14579; 8 - B. cereus ATCC10987; 9 -B. cereus ZK; 10 - B. cereus AH187; 11 - B. cereus B4264; 12 - B. cereus AH820; 13 - B. cereus G9842; 14 - B. cereus Ql; 15 - B. cereus 03BB102; 16 - B. thuringiensis 97-27; 17 - B. thuringiensis Al Hakam; 18 - B. thuringiensis BMB171; 19 - B. weihenstephanensis.

Bank и полученных из ГКПБ, осуществляли с использованием алгоритма BLAST и программного обеспечения MEGA4,0.

Результаты и обсуждение В качестве подхода к дифференциации возбудителя особо опасной инфекции от других представителей рода Bacillus мы использовали определение изменений в структуре генов, кодирующих синтез ферментов промежуточного метаболизма аминокислот.

Ранее было установлено, что сибиреязвенный микроб является ауксотрофом по метионину [1]. Удаление метионина из состава синтетической среды предотвращало рост всех без исключения штаммов B. anthracis и не компенсировалось ни одной другой добавкой. Штаммы близкородственных видов по характеру питания относились в основном к прототро-фам или зависели в росте от других аминокислот.

Различия в питательных потребностях определяются мутациями генов, детерминирующих ферменты метаболизма аминокислот. В этой связи на первом этапе настоящего исследования осуществляли анализ метаболических путей биосинтеза метионина у штаммов B. anthracis, представленных в базе данных KEGG. Как выяснилось, у сибиреязвенного микроба основной путь синтеза метионина из аспарагиновой кислоты катализируется 12 ферментами: аспартаткиназами I и II, аспартатсемиальдегиддегидрогеназой, гомосерин-дегидрогеназой, гомосерин-О-сукцинилтрансфера-зой, гомосерин-О-ацетилтрансферазой, цистатион-у-синтазой, цистатион-у-лиазой, метилтетрагидро-птероилглутамт-гомоцистеин^-метилтрансферазой, 5-метилтетрагидрофолат-гомосеринметилтрансфера-зой, S-аденозилметионинсинтазой, метионин-тРНК-синтазой (рис. 1). Мы провели сравнение имеющихся

в базе NCBI GenBank бациллярных штаммов по ну-клеотидным последовательностям кодирующих их генов: dapGl, dapG2, asdl, asd2, homl, hom2, hom3, metA, metX, metCl, metC2, metC3, metE, metH, metK, metS. Список сравниваемых штаммов включал 5 представителей B. anthracis, 9 - B. cereus, 3 - B. thuringiensis, 2 - B. megaterium, 1 - B. weihenstephanensis, 3 - B. subtilis, 1 - B. licheniformis.

Гены dapGl, dapG2, asd2, homl, hom3, metA, metCl, metC2, metC3, metE, metK, metS в ряде случаев имели гомологичные нуклеотидные последовательности. У штаммов, различающихся по структуре перечисленных детерминант, не было выявлено синонимичных и несинонимичных замен, делеций или вставок, характерных только для B. anthracis. В четырех генах hom2, asdl, metX и metH, напротив, были обнаружены участки, перспективные для дифференциации возбудителя сибирской язвы от представителей других видов рода Bacillus.

Наиболее существенной оказалась мутация в гене hom2, кодирующем фермент гомосериндегидро-геназу. Данный фермент катализирует последний этап пути превращения L-аспарагиновой кислоты в L-гомосерин. У всех представленных в базах данных KEGG и NCBI GenBank штаммов B. anthracis была обнаружена делеция 42 нуклеотидов в позициях с 1042 по 1083 от начала гена, не встречающаяся у представителей близкородственных видов (рис. 2). С помощью программы Pfam 24,0 удалось установить, что делеция затрагивает серию триплетов, кодирующих активный центр гомосериндегидрогеназы,

Рис.3. Результаты ПЦР-анализа штаммов B. anthracis и отдельных представителей близкородственных бактериальных видов с праймерами на фрагмент гена hom2, кодирующего гомосерин-дегидрогеназу.

1 - B. anthracis M-29; 2 - B. anthracis СТИ-1; 3 - B. anthracis 17JB; 4 - B. anthracis Pasteur; 5 - B. anthracis Ихтиман; 6 - B. anthracis (2-я вакцина Ценковского); 7 - маркер молекулярных масс "O' GenRulerTM 100bp DNA Ladder Plus redy-to-use" ("Fermentas") (3000, 2000, 1500,

1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п. н.); 8 -B. cereus 8; 9 - B. cereus 569; 10 - B. cereus 565; 11 - B. cereus 96; 12 -B. thuringiensis 19/31; 13 - B. thuringiensis 17/5.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №2, 2012

и может являться причиной инактивации фермента у штаммов возбудителя сибирской язвы.

В программе Vector NTI нами были рассчитаны праймеры на фрагмент гена hom2, содержащий область вероятной делеции. С помощью этих оригинальных праймеров тестировали ДНК 20 бациллярных штаммов из ГКПБ: 12 штаммов B. anthracis, 4 - B. cereus, 4 - B. thuringiensis. В ПЦР во всех случаях получили амплификаты ожидаемого размера: 509 п. н. для штаммов сибиреязвенного микроба и 551 п. н. для штаммов других бациллярных видов (рис. 3). Результаты секвенирования амплификатов подтвердили наличие делеции из 42 нуклеотидов в гене hom2 во всех тестированных штаммах B. anthracis и полностью совпали с данными компьютерного анализа.

Протяженная делеция в гене hom2, кодирующем гомосериндегидрогеназу, блокирует синтез L-гомо-серина, из которого в результате ряда последовательных реакций образуются метионин, треонин и цистеин. Фенотипически это должно выражаться в зависимости штаммов B. anthracis одновременно от нескольких факторов роста. В наших экспериментах по определению питательных потребностей возбудителя сибирской язвы ауксотрофность по метионину была абсолютной. Все используемые в работе штаммы B. anthracis нуждались также в треонине. Вместе с тем для треонина существовала возможность замены на глицин или на комбинацию серина и цистеина, что соответствует полученным ранее данным [1]. Выраженной зависимости от цистеина не отмечалось, однако при его внесении в минимальную среду наблюдали улучшение роста культур B. anthracis. Полученные результаты свидетельствуют о наличии у сибиреязвенного микроба коллатеральных путей биосинтеза цистеина.

По-видимому, мутация в гене hom2 возникла на начальном этапе ответвления от общего предшественника и формирования B. anthracis в качестве самостоятельного вида. В процессе эволюционного перехода сапрофитного микроорганизма к паразитическому образу жизни происходила его адаптация к особенностям метаболизма хозяина. Селекционное преимущество обеспечивали мутации, приводящие к облегчению синтеза жизненно важных клеточных компонентов. От L-аспартата берут начало пути биосинтеза не только ме-тионина, треонина и цистеина, но и лизина (см. рис. 1). Необходимо отметить, что некоторые промежуточные продукты метаболизма лизина имеют у прокариот особые функции. Диаминопимелиновая кислота является компонентом пептидогликана клеточной стенки. Де-гидропиколиновая кислота - непосредственный предшественник основного химического компонента эндоспор, обеспечивающего их устойчивость к нагреванию. Одним из следствий блокирования фермента гомосе-риндегидрогеназы за счет мутации в кодирующем гене hom2 может быть перераспределение метаболических путей в пользу увеличения синтеза лизина.

Компьютерный анализ последовательностей гена asdl у штаммов различных бациллярных видов выявил две несинонимичные нуклеотидные замены, перспективные для идентификации возбудителя сибирской язвы. Ген asdl кодирует фермент аспартатсемиальдегид-дегидрогеназу, функционирующий на начальных этапах биосинтеза L-гомосерина из L-аспарагиновой кислоты. У представителей близкородственных бациллярных ви-

дов замена T на G в позиции 25 от начала гена приводит к смене типичного для всех штаммов B. anthracis кодона TTT на CGT или TGT. Единичная нуклеотидная замена A на G в позиции 208 изменяет кодон GAT, характерный для сибиреязвенного микроба, на один из триплетов -GGT, TGT, ACT или CGT, встречающийся у представителей других бациллярных видов.

Кроме того, все тестируемые штаммы B. anthracis в позиции 712-714 гена metX содержали триплет TAC. У близкородственных видов в позиции 713 гена metX вместо аденина находился тимин, соответственно образовывались триплеты TTC или TTT, кодирующие включение другого аминокислотного остатка в последовательность белковой молекулы. Ген metX обусловливает синтез гомосерин-О-ацетилтрансферазы, катализирующей превращение L-гомосерина в О-ацетилгомосерин.

Аналогично все штаммы B. anthracis в позиции 492-494 гена metH, обусловливающего синтез 5-ме-тилтетрагидрофолатгомосеринметилтрансферазы, содержали триплет CAT. Продукт, кодируемый геном metH, ферментирует химическую реакцию, преобразующую гомоцистеин непосредственно в метионин. У представителей филогенетически родственных видов в позиции 493 наблюдалась замена A на G, что приводило к изменению в аминокислотной последовательности белка. С помощью программы Pfam 24,0 было установлено, что определенные нами замены аминокислот находятся в активных центрах ферментов и могут влиять на их активность.

На следующем этапе в программе Vector NTI были рассчитаны праймеры, фланкирующие вариабельные участки генов asdl, metX и metH. Синтезированные праймеры использовали для постановки ПЦР с ДНК 25 коллекционных штаммов: 12 - B. anthracis, 4 - B. cereus, 4 - B. thuringiensis, 3 - B. megaterium, 1 - B. subtilis, 1 -B. licheniformis. Во всех случаях отмечали образование специфичных продуктов рассчитанного размера. Результаты секвенирования показали, что в соответствующих позициях генов asdl, metX, metH тестированных штаммов присутствуют нуклеотидные замены, совпадающие с данными компьютерного анализа.

Таким образом, на основании данных биоинформационного анализа и сравнительного исследования фрагментов генов, кодирующих ферменты биосинтеза метионина - hom2, asdl, metX и metH, определены области, перспективные для дифференциации штаммов B. anthracis от других представителей рода Bacillus. Выявленные ДНК мишени позволяют осуществлять идентификацию штаммов B. anthracis с помощью ам-плификационных и секвенационных технологий.

Сведения об авторах: Федеральное государственное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, отдел микробиологии, лаборатория прикладной генетики

Микшис Наталья Ивановна - вед. науч. сотр. лаборатории прикладной генетики, д-р мед. наук, e-mail: microbe@san.ru;

Живова Ю. Н. - мл. науч. сотр. лаборатории прикладной генетики, e-mail:microbe@san.ru;

Новикова Л. В. - науч. сотр. лаборатории прикладной генетики, e-mail: microbe@san.ru;

Шарапова Н. А. - мл. науч. сотр. сектора сек-венирования, e-mail: microbe@san.ru;

Попов Ю. А. - зав. лабораторией прикладной генетики, д-р биол. наук, проф., e-mail: microbe@san.ru;

Кутырев В. В. - директор ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб", д-р мед. наук, чл.-корр. РАМН, проф., e-mail: microbe@san.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Микшис Н. И., Болотникова М. Ф., Новикова Л. В. // Молекул. генетика. - 2000. - № 4. - С. 12-15.

2. Онищенко Г. Г. О мерах совершенствования мероприятий по профилактике сибирской язвы в Российской Федерации. Постановление № 41 Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 27.06.2008. - М., 2008.

3. Avashia S., Riggins W., Lindley C. et al. // Clin. Infect. Dis. - 2007. -Vol. 44. - P. 414-416.

4. Bavykin S., Lysov Y., Zakhariev V. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2004.

- Vol. 42, N 8. - P. 3711-3730.

5. Easterday R., Van Ert M., Simonson T. et al. // J. Clin. Microbiol. -2005. - Vol. 43, N 4. - P. 1995-1997.

6. FelderK., Hoelzle K., WittenbrinkM. et al. // Lett. Appl. Microbiol.

- 2009. - Vol. 49, N 3. - P. 324-331.

7. Helgason E., Okstad O., Caugant D. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol. 66. - P. 2627-2630.

8. Hoffmaster A., Ravel J., Rasko D. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

- 2004. - Vol. 101. - P. 8449-8454.

9. KleeS., OzelM., AppelB. et al. // J. Bacteriol. - 2006. - Vol. 188. - P. 5333-5344.

10. Little S., IvinsB. // Microb. Infect. - 1999. - Vol. 1. - P. 131-139.

11. MockM., Fouet A. // Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 55. - P. 647-671.

12. OkinakaR., CloudK., Hampton O. et al. // J. Bacteriol. - 1999. - Vol. 181. - P. 6509-6515.

13. Okinaka R., CloudK., Hampton O. et al. // - 1999. - Vol. 87, N 2. - P. 261-262.

14. Qi Y., Patra G., LiangX. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. -Vol. 67, N 8. - P. 3720-3727.

15. Rasko D., Altherr M., Han C, Ravel J. // FEMS Microbiol. Rev. -

2005. - Vol. 29. - P. 303-329.

16. RaskoD., RosovitzM, OkstadO. et al. // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189. - P. 52-64.

17. Sanger F., Nicklen S, Coulson A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1977. - Vol. 74. - P. 5463-5467.

18. Tourasse N., Helgason E., Okstad O. et al. // J. Appl. Microbiol. -

2006. - Vol. 101. - P. 579-593.

19. YamadaS., OhashiE., AgataN., Venkateswaran K. // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - Vol. 65, N 4. - P. 1483-1490.

Поступила 03.08.11

IDENTIFICATION OF THE DIFFERENCES IN THE GENES RESPONSIBLE FOR METHIONINE

BIOSYNTHESIS IN BACILLUS ANTHRACIS STRAINS AND PHYLOGENY-RELATED SPECIES

N. I. Mikshis, Yu. N. Zhivova, L. V. Novikova, N. A. Sharapova, Yu. A. Popov, and V. V. Kutyrev

Russian Research Anti-Plague Institute Microbe, Saratov, Federal Service for Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Russia

The comparative analysis of the gene sequences encoding the synthesis of enzymes responsible for the intermediary metabolism of methionine in Bacillus anthracis strains and in closely related bacterial species was carried out. Deletion of 42 nucleotides in the hom2 gene, which determines the homoserinedehydrogenase, is detected in all tested Bacillus anthracis strains. In the strains of other bacillar species hom2 gene mutation, which blocks up the tracts of methionine and threonine biosynthesis, was not identified. The single nucleotide polymorphism was determined in asdl, metX, and metH genes. It provides the identification of B. anthracis strains using sequencing technology.

Key words: Bacillus anthracis, bacillar species, metabolism of methionine and threonine, amplification, sequencing