CC BY
339
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОвАНИЯ
gonorrhoeae resistance to beta-lactam antibiotics. Bull. Exp. Biol. Med. 2006; 141(5): 610—5.
14. Morita M., ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin s., Alam M. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation pcR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of vibrio cholerae О1 biotype el Tor. Microbiol. Immunol. 2008; 52(6): 314—7.
15. safa a., Nair G.B., Kong R.Y. evolution of new variants of vibrio cholerae o1. Trends Microbiol. 2009; 18(1): 46—54.
16. safa A., sultana J., cam p.D., Mwansa J.c., Kong R.Y. vibrio chol-
erae o1 Hybrid El Tor strains Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 14(6): 987—8.
17. olsvik o., Wahlberg J., petterson В., uhlen M., popovic T., Wachsmuth K. et al. use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit в in vibrio cholerae o1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31(1): 22—5.
18. cholera, 2014. Wkly. epidemiol. Rec. 2015; 90(40): 517—28.
Поступила 09.06.16 Принята к печати 01.07.16
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2017 УДК 616.932:577.21.083
1Миронова Л.в., 1Адельшин Р.в., 2Бикетов С.Ф., 2Щит И.А., 2Дятлов И.А., 1Балахонов С.в.
ПЕТЛЕВАЯ ИЗОТЕРМИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК: ПРИНЦИП МЕТОДА И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ХОЛЕРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 664047, Иркутск, Россия; 2ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, Оболенск, Россия
Рассмотрены особенности технологии реакции петлевой изотермической амплификации ДНК (Loop mediated isothermal amplification — LAMP), вопросы оптимизации реакции и перспективы ее применения в качестве быстрого высокоспецифичного теста в молекулярной диагностике инфекционных болезней и мониторинге контаминации патогенами объектов окружающей среды. Анализ данных литературы об использовании LAMP в диагностике холеры свидетельствует о высокой диагностической ценности метода. LAMP обеспечивает возможность прямой ускоренной детекции токсин-продуцирующих штаммов Vibrio cholerae в клинических образцах, выявление детерминант холерного вибриона в чистой культуре, пробах из объектов окружающей среды, пищевых продуктах. Исследователями установлено превышение параметров чувствительности и специфичности LAMP в сравнении с ПЦР, что позволяет рассматривать ее в качестве перспективного метода при экспресс-анализе клинического материала от больных с подозрением на холеру, а также в скрининговых исследованиях объектов окружающей среды и определяет необходимость разработки тест-систем, основанных на использовании данной технологии.
Ключевые слова: молекулярная диагностика; экспресс-методы; петлевая изотермическая амплификация ДНК; холера; Vibrio cholerae.
Для цитирования: Миронова Л.В., Адельшин Р.В., Бикетов С.Ф., Щит И.А., Дятлов И.А., Балахонов С.В. Петлевая изотермическая амплификация ДНК: принцип метода и перспективы применения в молекулярной диагностике холеры. Клиническая лабораторная диагностика. 2017;62 (2): 120-124. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-2-120-124 'MironovaL.V., 'AdelshinR.V., 2BiketovS.F., 2ShchitI.A., 2DyatlovI.A., 'BalakhonovS.V
the loop mediated isothermal amplification of dna: principle of method and perspectives of application in molecular diagnostics of cholera: publications review
1The Irkutskii research anti-plague institute of the Rospotrebnadzor, 664047 Irkutsk, Russia
2State Research Center for Applied Microbiology and biotechnology, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow Region, Russia
The article considers characteristics of technology of reaction of loop mediated isothermal amplification ofDNA (LAMP), issues of optimization of reaction and and perspectives of its application as a quick highly-specific test in molecular diagnostics of infectious diseases and monitoring of contamination of environment objects with pathogens. The analysis of publications data concerning application of LAMP in diagnostics of cholera testifies high diagnostic value. The LAMP supports possibility of direct rapid detection of toxin-producing strains of Vibrio cholerae in clinical samples. This technique also provides identification of determinants of cholera vibrio in pure culture, samples from environment objects and food products. The research studies established exceeding of parameters of sensitivity and specificity of LAMP as compared with polymerase chain reaction that permits considering LAMP as a perspective technique for express-analysis of clinical material from patients with suspicion on cholera. The LAMP technique can be also used in screening studies of environment objects. The development of test-systems based on application of this technology is required.
Keywords: molecular diagnostics; express-method; loop mediated isothermal amplification of DNA; cholera; Vibrio cholerae For citation: Mironova L.V., Adelshin R.V., Biketov S.F., Shchit I.A., Dyatlov I.A., Balakhonov S.V The loop isothermal amplification ofDNA: principle of method and perspectives of application in molecular diagnostics of cholera: publications review. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (2): 120-124. (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-2-120-124
Для корреспонденции: Миронова Лилия Валерьевна, канд. мед. наук, зав. лаб. холеры ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора»; e-mail: [email protected]
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
For correspondence: MironovaL.V., candidate of medical sciences, the head of laboratory of cholera. e-mail: [email protected]
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Acknowledgment. The study was .supported by the Federal target program «The National system of chemical and biological safety 2015-2020» (GC № 13-D of25.09.2015)
Received 07.10.2016 Accepted 21.10.2016
Совершенствование лабораторной диагностики инфекционных болезней предусматривает внедрение высокотехнологичных подходов к индикации и идентификации возбудителей [1, 2]. Одна из современных тенденций молекулярной диагностики — разработка и внедрение системы point-of-care — РОС (диагностика у постели больного) и сети соответствующих лабораторий [3]. Преимущества применения диагностических тестов point-of-care заключаются в быстроте и простоте их постановки, доступности, низкой стоимости, отсутствии необходимости использования сложного оборудования, что позволяет максимально приблизить проведение тестирования к объекту исследования и ускорить получение результата [4—8]. Первоначально большинство РОС-тестов основывалось на использовании иммунохроматографиче-ских и агглютинационных тестов. По мнению Р. Fournier и соавт. [3], автоматизация в молекулярной диагностике, в частности процедуры экстракции ДНК и регистрации результатов ПЦР в режиме реального времени, позволяет отнести методы амплификации генетических мишеней патогенов (nucleic acid amplification test — NAT) к категории point-of-care. A. St John и С. Price [6] при анализе технологий point-of-care-тестирования обращают внимание на то, что NAT, в частности ПЦР, несмотря на совершенствование, остаются относительно времязатратными и требуют дорогостоящего приборного оснащения. Этих недостатков нет у одной из ам-плификационных технологий — петлевой изотермической амплификации (LAMP), которая при условии бесприборной детекции результатов, несомненно, является перспективным методом экспресс-диагностики инфекционных болезней и мониторинга контаминации патогенами объектов окружающей среды.
Цель обзора — рассмотрение принципа петлевой изотермической амплификации ДНК, проблем оптимизации и визуализации реакции, анализ результатов и перспектив применения метода в молекулярной диагностике холеры.
Принцип и технология LAMP. В 2000 г. T. Notomi и соавт. [9] сообщили о разработке нового метода амплификации ДНК, обозначенного как изотермическая петлевая амплификация — Loop mediated isothermal amplification (LAMP). Суть его заключается в амплификации целевого участка ДНК при постоянной температуре с использованием Bst-полимеразы из Bacillus stearothermophilus или Bsm-полимеразы из Bacillus smithii, которые способны достраивать новую цепь ДНК и вытеснять другую цепь [8—11]. Высокая специфичность реакции определяется использованием четырех или шести праймеров, комплементарных определенным участкам целевого фрагмента ДНК [8, 9, 11]. Внутренние праймеры FIP и BIP состоят из двух фрагментов: первый — F2 (В2), комплементарный одноименному участку матрицы; второй — F1c (В1с), прикрепленный к 5'-концу F2 (В2) и комплементарный участку F1 (В1) матрицы. Наружные праймеры F3 (В3) комплементарны соответствующим участкам матрицы за пределами праймеров FIP и BIP (рисунок, см. обложку). При температуре реакции в диапазоне 60—65°С фрагмент F2 внутреннего праймера FIP отжигается на матрице (матричная ДНК может быть не денатурирована), активизируется полимераза и начинается элонгация цепи. Далее праймер F3 гибридизуется с областью F3c целевой ДНК и инициирует
синтез ДНК, вытесняющий цепь. В результате освобождается одноцепочечная ДНК, на которой гибридизован праймер FIP, и за счет комплементарности свободного фрагмента F1c с участком F1 матрицы формируется петля. Далее с участием праймеров BIP и В3 происходит образование петли с З'-конца одноцепочечного фрагмента с формированием гантелеобраз-ной структуры [9—12]. Указанная структура служит матрицей для дальнейшей амплификации, в результате которой менее чем за час генерируется до 109 копий целевого фрагмента ДНК [9, 11]. Продукт амплификации представляет собой петлевые структуры ДНК с несколькими инвертированными повторами мишени, собранными во множественные петли (подобно цветной капусте) [12—14].
Для ускорения и повышения чувствительности реакции предложено вносить в амплификационную смесь дополнительно два ответственных за формирование петлевых структур праймера, которые определяют протекание реакции одновременно в двух направлениях [8].
Метод LAMP характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, эффективностью амплификации, простотой постановки, низкой стоимостью [8—10]. Реакция обладает низкой чувствительностью к ингибиторам, которые могут присутствовать в биологических образцах или питательных средах, что позволяет исключить предварительный этап обработки пробы и экстракции ДНК и соответственно ускорить получение результата исследования [8, 15].
Учитывая тот факт, что в LAMP используется сложный набор праймеров, важным условием эффективности метода является подбор последовательностей олигонуклеотидов и концентрации каждого из них в амплификационной смеси. Основные рекомендации по подбору соотношения концентраций праймеров для LAMP приведены в [9], в качестве оптимального рассматривается соотношение FIP(BIP): F1(B1) от 4:1 до 8:1.
Визуализация LAMP. В результате реакции происходит экспоненциальное накопление продукта амплификации и пирофосфата. Поскольку в состав реакционной смеси входит сульфат магния, образуется нерастворимый пирофосфат магния, что позволяет визуализировать результаты по появлению мутности [9, 16].
Альтернативным методом детекции результатов амплификации по сопутствующему изменению концентрации магния является использование металл-чувствительных индикаторов, изменяющих цвет от темно-желтого к желтому (кальцеин) [12], от темно-синего к синему (гидроксинафтол синий) [17] или от темно-синего к светло-синему (малахитовый зеленый). Изменение цвета кальцеина и гидрокси-нафтола синего трудно различить невооруженным глазом, а малахитовый зеленый меняет цвет от темно-синего к светло-синему в отрицательных реакциях [18, 19]. Эти индикаторы требуют продолжительного инкубирования (обычно 60 мин) и демонстрируют среднюю чувствительность (>100—1000 копий ДНК-мишени). Амплифицированный продукт в LAMP выявляют невооруженным глазом по изменению цвета раствора после добавления SYBR Green или других интеркали-рующих красителей, таких как бромистый этидий, PicoGreen [20, 21], пропидиум йодид [22]. С использованием интерка-ляторов можно детектировать продукт в режиме реального
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОвАНИЯ
времени [23] и, следовательно, LAMP может быть количественным методом [17].
Поскольку помимо пирофосфата при вставке дезоксину-клеозидтрифосфата во вновь синтезируемую цепь образуются ионы водорода, предприняты попытки использования технологии полупроводниковых рН-сенсоров, применяемой при секвенировании на платформах Ion Torrent, для контроля амплификации ДНК в LAMP и ПЦР [24—27].
Еще одним методом детекции результатов петлевой ПЦР в реальном времени является биолюминесценция в реальном времени (bioluminescence real time assay — BART), основанная на работе пирофосфатазы [28].
Проблемы оптимизации LAMP. Подходы к выбору наилучших условий проведения ПЦР хорошо стандартизованы [29], в то время как рекомендации относительно оптимизации изотермических реакций амплификации подробно не разработаны [30]. Существует ряд факторов, влияющих на скорость и аналитическую чувствительность изотермических реакций амплификации. В частности, влияние может оказывать одновременное использование нескольких ферментов (в реакциях NASBA [31], SDA [32], HDA [33], LAMP с обратной транскрипцией при проведении реакции в одной пробирке) [9, 34], большое количество этапов отжига праймеров [35], отсутствие многократных этапов денатурации.
Для уменьшения времени изотермической реакции до 20 мин предложено добавлять в реакцию полиэтиленгликоль (ПЭГ) 8000 или 20 000 [36]. Исходя из того, что использование в LAMP 4—6 праймеров может увеличивать вероятность возникновения димеров и неспецифической амплификации, предложено добавлять в реакцию диметилсульфоксид (DM-SO) при проведении Touchdown LAMP для идентификации Listeria monocytogenes [37].
Оптимизация LAMP осуществляется не только в целях сокращения времени реакции и повышения ее чувствительности. С использованием реакции изотермической амплификации разрабатываются подходы к одновременной индикации и идентификации ряда патогенов в системах микробио-чипов, так называемых lab-on-chip («лаборатория на чипе») [38]. Минимизация тест-систем позволяет сократить расходы на диагностику, а выполнение исследований в закрытых системах биочипов — существенно снизить вероятность контаминации.
LAMP — относительно простой и быстрый диагностический инструмент для ранней диагностики инфекционных болезней, который за счет своих характеристик обеспечивает повышенную эффективность индикации и идентификации патогенов. В настоящее время разработаны диагностические тесты на основе LAMP для детекции ДНК широкого круга бактериальных и вирусных патогенов [39], в том числе и ряда возбудителей особо опасных инфекций.
Применение LAMP в молекулярной диагностике холеры. В соответствии с нормативно-методическими документами лабораторный диагноз холеры основан на выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации по культурально-морфологическим, биохимическим, антигенным, молекулярно-генетическим тестам. Детекция специфических генетических локусов возбудителя холеры с использованием ПЦР применяется как для идентификации чистой культуры (определение эпидемической значимости, принадлежности к виду, биовару, серогруппе), так и для индикации детерминант патогена в исследуемом материале (клинический материал, пробы из объектов окружающей среды) и на этапах бактериологического анализа. Разработан и зарегистрирован ряд ПЦР-тест-систем с детекцией результатов по конечной точке или в режиме реального времени для индикации и идентификации возбудителя холеры. С разработкой новой технологии амплификации нуклеиновых кислот
— LAMP начали проводиться исследования возможности ее применения в лабораторной диагностике холеры.
В 2008 г. W. Yamazaki и соавт. [40] анализировали информативность применения LAMP для выявления токсигенных штаммов холерного вибриона в реакции с набором из шести праймеров, фланкирующих участок гена субъединицы А холерного токсина — ctxA, и детекцией в режиме реального времени. Установлено, что все токсин-продуцирующие V. cholerae давали положительный результат амплификации, тогда как не содержащие ген холерного токсина штаммы и гетерологичные микроорганизмы — отрицательный. Чувствительность при исследовании контаминированных испражнений и взвеси чистой культуры составила 7,8Ч02 КОЕ/г. Время получения визуализируемого результата реакции (от стадии выделения ДНК до учета результата) существенно ниже, чем в стандартной ПЦР, и варьировало в зависимости от объекта исследования: при исследовании чистой культуры время составило 35 мин, контаминиро-ванного клинического образца — 70 мин. Авторы сделали вывод о возможности применения LAMP для прямой ускоренной детекции токсин-продуцирующих штаммов в клинических образцах.
Позднее W. Yamazaki [41], проводя исследования по стандартизации протокола LAMP для детекции токсигенных V. cholerae, представил рекомендации по подготовке образцов чистой культуры холерного вибриона, клинического материала и проб из объектов окружающей среды. Показано, что прогревание взвеси чистой культуры патогена в дистиллированной воде перед постановкой реакции может привести к ложноотрицательным результатам, и, соответственно, рекомендована термическая обработка взвеси раствором NaOH, позволяющая предотвратить такие проблемы за счет инактивации возможных ингибиторов LAMP. Для образцов клинического материала и морепродуктов предлагается щелочная обработка с последующим поэтапным центрифугированием. При исследовании морепродуктов рекомендуется предварительная инкубация в питательном бульоне. Температурный оптимум реакции, предлагаемый авторами, составляет 65°С, продолжительность реакции — 60 мин с добавлением этапа инактивации полимеразы при 80°c 5 мин или при 95°c 2 мин. Отмечается, что при амплификации ДНК из чистой культуры V. cholerae минимальная продолжительность реакции может быть 12—18 мин, при исследовании клинического материала или морепродуктов — менее 1 ч.
Высокая чувствительность и специфичность реакции изотермической амплификации и перспективность ее применения в эпидемиологических исследованиях подтверждена при детекции гена ompW холерного вибриона в чистых культурах патогена, а также искусственно контаминированных образцах испражнений, морской воды, молока [42]. Чувствительность реакции при исследовании чистой культуры оказалась выше в сравнении с нативными образцами и составила 1,6Ч02 КОЕ/ мл. Минимальная концентрация, при которой возбудитель холеры обнаруживался в образцах испражнений и морской воды, составила 1,6Ч03 КОЕ/мл, в молоке — 1,6Ч04 КОЕ/мл.
С. Srisuk и соавт. [43] определяли наличие V. cholerae в образцах на основании детекции этого же гена с использованием набора из пяти праймеров: двух внутренних, двух внешних, одного петлевого. При оптимизации параметров реакции авторами установлено, что продукты реакции более четко визуализировались при температуре амплификации 65°С. Что касается продолжительности реакции, то ампли-коны выявлялись после 60 мин амплификации, однако увеличение времени реакции до 75 мин позволяло повысить интенсивность свечения их в геле при электрофоретическом учете результатов. Чувствительность разработанного авторами варианта LAMP при исследовании чистых культур соста-
вила 2,2Ч03 КОЕ/мл, при исследовании контаминированных образцов клинического материала — 2,2Ч04 КОЕ/мл.
Возможность применения метода LAMP в клинической лабораторной диагностике холеры апробирована при исследовании образцов материала от больных, контактировавших с ними лиц и здоровых волонтеров в период вспышки холеры в Таиланде в 2000—2008 гг. [44]. Предварительная оценка аналитических характеристик реакции показала ее 100% специфичность, чувствительность — 5 fg ДНК (1 копия геномной ДНК) или 0,54 КОЕ на реакцию, что существенно превышало чувствительность ПЦР. Исследование предварительно инкубированных на жидкой питательной среде проб ректальных мазков больных холерой показало, что во всех случаях обнаружения V. cholerae в исследуемых пробах бактериологическим методом (n = 19) в LAMP также получен положительный результат. При детекции в ПЦР гена холерного токсина положительными оказались лишь 11 из 19 образцов. Прямое исследование образцов ректальных мазков без предварительного культивирования показало высокую эффективность LAMP, поскольку во всех случаях обнаружения детерминант токсигенного вибриона в пробе изолированы культуры V. cholerae. В последнем случае обследованию подвергались контактировавшие с больными холерой лица и, соответственно, положительный результат выявлен у бессимптомных вибриононосителей. На основании этого авторы пришли к выводу, что диагностическая ценность метода LAMP для детекции токсигенных V. cholerae существенно превышает таковую у ПЦР и метод может успешно использоваться как в лабораторных, так и в полевых условиях.
На основе LAMP разработаны микрофлюидные полимерные биочипы, предусматривающие количественное определение группы пищевых патогенов, включая V. cholerae, в режиме реального времени. Указанная микрочиповая технология, позволяющая выявлять от 10 до 100 микроорганизмов в 1 мкл менее чем за 20 мин, может использоваться в конструировании недорогих портативных систем скрининга проб on-site (в точке отбора) для оценки безопасности пищевых продуктов и воды [45].
Предложен вариант петлевой изотермической амплификации с колориметрической детекцией результата по конечной точке для обнаружения Salmonella, Shigella, V. cholerae [46]. Добавление в реакционную смесь интеркалирующих красителей позволило повысить чувствительность реакции в сравнении с визуальным учетом без красителей: для Salmonella чувствительность составила 48 КОЕ, Shigella — 9,6 КОЕ, V. Cholerae — 3,3 КОЕ в реакции.
Системы детекции на основе LAMP разработаны для другого клинически значимого микроорганизма рода Vibrio
— Vibrio parahaemolyticus. Показана высокая чувствительность и специфичность реакции при анализе генов основных факторов патогенности парагемолитического вибриона
— прямого (tdh) и связанного (trh) термостабильных гемолизинов [47]. Предложенный авторами вариант реакции демонстрировал большую в сравнении с ПЦР чувствительность и скорость определения патогенности V. parahaemolyticus при 100% специфичности. Чувствительность при исследовании чистой культуры и контаминированных креветок составила 5Ч02 КОЕ/мл (2 КОЕ в реакции), необходимое время амплификации одной колонии агаровой культуры
— 13—22 мин, образца контаминированных морепродуктов — 35 мин. В целом продолжительность исследования с учетом этапа экстракции ДНК составила менее 40 мин для агаровой культуры и 60 мин — для морепродуктов. Высокая чувствительность, скорость, простота постановки реакции позволили авторам рекомендовать LAMP для наблюдения и контроля контаминации морепродуктов патогенным парагемолитическим вибрионом.
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
Этой же группой авторов показана возможность выявления в LAMP гена tdh и двух вариантов гена trh — trhl и trh2 с детекцией результатов в режиме реального времени и визуальным обнаружением преципитата в анализируемых образцах. На основании применения разработанной системы праймеров предложена схема дифференциации вирулентных и авирулентных изолятов V. parahaemolyticus [48].
Заключение. Технология петлевой изотермической амплификации ДНК нашла достаточно широкое применение в молекулярной диагностике холеры и диарейных заболеваний, обусловленных V. parahaemolyticus. Аналитические и диагностические характеристики метода, простота и скорость постановки реакции, минимальные требования к приборному оснащению определяют перспективность разработки основанных на LAMP тестов и внедрения их в клиническую лабораторную диагностику, а также в систему мониторинговых исследований объектов окружающей среды, осуществляемых в рамках эпидемиологического надзора за холерой в РФ.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование проводилось в рамках ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности 2015-2020 гг.» (ГК№ 13-Дот 25.09.2015 г.).
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 3—48 см. REFERENCES)
1. Онищенко Г.Г., Ежлова Е.Б., Дёмина Ю.В., Мельникова А.А. О мерах по совершенствованию эпидемиологического надзора в части индикации возбудителей инфекционных заболеваний. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2013; (2): 4—13.
2. Шарова И.Н., Казакова Е.С., Портенко С.А., Красовская Т.Ю., Осина Н.А., Куклев В.Е. и др. Совершенствование и стандартизация лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; (2): 46—8.
REFERENCES
1. Onishchenko G.G., Ezhlova E.B., Demina Yu.V., Mel'nikova A.A. On measures to improve epidemiological surveillance in the indication of infectious pathogens. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. Aktual'nye voprosy. 2013; (2): 4—13. (in Russian)
2. Sharova I.N., Kazakova E.S., Portenko S.A., Krasovskaya T.Yu., Osina N.A., Kuklev V.E. et al. Improvement and standardization of laboratory diagnostics procedures as concerns particularly dangerous, «emerging», and «reemerging» infectious diseases. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2013; (2): 46—8. (in Russian)
3. Fournier P.E., Drancourt M., Colson P., Rolain J.M., La Scola B., Raoult D. Modern clinical microbiology: new challenges and solutions. Nat. Rev. Microbiol. 2013; 11(8): 574—85.
4. Sharma S., Zapatero-Rodríguez J., Estrela P., O'Kennedy R. Point-of-Care Diagnostics in Low Resource Settings: Present Status and Future Role of Microfluidics. Biosensors (Basel). 2015; 5(3): 577—601.
5. Peeling R.W., Mabey D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin. Microbiol. Infect. 2010; 16(8): 1062—9.
6. St John A., Price C.P. Existing and Emerging Technologies for Point-of-Care Testing. Clin. Biochem. Rev. 2014; 35(3): 155—67.
7. Drain P.K., Hyle E.P., Noubary F., Freedberg K.A., Wilson D., Bishai W. et al. Diagnostic point-of-care tests in resource-limited settings. Lancet Infect. Dis. 2014; 14(3): 239—49.
8. Mori Y., Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J. Infect. Chemother. 2009; 15(2): 62—9.
9. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12): E63.
10. Parida M., Sannarangaiah S., Dash P.K., Rao P.V., Morita K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev. Med Virol. 2008; 18(6): 407—21.
11. Yan L., Zhou J., Zheng Y., Gamson A.S., Roembke B.T., Nakayama S. et al. Isothermal amplified detection of DNA and RNA. Mol. Bio-syst. 2014; 10(5): 970—1003.
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОвАНИЯ
12. Tomita N., Mori Y., Kanda H., Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 2008; 3(5): 877—82.
13. Gill P., Ghaemi A. Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008; 27(3): 224—43.
14. Buchan B.W., Ledeboer N.A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Rev. 2014; 27(4): 783—822.
15. Kaneko H., Kawana T., Fukushima E., Suzutani T. Tolerance of loopmediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J. Biochem. Biophys. Methods. 2007; 70(3): 499—501.
16. Nagamine K., Hase T., Notomi T. Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers. Mol. Cell. Probes. 2002; 16(3): 223—9.
17. Goto M., Honda E., Ogura A., Nomoto A., Hanaki K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009; 46(3): 167—72.
18. Jothikumar P., Narayanan J., Hill V.R. Visual endpoint detection of Escherichia coli O157:H using isothermal Genome Exponential Amplification Reaction (GEAR) assay and malachite green. J. Microbiol. Methods. 2014; 98: 122—7.
19. Nzelu C.O., Gomez E.A., Caceres A.G., Sakurai T., Martini-Robles L., Uezato H. et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid mass-screening of sand flies for Leish-mania infection. Acta. Trop. 2014; 132: 1—6.
20. Dukes J.P., King D.P., Alexandersen S. Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. Arch. Virol. 2006; 151(6): 1093—106.
21. Curtis K.A., Rudolph D.L., Owen S.M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 2008; 151(2): 264—70.
22. Hill J., Beriwal S., Chandra I., Paul V.K., Kapil A., Singh T. et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of common strains of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(8): 2800—4.
23. Njiru Z.K. Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics. PLOS Negl. Trop. Dis. 2012; 6(6): e1572.
24. Pourmand N., Karhanek M., Persson H.H., Webb C.D., Lee T.H., Zahradnikova A. et al. Direct electrical detection of DNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(17): 6466—70.
25. Purushothaman S., Toumazou C., Ou C. Protons and single nucleotide polymorphism detection: a simple use for the Ion Sensitive Field Effect Transistor. Sens. ActuatorsB. Chem. 2006; 114: 964—8.
26. Rothberg J.M., Hinz W., Rearick T.M., Schultz J., Mileski W., Davey M. et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature. 2011; 475(7356): 348—52.
27. Tanner N.A., Zhang Y., Thomas C.E. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. Biotechniques. 2015; 58(2): 59—68.
28. Kiddle G., Hardinge P., Buttigieg N., Gandelman O., Pereira C., McElgunn C.J. et al. GMO detection using a bioluminescent real time reporter (BART) of loop mediated isothermal amplification (LAMP) suitable for field use. BMC Biotechnology. 2012; 12: 15.
29. Bustin S.A., Nolan T. Chapter 3: Analysis of mRNA Expression by Real-time PCR. In: Saunders N., Lee M., eds. Real-time PCR: Advanced Technologies and Applications. Poole: Horizon Scientific Press and Caister Academic Press; 2013: 51—88.
30. Khorosheva E.M., Karymov M.A., Selck D.A., Ismagilov R.F. Lack of correlation between reaction speed and analytical sensitivity in isothermal amplification reveals the value of digital methods for optimization: validation using digital real-time RT-LAMP. Nucleic Acids Res. 2015; 1: 12.
31. Weusten J.J., Carpay W.M., Oosterlaken T.A., van Zuijlen M.C., van de Wiel P. A. Principles of quantitation of viral loads using nucleic acid
sequence-based amplification in combination with homogeneous detection using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 2002; 30(6): e26.
32. Walker G.T., Fraiser M.S., Schram J.L., Little M.C., Nadeau J.G., Malinowski D.P. Strand displacement amplification: An isothermal, in vitro DNA amplification technique. Nucleic Acids Res. 1992; 20(7): 1691—6.
33. Vincent M., Xu Y., Kong H.M. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004; 5(8): 795—800.
34. Parida M., Posadas G., Inoue S., Hasebe F., Morita K. Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus. J. Clin. Microbiol. 2004; 42(1): 257—63.
35. Kimura Y., de Hoon M.J., Aoki S., Ishizu Y., Kawai Y., Kogo Y. et al. Optimization of turn-back primers in isothermal amplification. Nucleic Acids Res. 2011; 39(9): e59.
36. Nose K., Nagamine K., Tokuda J., Takino J., Hori T. Polyethylene glycol accelerates loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction. Yakugaku Zasshi. 2013; 133(10): 1121—6.
37. Wang D.G., Brewster J.D., Paul M., Tomasula P.M. Two methods for increased specificity and sensitivity in loop-mediated isothermal amplification. Molecules. 2015; 20(4): 6048—59.
38. Asiello P.J., Baeumner A.J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab. Chip. 2011; 11(8): 1420—30.
39. Fu S., Qu G., Guo S., Ma L., Zhang N., Zhang S. et al. Applications of loop-mediated isothermal DNA amplification. Appl. Biochem. Biotechnol. 2011; 163(7): 845—50.
40. Yamazaki W., Seto K., Taguchi M., Ishibashi M., Inoue K. Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loopmediated isothermal amplification. BMC Microbiol. 2008; 8: 94.
41. Yamazaki W. Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using loop-mediated isothermal amplification. Methods Mol Biol. 2011; 739: 13—22.
42. Ke X.M., Chen Y.Y., Gao L.L., DU Z.P., Feng X.M., Liao R.Y. et al. Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Nan. Fang. Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2009; 29(10): 2059—63.
43. Srisuk C., Chaivisuthangkura P., Rukpratanporn S., Longyant S., Sridulyakul P., Sithigorngul P. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW. Lett. Appl. Microbiol. 2010; 50(1): 36—42.
44. Okada K., Chantaroj S., Taniguchi T., Suzuki Y., Roobthaisong A., Puiprom O. et al. A rapid, simple, and sensitive loop-mediated isothermal amplification method to detect toxigenic Vibrio cholerae in rectal swab samples. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2010; 66(2): 135—9.
45. Tourlousse D.M., Ahmad F., Stedtfeld R.D., Seyrig G., Tiedje J.M., Hashsham S.A. A polymer microfluidic chip for quantitative detection of multiple water- and foodborne pathogens using real-time fluorogenic loop-mediated isothermal amplification. Biomed. Microdevices. 2012; 14(4): 769—78.
46. Soli K.W., Kas M., Maure T., Umezaki M., Morita A., Siba P.M. et al. Evaluation of colorimetric detection methods for Shigella, Salmonella, and Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2013; 77(4): 321—3.
47. Yamazaki W., Ishibashi M., Kawahara R., Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008; 8: 163.
48. Yamazaki W., Kumeda Y., Misawa N., Nakaguchi Y., Nishibuchi M. Development of aloop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection ofthe tdh and trh genes of Vibrio parahae-molyticus and related Vibrio species. Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76(3): 820—8.
Поступила 07.10.16 Принята к печати 21.10.16
